仝曉丹 ，王俊 ，冉旭華 ，2，倪宏波 ，聞曉波 ，2

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228

牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）又稱牛 1型皰疹病毒（bovine herpesvirus 1，BHV-1），是危害養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一種重要病原體，可導(dǎo)致鼻炎、陰道炎、腸炎、結(jié)膜炎、流產(chǎn)和腦炎等［1］，進(jìn)而繼發(fā)其他病原體感染，加速動(dòng)物死亡。IBRV急性感染后在三叉神經(jīng)節(jié)形成潛伏感染，受到應(yīng)激因素刺激后，可重新激活并向體外排毒，這給控制和消滅IBRV導(dǎo)致的相關(guān)疾病造成極大困難［2］。目前，一些國(guó)家通過(guò)撲殺陽(yáng)性血清牛根除了該病，但耗資巨大，陽(yáng)性率高的國(guó)家主要通過(guò)疫苗免疫來(lái)防控［3］。常用的疫苗主要有滅活疫苗、弱毒活疫苗、核酸疫苗和基因缺失疫苗。滅活疫苗雖能誘導(dǎo)較好的體液免疫，但免疫期短；弱毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)可能。近年，歐洲一些發(fā)達(dá)國(guó)家多使用基因缺失疫苗用于牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）的防治與凈化，但基因缺失技術(shù)不完善，存在毒力返祖的可能性［4］。因此，研發(fā)更安全有效的疫苗在防控IBR中十分重要。由于基因工程亞單位疫苗具有穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性高及易制備等優(yōu)勢(shì)，已成為疫苗的研究熱點(diǎn)，但其免疫原性較弱，限制了相關(guān)疫苗的研發(fā)進(jìn)展［5］。與傳統(tǒng)基因工程亞單位疫苗比較，多表位疫苗除可克服MHC類分子限制獲得高效遞呈外［6］，還可消除多個(gè)全蛋白引起的容量限制［7］。

本研究利用基因工程方法制備含有IBRV已鑒定出的gB、gC和gD抗原表位及破傷風(fēng)毒素通用T細(xì)胞表位P2的嵌合蛋白，并進(jìn)行純化，檢測(cè)其在中國(guó)白兔體內(nèi)的免疫原性，為進(jìn)一步研發(fā)IBRV基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株、質(zhì)粒及菌株 MDBK細(xì)胞、IBRV、原核表達(dá)載體 pET-28a（+）、感受態(tài) E.coli DH5α 和感受態(tài)E.coli BL21（DE3）均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶NheⅠ和HindⅢ購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；連接試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；小鼠gD單克隆抗體由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Ni-NTA Purification System及Micro BCA Protein Assay Kit購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)中國(guó)白兔，雌性，70～75日齡，體重約2 kg，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK（黑）2017-008。

1.4 IBRV多抗原表位基因串聯(lián)設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的 gB［8］、gC［9］和 gD［10-11］相關(guān)抗原表位序列及gD［12］B細(xì)胞表位，分別以 AAYAAY及GGGGS為linker將抗原表位及破傷風(fēng)毒素通用T細(xì)胞表位P2按不同方式排列組合，應(yīng)用DNASTAR Protean軟件對(duì)其抗原性進(jìn)行分析，選取抗原性參數(shù)較好的組合，并在串聯(lián)基因上設(shè)置酶切位點(diǎn)，委托北京華大基因公司合成，將合成的基因序列命名為P2-gB／gC／gD（GGGGS）及 P2-gB／gC／gD（AAYAAY）。gB、gC和gD的相關(guān)抗原表位及破傷風(fēng)毒素通用T細(xì)胞表位P2氨基酸序列見(jiàn)表1。

表1 P2及IBRV表位氨基酸序列Tab.1 Amino acid sequences of P2 and IBHV epitopes

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將兩種重組的基因序列和載體pET-28a（+）分別用NheⅠ和HindⅢ雙酶切，回收目的基因片段及載體片段，于16℃連接過(guò)夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α，37℃培養(yǎng)12 h；挑取單菌落，接種至含50 μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)6 h；按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至3 mL含50 μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，并將鑒定正確的質(zhì)粒送至北京華大基因公司測(cè)序。

