仝曉丹 ,王俊 ,冉旭華 ,2,倪宏波 ,聞曉波 ,2
1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;2.海南大學(xué)動物科技學(xué)院海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室,海南 ???570228
牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)又稱牛 1型皰疹病毒(bovine herpesvirus 1,BHV-1),是危害養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一種重要病原體,可導(dǎo)致鼻炎、陰道炎、腸炎、結(jié)膜炎、流產(chǎn)和腦炎等[1],進而繼發(fā)其他病原體感染,加速動物死亡。IBRV急性感染后在三叉神經(jīng)節(jié)形成潛伏感染,受到應(yīng)激因素刺激后,可重新激活并向體外排毒,這給控制和消滅IBRV導(dǎo)致的相關(guān)疾病造成極大困難[2]。目前,一些國家通過撲殺陽性血清牛根除了該病,但耗資巨大,陽性率高的國家主要通過疫苗免疫來防控[3]。常用的疫苗主要有滅活疫苗、弱毒活疫苗、核酸疫苗和基因缺失疫苗。滅活疫苗雖能誘導(dǎo)較好的體液免疫,但免疫期短;弱毒活疫苗存在毒力返強可能。近年,歐洲一些發(fā)達國家多使用基因缺失疫苗用于牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的防治與凈化,但基因缺失技術(shù)不完善,存在毒力返祖的可能性[4]。因此,研發(fā)更安全有效的疫苗在防控IBR中十分重要。由于基因工程亞單位疫苗具有穩(wěn)定性強、安全性高及易制備等優(yōu)勢,已成為疫苗的研究熱點,但其免疫原性較弱,限制了相關(guān)疫苗的研發(fā)進展[5]。與傳統(tǒng)基因工程亞單位疫苗比較,多表位疫苗除可克服MHC類分子限制獲得高效遞呈外[6],還可消除多個全蛋白引起的容量限制[7]。
本研究利用基因工程方法制備含有IBRV已鑒定出的gB、gC和gD抗原表位及破傷風毒素通用T細胞表位P2的嵌合蛋白,并進行純化,檢測其在中國白兔體內(nèi)的免疫原性,為進一步研發(fā)IBRV基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。
1.1 細胞、毒株、質(zhì)粒及菌株 MDBK細胞、IBRV、原核表達載體 pET-28a(+)、感受態(tài) E.coli DH5α 和感受態(tài)E.coli BL21(DE3)均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。
1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶NheⅠ和HindⅢ購自美國Fermentas公司;連接試劑盒購自日本TaKaRa公司;質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司;小鼠gD單克隆抗體由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物醫(yī)學(xué)重點實驗室制備保存;HRP標記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司;Ni-NTA Purification System及Micro BCA Protein Assay Kit購自美國ThermoFisher Scientific公司。
1.3 實驗動物 清潔級中國白兔,雌性,70~75日齡,體重約2 kg,購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,動物合格證號為:SCXK(黑)2017-008。
1.4 IBRV多抗原表位基因串聯(lián)設(shè)計 根據(jù)文獻報道的 gB[8]、gC[9]和 gD[10-11]相關(guān)抗原表位序列及gD[12]B細胞表位,分別以 AAYAAY及GGGGS為linker將抗原表位及破傷風毒素通用T細胞表位P2按不同方式排列組合,應(yīng)用DNASTAR Protean軟件對其抗原性進行分析,選取抗原性參數(shù)較好的組合,并在串聯(lián)基因上設(shè)置酶切位點,委托北京華大基因公司合成,將合成的基因序列命名為P2-gB/gC/gD(GGGGS)及 P2-gB/gC/gD(AAYAAY)。gB、gC和gD的相關(guān)抗原表位及破傷風毒素通用T細胞表位P2氨基酸序列見表1。
表1 P2及IBRV表位氨基酸序列Tab.1 Amino acid sequences of P2 and IBHV epitopes
1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將兩種重組的基因序列和載體pET-28a(+)分別用NheⅠ和HindⅢ雙酶切,回收目的基因片段及載體片段,于16℃連接過夜;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α,37℃培養(yǎng)12 h;挑取單菌落,接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h;按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒進行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,并將鑒定正確的質(zhì)粒送至北京華大基因公司測序。
