趙烜影，劉振民，雍靖怡，穆海菠，李 楠*

（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

牛乳是犢牛最重要的食物，也是人類補(bǔ)充蛋白質(zhì)和微量元素的常見來源。牛乳中有2大類蛋白質(zhì)：乳清蛋白和酪蛋白（casein，CN），乳清蛋白由β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）、免疫球蛋白、糖肽、牛血清白蛋白和次要蛋白，如乳過氧化物酶、溶菌酶和乳鐵蛋白組成[1]；CN約占牛乳蛋白的76%～86%，是由乳腺上皮細(xì)胞合成的一種含有大量鈣和磷的蛋白，以膠束形式存在于牛乳中。酪蛋白含有人體所必需的8 種氨基酸。牛乳含有4 種酪蛋白：αs1-CN（CSN1S1，占總酪蛋白的39%～46%）、αs2-CN（CSN1S2，占總酪蛋白的8%～11%）、β-CN（CSN2，占總酪蛋白的25%～35%）和κ-CN（CSN3，占總酪蛋白的8%～15%）[2]。這4 種酪蛋白通過磷酸化、糖基化和水解會(huì)產(chǎn)生一部分新的酪蛋白，如αs-CN通過磷酸化、κ-CN通過糖基化以及β-CN經(jīng)過水解，會(huì)生成γ-酪蛋白和多肽等[3]。酪蛋白多態(tài)性被認(rèn)為會(huì)影響乳產(chǎn)量、乳的理化特性和營養(yǎng)成分、乳制品加工特性以及人類的營養(yǎng)而得到學(xué)者們的重視。

1 酪蛋白基因多態(tài)性

超過95%反芻動(dòng)物乳中的酪蛋白都是通過6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼形成的，在6號(hào)染色體上4 個(gè)酪蛋白基因組成了一個(gè)250 kb的片段，如圖1所示。而水牛乳的4 種酪蛋白則同樣由4 個(gè)在水牛7號(hào)染色體上呈簇狀分布的酪蛋白基因編碼[5]。Aschaffernburg等[6]以β-Lg為對(duì)象，找出了2 種基因型，發(fā)現(xiàn)了乳蛋白的基因多態(tài)性。越來越多的學(xué)者開始研究乳蛋白基因多態(tài)性，乳蛋白基因多態(tài)性在不同牛種之間存在明顯差異，為了適應(yīng)當(dāng)?shù)仫曈龡l件而雜交培育出的本地特色奶牛則進(jìn)一步豐富了牛乳酪蛋白的基因多態(tài)性。

圖 1 主要乳蛋白編碼轉(zhuǎn)錄單位的結(jié)構(gòu)組織[4]Fig. 1 Structural organization of major milk protein coding transcription units[4]

在眾多研究中發(fā)現(xiàn)會(huì)出現(xiàn)同一種等位基因在不同物種中命名不同的情況，這可能與檢測(cè)技術(shù)不同相關(guān)。盡管在DNA水平上的鑒定可以發(fā)現(xiàn)很多單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)，但是這些突變位點(diǎn)可能是沒有更改氨基酸序列的同義突變位點(diǎn)，進(jìn)而在蛋白質(zhì)水平上無法檢測(cè)出新的蛋白質(zhì)亞型。Farrell等[1]提出的對(duì)普通牛、瘤牛、牦牛、爪哇野牛乳蛋白基因型命名法更加適用于常見的乳蛋白等位基因。目前已被報(bào)道的牛乳蛋白基因有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 10 種CSN1S1等位基因；A、B、C、D、E 5 種CSN1S2等位基因；A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G、H1、H2、I、J、K、L 15 種CSN2等位基因和A、B、B2、C、D、E、F1、F2、G1、G2、H、I、J 13 種CSN3等位基因[7-9]。

1.1 α-CN基因多態(tài)性

αS1-CN由214 個(gè)氨基酸組成的肽鏈和1 個(gè)含有15 個(gè)氨基酸的前導(dǎo)鏈組成[10]。編碼αS1-CN的CSN1S1基因全長17 508 bp，有18 個(gè)內(nèi)含子及19 個(gè)外顯子[11]。αS1-CN在磷酸鈣的運(yùn)輸、酪蛋白膠束的形成以及酪蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳遞到高爾基體中起到關(guān)鍵作用。CSN1S1基因多態(tài)性由于與牛乳的營養(yǎng)價(jià)值和加工特性相關(guān)而得到廣泛關(guān)注[12]。CSN1S1的B等位基因最為常見；在DNA序列上的26 139 bp處由C突變?yōu)門的A等位基因在埃及、意大利等地水牛中被多次報(bào)導(dǎo)；C等位基因在利木贊牛、瑞士褐牛、弗萊維赫牛等雜交品種中發(fā)生頻率最高（＞10%）[2]。Fan Xinyang等[11]在沼澤水牛中發(fā)現(xiàn)了由c.609T＞G產(chǎn)生的D等位基因。I等位基因被證實(shí)是由c.296A＞T產(chǎn)生[1]。2013年，在吉爾牛和短角牛中發(fā)現(xiàn)了c.543G＞T，并將其命名為J等位基因[9]，至此CSN1S1基因增加為10 種。除B、C等位基因外，其余等位基因僅在少數(shù)品種中出現(xiàn)。

