邢倩倩

（1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436；2.江南大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122）

干酪是牛乳經(jīng)凝乳并排出部分乳清而制成的新鮮或發(fā)酵成熟的產(chǎn)品，包括天然干酪和再制干酪兩大類。干酪制備方法為：首先在凝乳酶或其他適當(dāng)?shù)哪閯┳饔孟?，使乳? 種或幾種原料的蛋白質(zhì)凝固或部分凝固，排出凝塊中的部分乳清；然后通過乳和（或）乳制品中蛋白質(zhì)的凝固過程得到成品[1]。再制干酪起源于20世紀(jì)初期，通過使用1 種或2 種不同成熟度的天然干酪為主要原料，經(jīng)切碎后添加乳化劑、穩(wěn)定劑，融化制成。與天然干酪相比，再制干酪具有更高可融性、更長(zhǎng)保質(zhì)期及更低的貯藏條件要求等優(yōu)勢(shì)[2-3]。

煉乳主要包括淡煉乳、加糖煉乳和調(diào)制煉乳三大類，是以生乳或乳制品為原料，添加或不添加食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，經(jīng)加工制成的黏稠狀產(chǎn)品。煉乳便于貯藏，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。煉乳生產(chǎn)工藝包括預(yù)熱消毒、加糖、濃縮、冷卻、加穩(wěn)定劑、殺菌、密封[4-5]。

綜上所述，干酪和煉乳均是以牛乳為主要原料，通過添加一些常用輔料，結(jié)合不同工藝所制得。添加不同輔料的牛乳熱加工過程中，隨著熱處理溫度的升高，乳清蛋白變性和凝集、乳糖異構(gòu)化和降解、美拉德反應(yīng)等理化反應(yīng)會(huì)依次發(fā)生，會(huì)導(dǎo)致其中活性成分（如堿性磷酸酶和乳鐵蛋白等）減少及化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物（如乳果糖、糠氨酸和糠醛等）增加[6-12]。

美拉德反應(yīng)又稱“非酶褐變反應(yīng)”，是在熱（尤其是高溫）加工富含還原糖食物過程中發(fā)生的一種反應(yīng)[13-17]。美拉德反應(yīng)在低溫干燥和低溫高濕的食品體系中反應(yīng)速率緩慢，在高于35 ℃的中等濕度條件下，美拉德反應(yīng)成為主要反應(yīng)[18]。在乳制品熱加工過程中，美拉德反應(yīng)降低了鍵合到乳糖上的賴氨酸的可用性，進(jìn)而導(dǎo)致了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低[19-20]。糠醛為美拉德反應(yīng)中間階段色素形成過程的產(chǎn)物。乳制品熱加工過程中產(chǎn)生的糠醛類物質(zhì)包含羥甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮和甲基糠醛，結(jié)構(gòu)如圖1所示[21]。

圖 1 乳制品中4 種糠醛類化合物結(jié)構(gòu)式[21]Fig. 1 Chemical structure of four furfural compounds in dairy products[21]

在糠醛類化合物的藥理研究方面，已有體外研究表明糠醛類物質(zhì)具有遺傳毒性、致突變和致癌等毒性[22-25]。歐盟食品安全委員會(huì)建議每人每天攝入的羥甲基糠醛含量上限為1.6 mg。近些年，在乳制品中的糠醛類化合物研究方面，Xing Qianqian等[26]建立高效液相色譜方法檢測(cè)液態(tài)乳中的糠醛類化合物，曹慶等[27]研究不同貯藏條件下超高溫滅菌咖啡牛乳中糠醛類化合物含量變化。現(xiàn)有的乳制品中糠醛類化合物含量檢測(cè)的研究主要針對(duì)液態(tài)乳制品和乳粉[13,28-29]。

由于干酪和煉乳的配料和加工工藝均會(huì)促進(jìn)糠醛類化合物的生成，針對(duì)再制干酪和煉乳中的糠醛類化合物的研究還很少。本研究針對(duì)干酪和煉乳中糠醛類化合物的提取方法開展研究，在建立合適的提取方法基礎(chǔ)上對(duì)市面上常見品牌干酪和煉乳中的糠醛類化合物進(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)比不同干酪和不同煉乳中糠醛類化合物的含量，并對(duì)干酪、煉乳與常規(guī)液態(tài)乳制品中所含糠醛類化合物含量進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌再制干酪A、某品牌再制干酪B、某品牌干酪C、某品牌干酪D、某品牌再制干酪E、某品牌再制干酪F、某品牌加糖煉乳A、某品牌加糖煉乳B、某品牌加糖煉乳C、某品牌淡煉乳D、巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、低溫酸乳、常溫酸乳和褐變酸乳 上海某超市。