1.6 重組蛋白的表達(dá) 將兩種重組質(zhì)粒及空載體pET-28a（+）分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài) E.coli BL21（DE3），37℃培養(yǎng)12 h；挑取單菌落，接種至含50 μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃，200 r／min培養(yǎng)過(guò)夜；按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至3 mL含50 μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至A600≈ 0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度1 mmol／L，于37℃誘導(dǎo)4 h；6 000× g離心5 min，收集菌體，PBS洗滌3次，適量PBS重懸，經(jīng)冰浴超聲破碎，12 000×g離心20 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.7 重組蛋白的鑒定 采用Western blot法。沉淀菌體經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂乳于4℃封閉過(guò)夜；加入小鼠gD單克隆抗體（1∶1 000稀釋），37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000稀釋），37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入DAB顯色液，ddH2O終止顯色。

1.8 重組蛋白的純化 重組菌經(jīng)大量誘導(dǎo)后，收集菌體，PBS洗滌3次，加入含8 mol／L尿素的Dena-t uring Binding Buffer，重懸菌體，置于冰上，超聲破碎后，收集上清。Ni-NTA Purification System純化重組蛋白，產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE和Western blot鑒定。用含10 mmol／L Tris和0.1% Trionx-100的透析液，將純化產(chǎn)物于4℃透析過(guò)夜，以去除尿素，使蛋白復(fù)性，經(jīng)Micro BCA Protein Assay Kit進(jìn)行蛋白定量。

1.9 動(dòng)物分組及給藥 將重組蛋白用PBS溶液稀釋至 200 μg／mL，按 1 ∶1（V／V）的比例加入 ISA206佐劑，進(jìn)行充分乳化。取9只中國(guó)白兔，隨機(jī)分為3組：P2-gB／gC／gD（GGGGS）組、P2-gB／gC／gD（AAYAAY）和佐劑對(duì)照組（PBS溶液與ISA206佐劑等比例乳化）。經(jīng)白兔后腿肌肉多點(diǎn)注射，前2組劑量為 100 μg／（mL·只），對(duì)照組劑量為 1 mL／只。每隔3周免疫1次，共3次，在免疫前及每次免疫后3周（即初次免疫后21、42和63 d），經(jīng)白兔耳緣靜脈采血，分離血清，-20℃保存。

1.10 血清抗體水平的檢測(cè) 采用間接ELISA法。用0.05 mol／L碳酸鹽（pH 9.6）包被緩沖液稀釋濃縮后的 IBRV 至 2 μg／mL，按 100 μL／孔包被 96孔板，4℃過(guò)夜；用5%脫脂乳于37℃封閉2 h；加入待檢血清（1∶100稀釋），100 μL／孔，重復(fù) 3孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，37℃作用1 h；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），100 μL／孔，37 ℃作用1 h；加入 TMB 顯色液，100 μL／孔，37 ℃顯色 15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 7.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用Two-way ANOVA方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IBRV抗原表位的選擇及串聯(lián)設(shè)計(jì) DNA STAR Protean軟件分析表明，以圖1的方式連接抗原參數(shù)較好，抗原參數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 多表位序列串聯(lián)連接及酶切位點(diǎn)設(shè)置模式圖Fig.1 Schematic diagram of construction of multiple-epitope recombinant protein and setting of restriction endonuclease

圖2 多表位串聯(lián)序列抗原性分析結(jié)果Fig.2 Analysis of antigenicity of multiple-epitope tandem sequences

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 兩種重組質(zhì)粒雙酶切（NheⅠ／HindⅢ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均分別可見(jiàn)約1 100 bp的目的片段及約5 200 bp的載體條帶，見(jiàn)圖3。測(cè)序結(jié)果表明，目的片段序列與設(shè)計(jì)完全一致。

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切（NheⅠ／HindⅢ）鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant plasmids（NheⅠ／HindⅢ）

2.3 重組蛋白的鑒定 兩種重組質(zhì)粒P2-gB／gC／gD（GGGGS）及 P2-gB／gC／gD（AAYAAY）轉(zhuǎn)染菌分別可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約70 000和63 000的目的蛋白條帶，以包涵體形式表達(dá)，但條帶大于理論值（約44 000和48 000），見(jiàn)圖4。重組蛋白可與gD單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，且于相對(duì)分子質(zhì)量約70 000和63 000處可見(jiàn)特異性結(jié)合條帶，大于理論值，見(jiàn)圖5。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE profile of recombinant chimeric proteins

圖5 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blotting of recombinant chimeric proteins

