李政蓉 ，金宏麗 ，黃培 ，劉川玉 ，王化磊 ，趙永坤 ，趙健 ，石晶 ，楊松濤 ，夏咸柱

1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122；3.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118；4.長春西諾生物科技有限公司，吉林 長春 130012

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病，臨床癥狀表現(xiàn)為恐水、恐光、狂躁不安等［1］?？袢〔《究筛腥救?、貓、狐貍等溫血動物，人一旦感染，致死率幾乎100%［2-4］。中國《傳染病防治法》將狂犬病定為乙類法定報告?zhèn)魅静。谶^去10年，年平均報告死亡例數(shù)約2 000例。目前雖已有商品化疫苗，但多數(shù)人在被動物咬傷后才會緊急免疫。據(jù)衛(wèi)生部2009年資料統(tǒng)計，我國每年接種1 200萬～1 500萬劑狂犬病疫苗，成為全世界接種狂犬病疫苗最多的國家［5］。據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會疾病預防控制局發(fā)布的《2018年全國法定傳染病疫情概況》，2018年我國狂犬病發(fā)病數(shù)為422例，死亡例數(shù)為410例［6］，狂犬病仍是一個威脅人類健康的重要人獸共患傳染病。因此探索狂犬病病毒獸用疫苗制備工藝，研制安全高效價的獸用疫苗，從源頭控制，以切斷動物散毒途徑，對控制人感染狂犬病病毒事件的發(fā)生具有重大意義。

傳統(tǒng)的獸用滅活疫苗多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝培養(yǎng)，雖然較方瓶培養(yǎng)規(guī)模大，但仍需添加血清，既增加了獸用疫苗的生產(chǎn)成本，又存在血清處理不當造成污染的問題，且不利于下游分離純化。2012年2月，國家農(nóng)業(yè)部文件明確規(guī)定，各省級獸醫(yī)管理部門停止受理轉(zhuǎn)瓶工藝的獸用細胞苗生產(chǎn)線項目的獸藥GMP驗收申請［7］，因此，獸用生物制品生產(chǎn)方式的轉(zhuǎn)變將成為必然。相比于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式，生物反應器懸浮培養(yǎng)具有產(chǎn)量高、細胞密度大、培養(yǎng)條件可控及批間差異小等優(yōu)點，已廣泛應用于疫苗產(chǎn)業(yè)［8-9］。BHK-21細胞是WHO推薦用于獸用疫苗生產(chǎn)的傳代細胞系，同時也可通過生物反應器進行高密度、規(guī)?；囵B(yǎng)，目前已成功應用于狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗和偽狂犬病疫苗等多種獸用疫苗的研究及生產(chǎn)［10-13］。

本研究選用實驗室前期拯救的含有雙G蛋白的狂犬病病毒rCVS-11-dG株［14］作為滅活疫苗株，利用5 L生物反應器懸浮培養(yǎng)的BHK-21細胞批次培養(yǎng)rCVS-11-dG株狂犬病病毒，經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活后加入佐劑制備滅活免疫原，評價其免疫效果，以期為規(guī)?；a(chǎn)安全、高效價獸用狂犬病病毒滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞及病毒 BHK-21懸浮細胞、NA細胞由軍事獸醫(yī)研究所動物病毒學與特種動物疫病學實驗室保存，狂犬病病毒rCVS-11-dG株由該實驗室通過反向遺傳技術(shù)拯救并保存。

1.2 實驗動物 SPF級BALB／c小鼠，雌性，6周齡，35只，體重18～22 g，購自遼寧長生生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001。

1.3 主要試劑及儀器 FITC標記的抗狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體購自瑞士FDI FUJIREBIO公司；BHK-21懸浮細胞無血清培養(yǎng)基、胎牛血清和鋁膠佐劑購自美國Thermo公司；Gel（02）佐劑購自法國Seppic公司；茯苓多糖（PCP-2）佐劑由軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所單俊杰研究員惠贈；5 L生物反應器（工作體積3.5 L）購自美國New Brunswick Scientific公司。

1.4 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

復蘇BHK-21細胞，用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，130 r／min培養(yǎng)至細胞密度達6×106個／mL時，進行稀釋后傳代。

1.4.1 病毒培養(yǎng)溫度 將生長狀態(tài)良好的BHK-21細胞稀釋至3×106個／mL，按照MOI=0.5接毒，分別于30、34和37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h取樣，檢測病毒細胞半數(shù)感染量（tissue culture infective dose，TCID50），每個樣品重復檢測 3 次。

1.4.2 病毒接種MOI將生長狀態(tài)良好的BHK-21細胞稀釋至3×106個／mL，按照MOI分別為0.01、0.05、0.1、0.5和1.0接毒后繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h取樣，檢測TCID50。所取樣品于-80℃凍存。