編碼αS2-CN的CSN1S2基因全長18 480 bp，有18 個(gè)外顯子和17 個(gè)內(nèi)含子[13]。CSN1S2基因多態(tài)性被認(rèn)為與泌乳性能有關(guān)。目前已報(bào)道的CSN1S2等位基因共有A、B、C、D、E 5 種，大都集中在第3、第6及第8個(gè)外顯子中。等位基因B、C、D、E均被認(rèn)為是由A等位基因突變而來，A等位基因外顯子3的第17位堿基發(fā)生了C→T的替換，產(chǎn)生了B等位基因；外顯子6的第2位堿基發(fā)生了A→G的替換，產(chǎn)生了C等位基因；外顯子8的第26位堿基發(fā)生了G→T的替換，產(chǎn)生了D等位基因；外顯子3的第13位堿基發(fā)生了C→T的替換，產(chǎn)生了E等位基因[13]。

1.2 β-CN基因多態(tài)性

β-CN是一種疏水性球狀蛋白，由209 個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為25.382 kDa，牛乳中的β-CN以完全磷酸化形式存在[14]。編碼β-CN的CSN2基因全長8.5 kb，由9 個(gè)外顯子和8 個(gè)內(nèi)含子組成[15]。β-CN的基因多態(tài)性被認(rèn)為與Ⅰ型糖尿病、心血管疾病、自閉癥、精神分裂和免疫缺陷等多種疾病相關(guān)[16]。目前已被報(bào)道的CSN2等位基因共有15 種（A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G、H1、H2、I、J、K、L）[17]。CSN2等位基因及其發(fā)生頻率因檢測(cè)品種、樣本量及地域的差異而存在較大差異。意大利北部荷斯坦牛的檢測(cè)結(jié)果顯示，A1發(fā)生頻率為0.371，A2發(fā)生頻率為0.546，而美國對(duì)于荷斯坦牛的檢測(cè)結(jié)果與上述結(jié)果相反，A1的發(fā)生頻率（0.31～0.66）超過了A2（0.24～0.62）[16-17]。但總的來說，在現(xiàn)有研究結(jié)果中，A1和A2等位基因以超過0.4的發(fā)生頻率最為常見[18]。B等位基因的發(fā)生頻率為0.01～0.10[17]。I等位基因發(fā)生頻率在大部分品種中均低于0.03，但在意大利紅白花牛（0.14）和德國荷斯坦-弗里森雜交牛（0.192）中顯示出較高的頻率[19]。有學(xué)者在韓國本地牛類中檢測(cè)到A4等位基因，但尚未發(fā)現(xiàn)其SNP位點(diǎn)，D等位基因只在瘤牛中被發(fā)現(xiàn)，E等位基因只在皮埃蒙特品種中被發(fā)現(xiàn)[4]。A3、C、F、G等位基因較為罕見，發(fā)生頻率均低于0.01[20]。目前尚未有關(guān)于H1和H2等位基因發(fā)生頻率數(shù)據(jù)。