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定 SDS-PAGE及Western blot鑒定結(jié)果與2.3項(xiàng)一致，見(jiàn)圖6。重組蛋白P2-gB／gC／gD（GGGGS）和 P2-gB／gC／gD（AAYAAY）產(chǎn)量分別達(dá)12.4和15.3 mg／L。

圖6 純化蛋白的SDS-PAGE（A）及Western blot（B）鑒定Fig.6 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profiles of purified chimeric proteins

2.5 白兔血清中的抗體水平 初次免疫后21、42和63 d，P2-gB／gC／gD（AAYAAY）組白兔血清的抗體水平均顯著高于P2-gB／gC／gD（GGGGS）組（F分別為 63.2、214.2 和 579.2，P 分別為 0.011 3、<0.000 1 和 <0.000 1），見(jiàn)圖 7。

圖7 各組白兔血清的抗體水平Fig.7 Serum antibody levels of rabbits in various groups

3 討論

本研究通過(guò)查閱文獻(xiàn)獲得已鑒定出的gB、gC、gD相關(guān)抗原表位，采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)多表位串聯(lián)連接的重組嵌合蛋白，并以家兔為動(dòng)物模型，對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)。鑒于基因工程亞單位疫苗免疫原性弱的特點(diǎn)，在多表位序列串聯(lián)的基礎(chǔ)上，前段串聯(lián)一種通用T細(xì)胞表位P2，其為破傷風(fēng)毒素表位，具有促進(jìn)抗體的分泌，延長(zhǎng)抗體持續(xù)期等作用［13-15］。為避免抗原表位間相互干擾形成新的表位，影響免疫原性，本實(shí)驗(yàn)在表位間采用linker進(jìn)行連接。linker在嵌合蛋白表達(dá)中對(duì)蛋白的正確折疊、加工和生物活性發(fā)揮重要作用［16］。Linker按功能特性可分為剛性和柔性兩種，柔性linker連接的嵌合蛋白具有良好的親水性和伸展性；剛性linker雖親水性較差，但可使各表位間互無(wú)干擾，維持良好的抗原參數(shù)［17］，但還需根據(jù)動(dòng)物免疫效果來(lái)確定。因此，為選擇適合該嵌合蛋白的linker，分別設(shè)計(jì)構(gòu)建了以GGGGS和AAYAAY兩種linker連接的嵌合蛋白，并將兩種純化蛋白分別與ISA206佐劑乳化后免疫中國(guó)白兔，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AAYAAYlinker連接的嵌合蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平明顯高于GGGGSlinker連接的重組蛋白（P<0.05）。且SDS-PAGE分析表明，兩種不同linker連接重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量均比理論相對(duì)分子質(zhì)量偏大，推測(cè)其除蛋白自身結(jié)構(gòu)影響外，還有可能與His-Tag標(biāo)簽有關(guān)，His-Tag標(biāo)簽含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸，屬于堿性氨基酸，攜帶較強(qiáng)的正電荷，使蛋白在SDS-PAGE中的泳動(dòng)速率減慢，從而導(dǎo)致蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量偏大［18］。另外，Western blot鑒定結(jié)果顯示，該蛋白可與gD單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明表達(dá)的蛋白為P2-gB-gC-gD重組蛋白。

目前，疫苗接種是防控IBR的最有效途徑，國(guó)外多采用基因缺失疫苗防控和凈化IBRV，主要包括gE、TK和US2相關(guān)基因缺失疫苗［19-21］。但該類疫苗在懷孕母牛和犢牛的預(yù)防免疫上存在風(fēng)險(xiǎn)［22］。國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化的基因缺失疫苗，均處于實(shí)驗(yàn)研究階段［20，23］，其中 IBRV-BVDV 二價(jià)滅活疫苗的安全性和免疫效果還需進(jìn)一步評(píng)估。與傳統(tǒng)疫苗比較，基因工程亞單位疫苗由于具有安全性高和易制備等優(yōu)勢(shì)成為研究熱點(diǎn)［24］，如侯亞蘭等［25］將 IBRV gD 與BVDV E2抗原表位進(jìn)行連接，表達(dá)的重組嵌合蛋白具有良好的免疫原性。本研究表達(dá)的BHV-1重組多表位嵌合蛋白具有較好的安全性，但目前僅于家兔體內(nèi)進(jìn)行了初步免疫學(xué)評(píng)價(jià)，今后將在犢牛、青年牛及懷孕母牛體內(nèi)進(jìn)行安全性和免疫效力的評(píng)價(jià)。