1.4.3 細胞接種密度 將生長狀態(tài)良好的BHK-21細胞，分別稀釋至2、3和4×106個／mL，按MOI=0.01接毒，每隔12 h取樣，檢測病毒TCID50。所取樣品于-80℃凍存。

1.5 5 L生物反應器培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.5.1 細胞培養(yǎng)階段最適傳代時間 按初始接種細胞密度為1×106個／mL接種至反應器中，培養(yǎng)體積為1.75 L，添加1%胎牛血清、1%雙抗和2%谷氨酰胺，溫度為（37±0.1）℃，pH設(shè)為7.2±0.1，DO控制為20%，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為90 r／min。當細胞密度增加至3×106個／mL時，DO增大至40%，轉(zhuǎn)速增大至120 r／min，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h取樣并在顯微鏡下進行細胞計數(shù)，檢測細胞密度，繪制細胞生長曲線。

1.5.2 病毒培養(yǎng)階段最適收毒時間 參照搖瓶培養(yǎng)病毒時最適條件。生物反應器培養(yǎng)至細胞密度達6×106個／mL時，加入1.75 L細胞培養(yǎng)液，進行稀釋傳代，傳代后細胞密度為3×106個／mL。接種MOI=0.01，pH為7.4±0.1，攪拌速度設(shè)為120 r／min，DO控制為40%，培養(yǎng)溫度為（34±0.1）℃。重復3次。每隔12 h取樣，檢測病毒滴度，繪制病毒一步生長曲線，確定最佳收毒時間。收獲的病毒液1 600×g離心去細胞碎片，上清分裝，于-80℃凍存。

1.6 病毒TCID50檢測 采用直接免疫熒光染色法。取5×104個／孔NA細胞加至96孔板中，病毒經(jīng)DMEM 10倍系列稀釋（10-1～10-8）后，依次加至96孔板中，50 μL／孔，37 ℃，5% CO2溫箱中培育 48 h；棄上清，加入80%冷丙酮固定細胞，-20℃過夜；PBST洗滌細胞3次，每次5 min，加入含伊文思藍和FITC標記的抗狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體的工作液，50 μL／孔，避光，37℃溫箱平放1 h；暗室中用PBST洗滌3次，每次5 min，使用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光，有1個或更多熒光標記的孔記“+”，無綠色斑點的孔記“-”，按照Reed-Muench法計算病毒滴度。

1.7 免疫原制備 將滴度為2×109TCID50／mL的病毒液按1∶2 000的比例加入β-丙內(nèi)酯，4℃搖勻滅活24 h；37℃水解2 h；加至鋪有NA細胞的96孔板中，50 μL／孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2 d；收獲細胞上清，冷丙酮固定細胞，收獲的上清加至鋪有NA細胞的96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)2 d；棄上清，用冷丙酮固定細胞，經(jīng)1.6項方法滅活驗證合格后，分別與Gel（02）、PCP-2和鋁膠3種佐劑混合。鋁膠及Gel（02）佐劑按抗原∶佐劑 =3∶1的比例使用；PCP-2佐劑按200 μg／只小鼠進行配制。

1.8 小鼠分組及免疫 將BALB／c小鼠隨機分為7組，每組5只，分別為單次免疫Gel（02）佐劑組、單次免疫PCP-2佐劑組和單次免疫鋁膠佐劑組、2次免疫Gel（02）佐劑組、2次免疫PCP-2佐劑組、2次免疫鋁膠佐劑組及對照組。免疫組每只小鼠后肢肌肉注射對應的0.1 mL免疫原，對照組免疫0.1 mL PBS。2次免疫組間隔14 d后再次免疫。間隔14 d采血，離心后收集血清，采用熒光抗體病毒中和試驗（fluorescent antibody virus neutralization，F(xiàn)AVN）檢測抗體效價，具體參照《中國藥典》三部（2015版）規(guī)程。WHO狂犬病專家委員會及世界動物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health，OIE）均將血清中和抗體水平≥0.5 IU／mL作為有效抵抗狂犬病病毒感染的指標。

1.9 統(tǒng)計學分析 利用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 8.0.1進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)使用One-way ANOVA方法進行分析，用平均值 ±標準偏差（mean±SD）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒搖瓶培養(yǎng)條件

2.1.1 病毒培養(yǎng)溫度 結(jié)果顯示，在37℃培養(yǎng)條件下，病毒增殖較慢，且在48 h后逐漸下降，108 h后，病毒滴度低于2×104TCID50／mL。34和30℃培養(yǎng)條件下，病毒滴度整體高于37℃條件下，且在60 h病毒滴度可達2×107.75TCID50／mL，高于30℃培養(yǎng)條件下的最高病毒滴度。見圖1。