草酸二水合物（純度99.5%～102.5%）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純） 德國(guó)默克股份兩合公司；三氯乙酸（純度≥99.0%） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糠醛類化合物標(biāo)準(zhǔn)品：5-羥甲基糠醛（純度98%）、2-糠醛（純度99.5%）、2-呋喃甲基酮（純度95.5%）和5-甲基糠醛（純度99.6%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002電子天平、AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SK5210HP超聲清洗儀 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；DK-8B電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司；Beckman Avanti J-30I落地式離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司；1200高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Milli-Q超純水儀 默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取干酪，分別選取0.05、0.10、0.50 g 3 種稱樣量，加入12 mL超純水，超聲30 min后振蕩20 min。

稱取煉乳，分別選取0.02、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 g 7 種稱樣量，加入12 mL超純水，超聲30 min后振蕩20 min。

稱取巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、低溫酸乳、常溫酸乳和褐變酸乳15.00 g左右。

后續(xù)統(tǒng)一處理步驟為：加入5 mL當(dāng)日配制0.15 mol/L草酸，100 ℃水浴加熱25 min，冷卻至室溫；加入5 mL 40 g/100 mL三氯乙酸溶液，振蕩10 min后，6 000 r/min離心15 min；取上清液倒入25 mL容量瓶，剩余固體加入5 mL 4 g/100 mL三氯乙酸溶液，振蕩10 min后，6 000 r/min離心15 min；合并上清液，加入4 g/100 mL三氯乙酸溶液定容至刻度。然后量取適量上述樣品溶液，過0.45 μm無機(jī)濾膜，進(jìn)高效液相色譜儀分析。

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3柱（3.0 mm×15 cm，3 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～18.0 min、5%～65%流動(dòng)相B，18.0～20.0 min、65%～95%流動(dòng)相B，20.0～22.0 min、95%流動(dòng)相B，22.0～22.1 min、95%～5%流動(dòng)相B，22.1～30.0 min、5%流動(dòng)相B；流速0.6 mL/min；色譜柱溫度30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；進(jìn)樣盤溫度4 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

結(jié)果計(jì)算及方法學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果參考文獻(xiàn)[26]。

本研究干酪和煉乳樣品中均檢測(cè)到羥甲基糠醛和糠醛2 種糠醛類化合物，均未檢測(cè)到呋喃甲基酮和甲基糠醛，因此本研究主要針對(duì)羥甲基糠醛和糠醛進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪中糠醛類化合物提取方法優(yōu)化

表 1 不同稱樣量前處理后干酪A、B、C、D中糠醛類化合物含量比較Table 1 Furfural compounds contents in cheese A, B, C and Ddetermined after pretreatment with different sample amounts μg/100 g

由表1可知，對(duì)比不同稱樣量所得到的羥甲基糠醛和糠醛含量，0.05 g與0.10 g稱樣量下含量類似，稱樣量少更有利于樣品分散提取，因此選定0.05 g作為干酪前處理的稱樣量[30]。

選取以上4 種干酪作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，開展回收率實(shí)驗(yàn)。選取0.05 g稱樣量，加入12 mL超純水，加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液（其中羥甲基糠醛質(zhì)量濃度為20 μg/mL，糠醛質(zhì)量濃度為1 μg/mL），采用本研究方法測(cè)定，并計(jì)算加標(biāo)回收率。

表 2 干酪A、B、C、D中糠醛類化合物的加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 Recoveries of furfural compounds spiked into cheese A, B, C and D (n= 3)%

由表2可知，加標(biāo)回收率為95%～105%，RSD為0.20%～2.00%，表明該方法的回收率良好，準(zhǔn)確性高，可作為干酪中糠醛類化合物含量測(cè)定方法。

2.2 煉乳中糠醛類化合物提取方法優(yōu)化

表 3 不同稱樣量前處理后煉乳A、B中糠醛類化合物含量比較Table 3 Furfural compounds contents in condensed milk A and B determined after pretreatment with different sample amounts μg/100 g

由表3可知，對(duì)比不同稱樣量所得到的羥甲基糠醛和糠醛含量，0.02 g與0.05 g稱樣量下糠醛類化合物峰面積相近，0.05 g稱樣量下煉乳B中糠醛類化合物含量較高，因此選定0.05 g作為煉乳前處理的稱樣量[30]。

選取以上2 種煉乳作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，開展回收率實(shí)驗(yàn)。選取0.05 g稱樣量，加入12 mL超純水，加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液（其中羥甲基糠醛質(zhì)量濃度為20 μg/mL，糠醛質(zhì)量濃度為1 μg/mL），采用本研究方法測(cè)定，并計(jì)算加標(biāo)回收率。

表 4 煉乳A、B中糠醛類化合物的加標(biāo)回收率（n=3）Table 4 Recoveries of furfural compounds spiked into condensed milk A and B (n= 3)%

由表4可知，加標(biāo)回收率為95%～105%，RSD為0.40%～4.00%，表明該方法的回收率良好，準(zhǔn)確性高，可作為煉乳中糠醛類化合物含量測(cè)定方法。