1.6 重組蛋白的表達 將兩種重組質(zhì)粒及空載體pET-28a(+)分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài) E.coli BL21(DE3),37℃培養(yǎng)12 h;挑取單菌落,接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37℃,200 r/min培養(yǎng)過夜;按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至A600≈ 0.5時,加入IPTG至終濃度1 mmol/L,于37℃誘導(dǎo)4 h;6 000× g離心5 min,收集菌體,PBS洗滌3次,適量PBS重懸,經(jīng)冰浴超聲破碎,12 000×g離心20 min,分別收集上清和沉淀,進行12% SDS-PAGE分析。
1.7 重組蛋白的鑒定 采用Western blot法。沉淀菌體經(jīng)12% SDS-PAGE分離后,轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%脫脂乳于4℃封閉過夜;加入小鼠gD單克隆抗體(1∶1 000稀釋),37℃孵育1 h;PBST洗滌3次,加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋),37℃孵育1 h;PBST洗滌3次,加入DAB顯色液,ddH2O終止顯色。
1.8 重組蛋白的純化 重組菌經(jīng)大量誘導(dǎo)后,收集菌體,PBS洗滌3次,加入含8 mol/L尿素的Dena-t uring Binding Buffer,重懸菌體,置于冰上,超聲破碎后,收集上清。Ni-NTA Purification System純化重組蛋白,產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE和Western blot鑒定。用含10 mmol/L Tris和0.1% Trionx-100的透析液,將純化產(chǎn)物于4℃透析過夜,以去除尿素,使蛋白復(fù)性,經(jīng)Micro BCA Protein Assay Kit進行蛋白定量。
1.9 動物分組及給藥 將重組蛋白用PBS溶液稀釋至 200 μg/mL,按 1 ∶1(V/V)的比例加入 ISA206佐劑,進行充分乳化。取9只中國白兔,隨機分為3組:P2-gB/gC/gD(GGGGS)組、P2-gB/gC/gD(AAYAAY)和佐劑對照組(PBS溶液與ISA206佐劑等比例乳化)。經(jīng)白兔后腿肌肉多點注射,前2組劑量為 100 μg/(mL·只),對照組劑量為 1 mL/只。每隔3周免疫1次,共3次,在免疫前及每次免疫后3周(即初次免疫后21、42和63 d),經(jīng)白兔耳緣靜脈采血,分離血清,-20℃保存。
1.10 血清抗體水平的檢測 采用間接ELISA法。用0.05 mol/L碳酸鹽(pH 9.6)包被緩沖液稀釋濃縮后的 IBRV 至 2 μg/mL,按 100 μL/孔包被 96孔板,4℃過夜;用5%脫脂乳于37℃封閉2 h;加入待檢血清(1∶100稀釋),100 μL/孔,重復(fù) 3孔,同時設(shè)空白對照,37℃作用1 h;加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋),100 μL/孔,37 ℃作用1 h;加入 TMB 顯色液,100 μL/孔,37 ℃顯色 15 min,用酶標儀測定A450值。
1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 7.00軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)采用均值±標準差(±s)表示,組間比較采用Two-way ANOVA方法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 IBRV抗原表位的選擇及串聯(lián)設(shè)計 DNA STAR Protean軟件分析表明,以圖1的方式連接抗原參數(shù)較好,抗原參數(shù)分析結(jié)果見圖2。
圖1 多表位序列串聯(lián)連接及酶切位點設(shè)置模式圖Fig.1 Schematic diagram of construction of multiple-epitope recombinant protein and setting of restriction endonuclease
圖2 多表位串聯(lián)序列抗原性分析結(jié)果Fig.2 Analysis of antigenicity of multiple-epitope tandem sequences
2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 兩種重組質(zhì)粒雙酶切(NheⅠ/HindⅢ)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,均分別可見約1 100 bp的目的片段及約5 200 bp的載體條帶,見圖3。測序結(jié)果表明,目的片段序列與設(shè)計完全一致。
圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切(NheⅠ/HindⅢ)鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant plasmids(NheⅠ/HindⅢ)
2.3 重組蛋白的鑒定 兩種重組質(zhì)粒P2-gB/gC/gD(GGGGS)及 P2-gB/gC/gD(AAYAAY)轉(zhuǎn)染菌分別可見相對分子質(zhì)量約70 000和63 000的目的蛋白條帶,以包涵體形式表達,但條帶大于理論值(約44 000和48 000),見圖4。重組蛋白可與gD單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng),且于相對分子質(zhì)量約70 000和63 000處可見特異性結(jié)合條帶,大于理論值,見圖5。
圖4 重組蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE profile of recombinant chimeric proteins
圖5 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blotting of recombinant chimeric proteins
2.4 純化產(chǎn)物的鑒定 SDS-PAGE及Western blot鑒定結(jié)果與2.3項一致,見圖6。重組蛋白P2-gB/gC/gD(GGGGS)和 P2-gB/gC/gD(AAYAAY)產(chǎn)量分別達12.4和15.3 mg/L。
圖6 純化蛋白的SDS-PAGE(A)及Western blot(B)鑒定Fig.6 SDS-PAGE(A)and Western blot(B)profiles of purified chimeric proteins
2.5 白兔血清中的抗體水平 初次免疫后21、42和63 d,P2-gB/gC/gD(AAYAAY)組白兔血清的抗體水平均顯著高于P2-gB/gC/gD(GGGGS)組(F分別為 63.2、214.2 和 579.2,P 分別為 0.011 3、<0.000 1 和 <0.000 1),見圖 7。
圖7 各組白兔血清的抗體水平Fig.7 Serum antibody levels of rabbits in various groups
本研究通過查閱文獻獲得已鑒定出的gB、gC、gD相關(guān)抗原表位,采用原核表達系統(tǒng)表達多表位串聯(lián)連接的重組嵌合蛋白,并以家兔為動物模型,對其免疫原性進行評價。鑒于基因工程亞單位疫苗免疫原性弱的特點,在多表位序列串聯(lián)的基礎(chǔ)上,前段串聯(lián)一種通用T細胞表位P2,其為破傷風毒素表位,具有促進抗體的分泌,延長抗體持續(xù)期等作用[13-15]。為避免抗原表位間相互干擾形成新的表位,影響免疫原性,本實驗在表位間采用linker進行連接。linker在嵌合蛋白表達中對蛋白的正確折疊、加工和生物活性發(fā)揮重要作用[16]。Linker按功能特性可分為剛性和柔性兩種,柔性linker連接的嵌合蛋白具有良好的親水性和伸展性;剛性linker雖親水性較差,但可使各表位間互無干擾,維持良好的抗原參數(shù)[17],但還需根據(jù)動物免疫效果來確定。因此,為選擇適合該嵌合蛋白的linker,分別設(shè)計構(gòu)建了以GGGGS和AAYAAY兩種linker連接的嵌合蛋白,并將兩種純化蛋白分別與ISA206佐劑乳化后免疫中國白兔,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),AAYAAYlinker連接的嵌合蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平明顯高于GGGGSlinker連接的重組蛋白(P<0.05)。且SDS-PAGE分析表明,兩種不同linker連接重組蛋白的相對分子質(zhì)量均比理論相對分子質(zhì)量偏大,推測其除蛋白自身結(jié)構(gòu)影響外,還有可能與His-Tag標簽有關(guān),His-Tag標簽含有6個連續(xù)的組氨酸,屬于堿性氨基酸,攜帶較強的正電荷,使蛋白在SDS-PAGE中的泳動速率減慢,從而導(dǎo)致蛋白的相對分子質(zhì)量偏大[18]。另外,Western blot鑒定結(jié)果顯示,該蛋白可與gD單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,表明表達的蛋白為P2-gB-gC-gD重組蛋白。
目前,疫苗接種是防控IBR的最有效途徑,國外多采用基因缺失疫苗防控和凈化IBRV,主要包括gE、TK和US2相關(guān)基因缺失疫苗[19-21]。但該類疫苗在懷孕母牛和犢牛的預(yù)防免疫上存在風險[22]。國內(nèi)尚無商品化的基因缺失疫苗,均處于實驗研究階段[20,23],其中 IBRV-BVDV 二價滅活疫苗的安全性和免疫效果還需進一步評估。與傳統(tǒng)疫苗比較,基因工程亞單位疫苗由于具有安全性高和易制備等優(yōu)勢成為研究熱點[24],如侯亞蘭等[25]將 IBRV gD 與BVDV E2抗原表位進行連接,表達的重組嵌合蛋白具有良好的免疫原性。本研究表達的BHV-1重組多表位嵌合蛋白具有較好的安全性,但目前僅于家兔體內(nèi)進行了初步免疫學(xué)評價,今后將在犢牛、青年牛及懷孕母牛體內(nèi)進行安全性和免疫效力的評價。