1.3 κ-CN基因多態(tài)性

κ-CN多存在于酪蛋白膠束的表面，對(duì)維持膠束的穩(wěn)定性起到重要作用[21]。κ-CN含有半胱氨酸和蛋氨酸2 種含硫氨基酸，是一種糖基化酪蛋白[1]，由編碼190 個(gè)氨基酸的肽鏈組成，其中21 個(gè)氨基酸形成信號(hào)肽前導(dǎo)鏈，編碼κ-CN的CSN3基因全長573 pb，含有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子，大多數(shù)編碼序列包含在第4個(gè)外顯子中[22]。CSN3基因首次被證實(shí)是在1964年，迄今為止已發(fā)現(xiàn)13 個(gè)等位基因（A、B、B2、C、D、E、F1、F2、G1、G2、H、I和J）及1 個(gè)同義變體（A1）[23]。目前已知的等位基因都應(yīng)該是A等位基因由于氨基酸的缺失或置換等突變引起的，其中A、B等位基因因與牛乳產(chǎn)量及凝乳特性有關(guān)而被研究人員重視[11]。在荷斯坦牛中A等位基因的發(fā)生頻率為0.736，遠(yuǎn)高于B等位基因的0.186，但是在娟姍牛中B等位基因的發(fā)生頻率（0.692）超過了A等位基因（0.308）[9]。A等位基因具有136Thr（ACC）/148Asp（GAT），而B等位基因具有136Ile（ATC）/148Ala（GCT），E等位基因?qū)被?55Ser（AGC）更改為155Gly（GGC）[4]。G等位基因比A、B等位基因少見，僅在德國黑白花牛、荷斯坦-弗里斯蘭牛、捷克弗萊維赫牛、艾爾郡牛和瑞典紅牛等少數(shù)品種中發(fā)現(xiàn)過[24]。

2 基因多態(tài)性檢測(cè)方法

乳蛋白的基因多態(tài)性主要是由氨基酸的缺失或置換、糖基化、磷酸化位點(diǎn)的差異引起的，目前，關(guān)于基因多態(tài)性的檢測(cè)大都是在蛋白水平和DNA水平上進(jìn)行。蛋白水平檢測(cè)常見的方法包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、反相高效液相色譜（reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）、等電聚焦電泳或尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳[25-28]。最近，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜或液相色譜-高分辨率質(zhì)譜等更強(qiáng)大的技術(shù)已被成功地用于蛋白質(zhì)變體的鑒定和定量[29-30]，主要包括等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（allele specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、限制性片段長度多態(tài)性PCR（restriction fragment length polymorphism PCR，RFLP-PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（single strand conformation polymorphism PCR，SSCP-PCR）、創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR（amplification created restriction site PCR，ACRS-PCR）等方法，近年來還出現(xiàn)了TaqMan法及焦磷酸測(cè)序等技術(shù)[31-32]。

2.1 蛋白質(zhì)水平檢測(cè)方法

HPLC法雖然不是最常見的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，但適用于初始階段分離多種蛋白質(zhì)混合物。RP-HPLC法通常采用十八烷基-硅膠固定相和極性強(qiáng)于固定相的低離子強(qiáng)度酸性有機(jī)流動(dòng)相。隨著流動(dòng)相有機(jī)溶劑濃度的改變，蛋白質(zhì)親硅醇基效應(yīng)和疏水性會(huì)影響到蛋白質(zhì)的保留時(shí)間。不同亞型的酪蛋白由于-NH2和-COOH等極性和氫鍵作用較強(qiáng)的基團(tuán)含量及位置的不同，保留時(shí)間不同，而被分離。C8色譜柱屬于短鏈且不具有支鏈的鍵合固定相，其保留性弱于C18，因而更適用于出峰時(shí)間差異較小的酪蛋白亞型之間的測(cè)定。劉亞楠等[33]通過RP-HPLC法成功檢測(cè)到中國水牛4 種酪蛋白的不同亞型，發(fā)現(xiàn)κ-CN出現(xiàn)了3 種不同的峰，即A、B、C 3 種等位基因，αS1-CN、αS2-CN及β-CN各出現(xiàn)了2 個(gè)不同的峰。陳晨等[34]利用RP-HPLC法在雜交水牛的κ-CN中發(fā)現(xiàn)了新的D等位基因。操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、回收率高、可以檢測(cè)出沉默變異體等優(yōu)點(diǎn)使HPLC法成為檢測(cè)酪蛋白多態(tài)性的有效方法。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法是將液相色譜分離后的目標(biāo)蛋白質(zhì)通過電離的方式引入質(zhì)譜，得到蛋白質(zhì)不同亞型特異性肽段的質(zhì)譜圖。將測(cè)定出的單同位素質(zhì)量與已知的蛋白質(zhì)亞型單同位素質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比，來鑒定蛋白質(zhì)的多態(tài)性。Nguyen等[31]通過使用與Q-Exactive質(zhì)譜儀偶聯(lián)的Ultimate 3000 UPLC成功檢測(cè)到越南黑白花荷斯坦F2（HF2）乳樣中β-CN的3 個(gè)亞型，在85 頭HF2乳樣中檢測(cè)到3 個(gè)單同位素質(zhì)量分別為24 008.143 0、23 968.167 0、23 950.226 0 Da的亞型，分別與β-CN亞型中A1、A2和I的理論單同位素質(zhì)量24 008.161 6、23 968.151 6、23 950.191 6 Da匹配。