圖1 搖瓶培養(yǎng)rCVS-11-dG株狂犬病病毒培養(yǎng)溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of temperature for culture of rabies virus rCVS-11-dG strain in shake flask

2.1.2 病毒接種MOI 結(jié)果顯示，當接種MOI為1和0.5時，病毒培養(yǎng)前36 h，病毒滴度隨時間增加而增高，且1MOI培養(yǎng)條件下病毒滴度高于0.05MOI，隨后病毒滴度下降。MOI為0.1、0.05和0.01時，病毒培養(yǎng)前60 h呈上升趨勢，0.01 MOI在培養(yǎng)60 h時病毒滴度可達2×107.75TCID50／mL，高于同時間其他接種MOI的病毒滴度。60 h后病毒滴度逐漸下降，但在培養(yǎng)96 h時，病毒滴度仍可達2×106TCID50／mL，高于同時間其他4組。見圖2。

圖2 rCVS-11-dG株狂犬病病毒搖瓶培養(yǎng)病毒接種MOI的優(yōu)化Fig.2 Optimization of MOI for culture of rabies virus rCVS-11-dG strain in shake flask

2.1.3 細胞接種密度 結(jié)果顯示，細胞接種密度為2×106個／mL時，病毒增殖較其他2組慢，病毒滴度也低于其他2組。細胞接種密度為3×106個／mL時，病毒培養(yǎng)至48 h，最高滴度高于4×106個／mL的接種密度，為2×108.25TCID50／mL。見圖3。

圖3 rCVS-11-dG株狂犬病病毒搖瓶培養(yǎng)細胞接種密度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of initial cell density for culture of rabies virus rCVS-11-dG strain in shake flask

上述結(jié)果表明，rCVS-11-dG株狂犬病病毒在搖瓶中最優(yōu)培養(yǎng)條件為：溫度34℃，接種MOI=0.01，細胞接種密度為3×106個／mL時，最高病毒滴度可達2× 108.25TCID50／mL。

2.2 生物反應器培養(yǎng)病毒

2.2.1 細胞最適傳代時間 結(jié)果顯示，培養(yǎng)60 h時，細胞密度達6×106個／mL可進行細胞稀釋傳代接毒；培養(yǎng)84 h時，細胞密度達到最大，為7×106個／mL，之后細胞密度逐漸降低。見圖4。

圖4 BHK-21細胞在生物反應器中的生長曲線Fig.4 Growth curve of BHK-21 cells in bioreactor

2.2.2 病毒最適收毒時間 結(jié)果顯示，在72～108 h時，病毒增殖進入平臺期，培養(yǎng)108 h病毒滴度達到最高，為2×109TCID50／mL，之后病毒滴度下降，見圖5。確定BHK-21細胞在生物反應器中初始細胞密度為3×106個／mL，接種MOI=0.01時，最適收毒時間為108 h。

圖5 生物反應器中rCVS-11-dG株狂犬病病毒一步生長曲線Fig.5 One-step growth curve of rabies virus rCVS-11-dG strain in bioreactor

2.3 小鼠免疫后抗體水平 不同佐劑組單次免疫小鼠結(jié)果顯示，免疫后14 d，3種佐劑組抗體效價均高于0.5 IU／mL；免疫后28 d，Gel（02）佐劑組顯著高于其他組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；免疫后42 d，Gel（02）佐劑組平均抗體效價為6.54 IU／mL，與其他組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。不同佐劑組2次免疫小鼠結(jié)果顯示，28 d時Gel（02）佐劑組平均抗體效價可達42.14 IU／mL，顯著高于與其他組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；42 d時Gel（02）佐劑組平均抗體效價略有降低，但平均抗體水平仍遠高于0.5 IU／mL。見圖6。綜合以上結(jié)果，單次免疫組和2次免疫組首免后14 d抗體效價均高于0.5 IU／mL，表明首免后14 d即可產(chǎn)生保護效果，2次免疫組28、42 d抗體效價水平均高于單次免疫組，2次免疫效果優(yōu)于單次免疫效果。

圖6 單次（A）和2次（B）免疫后小鼠血清中和抗體效價Fig.6 Serum neutralizing antibody titers of mice immunized with one（A）and two（B）doses of immunogen