2.3 干酪和煉乳中糠醛類化合物含量測(cè)定結(jié)果

采用優(yōu)化后的干酪和煉乳中糠醛類化合物提取方法，對(duì)市面上代表性干酪和煉乳中糠醛類化合物含量進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)、糖和脂肪含量均為產(chǎn)品包裝上所列值。由表5可知，選擇6 種干酪進(jìn)行糠醛類化合物含量測(cè)定，均檢測(cè)到羥甲基糠醛和糠醛，未檢測(cè)到呋喃甲基酮和甲基糠醛。6 種干酪中，A、B、E、F為再制干酪，C、D為干酪，4 種再制干酪中的羥甲基糠醛含量范圍為10 000～22 000 μg/100 g，遠(yuǎn)高于2 種干酪中的羥甲基糠醛含量范圍100～400 μg/100 g，4 種再制干酪中糠醛含量范圍為75～180 μg/100 g，高于2 種干酪中的糠醛含量范圍40～70 μg/100 g。由于再制干酪是由干酪添加白砂糖和其他成分，通過加熱和持續(xù)攪拌而制成，熱加工和糖的加入都會(huì)促進(jìn)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，因此4 種再制干酪中的糠醛類化合物含量均明顯高于干酪。選擇4 種煉乳進(jìn)行糠醛類化合物含量測(cè)定，均檢測(cè)到羥甲基糠醛和糠醛，未檢測(cè)到呋喃甲基酮和甲基糠醛。4 種煉乳中，A、B、C為加糖煉乳，含糖量均為60%左右，D為淡煉乳，含糖量為10%。3 種加糖煉乳中羥甲基糠醛含量范圍為45 000～64 000 μg/100 g，遠(yuǎn)高于淡煉乳D中羥甲基糠醛含量392.24 μg/100 g；3 種加糖煉乳中糠醛含量范圍為280～430 μg/100 g，高于淡煉乳D中糠醛含量77.66 μg/100 g。由于加糖煉乳中的糖含量比淡煉乳高50%，含糖量越高，美拉德反應(yīng)速率越快，糠醛類化合物含量越高。

表 5 不同品類干酪和煉乳中糠醛類化合物含量Table 5 Furfural compounds contents in different brands of cheese and condensed milk

2.4 干酪和煉乳與常規(guī)乳制品中糠醛類化合物含量對(duì)比

表 6 干酪和煉乳與液態(tài)乳制品中糠醛類化合物含量比較Table 6 Furfural compounds contents in different brands of cheese,condensed milk and liquid milk products

選擇市面上代表性品牌巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、低溫酸乳、常溫酸乳和褐變酸乳，采用本研究方法對(duì)其中的糠醛類化合物含量進(jìn)行測(cè)定，并與干酪和煉乳中的糠醛類化合物含量進(jìn)行對(duì)比。本方法可檢測(cè)到巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、低溫酸乳、常溫酸乳和褐變酸乳中的羥甲基糠醛和糠醛，未檢測(cè)到呋喃甲基酮和甲基糠醛。

由于蛋白質(zhì)是乳制品最重要的組成部分，因此以羥甲基糠醛和糠醛含量和樣品蛋白質(zhì)含量計(jì)算得出樣品每克蛋白質(zhì)中羥甲基糠醛和糠醛含量。由表6可知，加糖煉乳C和再制干酪E中糠醛類化合物含量較高，常溫酸乳和褐變酸乳次之，煉乳、低溫酸乳、超高溫滅菌乳和干酪中含量較低，巴氏殺菌乳最低。綜上所述，使用蛋白質(zhì)含量歸一化后不同乳制品中的糠醛類化合物含量為加糖煉乳＞再制干酪＞褐變酸乳＞常溫酸乳＞煉乳＞低溫酸乳＞超高溫滅菌乳＞干酪＞巴氏殺菌乳。

3 結(jié) 論

針對(duì)干酪和煉乳中的糠醛類化合物提取方式展開研究，稱取0.05 g樣品加12 mL超純水超聲30 min，該處理方式下加標(biāo)回收率均可達(dá)到95%以上。通過優(yōu)化提取方法結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)市面上代表品牌干酪和煉乳中糠醛類化合物含量。結(jié)果表明：再制干酪A、B、E、F中的羥甲基糠醛、糠醛含量遠(yuǎn)高于干酪C、D，4 種再制干酪A、B、E、F中的糠醛含量高于干酪C、D；3 種加糖煉乳A、B、C中的羥甲基糠醛含量遠(yuǎn)高于淡煉乳D，3 種加糖煉乳A、B、C中的糠醛含量高于淡煉乳D。以上結(jié)果表明，干酪和煉乳中的糠醛類化合物與其相應(yīng)的熱處理過程和糖含量密切相關(guān)，可通過糠醛類化合物含量區(qū)別干酪和再制干酪，區(qū)別加糖煉乳和淡煉乳。最后對(duì)干酪、煉乳與液態(tài)乳制品中每克蛋白質(zhì)所含糠醛類化合物含量進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，加糖煉乳＞再制干酪＞褐變酸乳＞常溫酸乳＞煉乳＞低溫酸乳＞超高溫滅菌乳＞干酪＞巴氏殺菌乳。