不同的電泳技術(shù)則是通過蛋白質(zhì)亞型在電泳或等電聚焦過程中遷移率的差異進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)多種乳蛋白進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。Caroli等[27]開發(fā)了一種將等電聚焦電泳后膠片浸泡在三氯乙酸中，將β-CN亞型固定化的定量方法，避免了考馬斯亮藍(lán)染色過程β-CN與β-Lg重疊，該方法不僅成功檢測(cè)出β-CN的A1和A22 種亞型，還能夠?qū)悠分械摩?CN亞型進(jìn)行定量分析。馮慿等[35]建立的毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法可以對(duì)液態(tài)乳和乳粉中β-CN亞型進(jìn)行定性及定量分析，成功檢測(cè)出A1及A22 種亞型。Duarte-Vázquez等[28]通過尿素-聚丙烯酰胺電泳成功檢測(cè)出荷斯坦及娟姍牛β-CN的A1、A22 種亞型。

蛋白質(zhì)水平上的檢測(cè)方法由于能夠更加直觀驗(yàn)證酪蛋白的基因型而在實(shí)際中應(yīng)用更加廣泛。

2.2 DNA水平檢測(cè)方法

焦磷酸測(cè)序作為一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)適用于對(duì)已知短序列的測(cè)序分析，其通過引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）硫酸化酶、熒光素酶和ATP雙磷酸酶4 種酶的協(xié)同作用下，將引物上dNTP的聚合與熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)，檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的[36]?？梢源笸?、低成本、實(shí)時(shí)、快速、直觀地進(jìn)行SNP測(cè)定。任大喜等[37]采用焦磷酸測(cè)序法分析中國荷斯坦牛、娟姍牛和水牛的乳蛋白基因多態(tài)性，并找出了水牛κ-CN的特異性多態(tài)位點(diǎn)。

AS-PCR方法的原理是將突變堿基設(shè)計(jì)在引物3’末端，在PCR中若突變堿基與模板互補(bǔ)，獲得特異擴(kuò)增條帶，則表明被測(cè)基因含有該種突變[38]。Gholami等[39]使用AS-PCR技術(shù)擴(kuò)增了1 個(gè)854 bp的片段，成功鑒定出伊朗荷斯坦牛、娟姍牛、當(dāng)?shù)仉s交奶牛β-CN的A1、A2等位基因，并測(cè)定出A1等位基因的發(fā)生頻率為荷斯坦牛0.5、娟姍牛0.51、西斯塔尼牛0.54、塔萊西牛0.49、馬贊達(dá)拉尼牛0.46。Firouzamandi等[40]同樣利用AS-PCR技術(shù)在荷斯坦Sarabi牛中檢測(cè)到β-CN的A1、A2等位基因。

RFLP-PCR技術(shù)是將PCR擴(kuò)增后的DNA用特異性內(nèi)切酶切分成長短不一的片段，并在凝膠電泳上分辨。因?yàn)椴煌任换虻南拗菩悦盖形稽c(diǎn)分布不同，會(huì)產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。Cinar等[41]利用該方法設(shè)計(jì)正向引物5’-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3’、反向引物5’-GGCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3’，成功測(cè)定了安那托利亞水牛κ-CN的B等位基因。Jawane等[42]使用CASB67R和CASB122L引物擴(kuò)增印度瘤牛β-CN基因外顯子VII的一部分，并用TaqI限制酶對(duì)251 bp的PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行限制性酶切，得到3 種基因型：A1A1（213、38 bp）、A1A2（251、213、38 bp）和A2A2（251 bp）。

SSCP-PCR技術(shù)的基本原理是將PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性形成單鏈DNA，單個(gè)堿基的差異會(huì)在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象，改變泳動(dòng)速率，產(chǎn)生不同的條帶。Chiatti等[43]運(yùn)用此方法成功鑒定出山羊乳αS2-CN的A、B、C、E共4 個(gè)等位基因，并通過等電聚焦在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證，他們認(rèn)為SSCP-PCR技術(shù)相比RFLP-PCR技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)CSN1S2等位基因會(huì)更加快捷、平價(jià)。Hamza等[44]利用SSCP-PCR技術(shù)設(shè)計(jì)正向引物5’-CTAAATCTGGCATAAAAGTA-3’、反向引物5’-AATCACGGACTAAATAA-3’的引物對(duì)，成功檢測(cè)出中國荷斯坦奶牛κ-CN的C、T等位基因。