3 討論

狂犬病自發(fā)現(xiàn)以來，目前尚無有效的治療藥物，因此，研制安全的獸用狂犬病疫苗，對于從源頭防止人類感染狂犬病病毒至關(guān)重要。

2004年9月，在紐約曼哈頓，美國野生動物保護組織提出了“One World，One Health”，動員國際專家策劃一個與威脅地球生命的疾病作斗爭的方案，即曼哈頓原則。2007年12月，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）、OIE 和 WHO發(fā)起制定了“實現(xiàn)動物-人類-生態(tài)共同健康繁榮的全球戰(zhàn)略框架協(xié)議”。曼哈頓原則的提出說明保護動物就是保護我們自己，認清人類和家畜或者野生動物之間發(fā)展關(guān)系對于全球健康有著重要的作用，因此獸用狂犬病疫苗研發(fā)對于人類健康有推進作用。

隨著生物制品行業(yè)的發(fā)展與需要，生物反應器逐漸代替了轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)模式，由于其自動化程度高、條件均一可控、產(chǎn)量大和成本低等優(yōu)點，在國外已廣泛應用于獸用疫苗領(lǐng)域，如印度的免疫技術(shù)公司用8 000 L生物反應器培養(yǎng)BHK-21細胞生產(chǎn)口蹄疫疫苗，美國的百特生物科技公司用6 000 L生物反應器培養(yǎng)Vero細胞生產(chǎn)流感疫苗。反應器在我國雖然起步較晚，但經(jīng)過幾十年的研究及實踐，也有了飛速發(fā)展，吉林冠界生物有限公司和山東信德科技股份有限公司懸浮培養(yǎng)也已達到上千升規(guī)模，并獲得生產(chǎn)批文。隨著這一技術(shù)的發(fā)展，開展基于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)病毒疫苗的技術(shù)研究及建立相關(guān)技術(shù)平臺，提升我國疫苗行業(yè)的產(chǎn)業(yè)水平和國際競爭力成為必然趨勢。因此，本研究選擇生物反應器作為狂犬病病毒培養(yǎng)工具，以期為生物反應器規(guī)?；a(chǎn)狂犬病病毒及其滅活疫苗的工藝改進奠定基礎(chǔ)。

不可避免的是，生物反應器在使用時，需要考慮剪切力的問題，哺乳動物細胞外無細胞壁的保護作用，如果攪拌轉(zhuǎn)速過大，產(chǎn)生的剪切力較大，可能會造成細胞的大量死亡；如果攪拌速度較小則不能完全使細胞懸浮，與營養(yǎng)物質(zhì)接觸不完全。本研究開始接種細胞后，采用90 r／min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)細胞，隨著細胞密度的增大，再逐漸加大轉(zhuǎn)速至120 r／min。在氧氣供給方式上，采用液體上方供氣的表層通氣方式，可較大程度地避免氣泡對細胞的剪切力。此外，相較于液體下方的深層通氣方式，表層通氣可及時將細胞代謝的廢氣排除，為細胞生長提供可適狀態(tài)。在搖瓶優(yōu)化病毒培養(yǎng)過程中，接種1 MOI條件下病毒培養(yǎng)36 h和接種0.01 MOI條件下病毒培養(yǎng)60 h所達到的最高病毒滴度相同，均為2×107.75TCID50／mL。但接種MOI越大，需要接入的病毒越多，且在隨后的培養(yǎng)過程中，接種0.01 MOI條件下病毒培養(yǎng)96 h時，滴度仍可達到2×106TCID50／mL，高于0.1 MOI條件下病毒培養(yǎng)96 h時的病毒滴度，因此，選用接種0.01 MOI的培養(yǎng)條件。生物反應器培養(yǎng)病毒過程中，開始接毒后，隨著細胞的增殖，病毒滴度也逐漸升高，之后進入平臺期又增至最高，此過程中可能是由于病毒二次感染細胞所致，隨后細胞大量死亡，病毒滴度下降。生物反應器由于可調(diào)控培養(yǎng)參數(shù)，使細胞在較適宜的環(huán)境中生長，因此培養(yǎng)時間也會延長，病毒培養(yǎng)108h時，病毒滴度最高可達2×109TCID50／mL，高于搖瓶培養(yǎng)時的病毒滴度。病毒滅活后加入3種佐劑制備成免疫原免疫小鼠，單次免疫和2次免疫后14 d抗體效價均高于0.5 IU／mL，證明利用懸浮培養(yǎng)的rCVS-11-dG株狂犬病病毒制備的免疫原仍可具有很好的保護作用。

綜上所述，經(jīng)實驗優(yōu)化，初步確定了BHK-21細胞從搖瓶到生物反應器的懸浮培養(yǎng)和放大的工藝，通過其培養(yǎng)的狂犬病病毒具有較高的病毒滴度，為后期規(guī)?；a(chǎn)狂犬病病毒滅活疫苗的工藝改進奠定了基礎(chǔ)。