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，其5’末端攜帶熒光基團(tuán)，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端攜帶猝滅基團(tuán)，如TAMRA、BHQ等。其原理為：用1 對(duì)雙標(biāo)記的TaqMan熒光探針分別針對(duì)雙等位SNP的不同等位基因，只有完全匹配的探針可以擴(kuò)增出其對(duì)應(yīng)的等位基因。若只有VIC熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)表明為等位基因1，若只有FAM熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)表明為等位基因2，當(dāng)VIC與FAM熒光信號(hào)均明顯增強(qiáng)則為等位基因1與2的雜合型。而新型TaqMan-MGB（minor groove binder）探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP）[45]。Kusza等[46]利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)羅馬尼亞本土扎克爾綿羊CSN2基因的A等位基因發(fā)生頻率為0.009 8。

3 酪蛋白基因多態(tài)性的應(yīng)用

3.1 酪蛋白基因多態(tài)性在生產(chǎn)加工中的應(yīng)用

作為奶牛的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，泌乳性能由多個(gè)基因控制，乳蛋白基因則是影響泌乳性能的主要基因，乳蛋白中編碼酪蛋白和β-Lg的基因?qū)δ膛５拿谌樾阅苡绊懽畲?。梁艷等[47]對(duì)智利進(jìn)口的荷斯坦牛酪蛋白多態(tài)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，β-CN多態(tài)性對(duì)日產(chǎn)奶量有極顯著影響，AB亞型個(gè)體的日產(chǎn)奶量極顯著高于AA亞型（P＜0.01）。楊雪瑤等[48]研究寧夏地區(qū)荷斯坦奶牛發(fā)現(xiàn)，含κ-CN的AA基因型奶牛的產(chǎn)奶量顯著高于CA基因型（P＜0.05），極顯著高于CC基因型（P＜0.01），說明κ-CN的A等位基因有利于提高日產(chǎn)奶量。Morkuniene等[49]對(duì)立陶宛牛群κ-CN多態(tài)性進(jìn)行研究同樣發(fā)現(xiàn)，A等位基因有利于提高日產(chǎn)奶量。

除了影響奶牛泌乳性能以外，酪蛋白多態(tài)性對(duì)牛乳營養(yǎng)成分的影響更為顯著。Gurses等[23]研究κ-CN發(fā)現(xiàn)，含AB亞型的荷斯坦牛乳蛋白質(zhì)及乳糖含量顯著高于AA及AE亞型；含A等位基因的娟姍牛乳脂含量顯著低于含B等位基因。也有研究顯示，水牛β-CN的B等位基因與乳蛋白含量成正比，而A等位基因則與乳脂含量成正比[50]。黃改奶牛αs2-CN的A等位基因與乳脂及乳蛋白含量成正相關(guān)[13]。Li Shanshan等[51]研究中國水牛的酪蛋白遺傳多態(tài)性與乳蛋白組成之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)κ-αs1-β復(fù)合基因型中，BB-AB-AA型和AB-AB-AA型分別對(duì)κ-CN和αs2-CN含量有顯著影響。Day等[52]研究酪蛋白多態(tài)性對(duì)乳蛋白膠束大小的影響，發(fā)現(xiàn)κ-CN的AA亞型酪蛋白膠束顯著大于AB及BB亞型，并且小膠束酪蛋白（（151.0±2.2） nm）的糖基化比例更高，即含B等位基因的酪蛋白更容易糖基化；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)小膠束酪蛋白中β-CN出現(xiàn)基因突變的頻率更高。陳晨等[34]研究中國水牛的酪蛋白多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，水牛αs1-β-κ-CN復(fù)合基因?yàn)锳BBB-AB型，κ-CN的C等位基因均與乳蛋白粒度存在顯著相關(guān)性，αs1-CN和κ-CN基因型為A等位基因的蛋白粒度大于基因型為其他等位基因的蛋白。

酪蛋白多態(tài)性對(duì)牛乳加工性能的影響也是學(xué)者們的研究重點(diǎn)。黃麗[53]、李玲[54]等研究水牛αs1-CN對(duì)馬蘇里拉干酪及類蒙特利杰克半硬質(zhì)干酪加工及品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)水牛αs1-CN多態(tài)性對(duì)馬蘇里拉干酪組成影響顯著，αs1-CN為AB亞型的水牛乳制作的馬蘇里拉干酪在脂肪、蛋白質(zhì)含量以及干酪硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性等指標(biāo)方面都優(yōu)于BB亞型；但是αs1-CN為BB亞型的水牛乳制作的類蒙特利杰克半硬質(zhì)干酪在各項(xiàng)指標(biāo)上均顯著優(yōu)于AB亞型。Zicarelli等[55]研究發(fā)現(xiàn)，含有意大利地中海水牛αs1-CN的B等位基因以及κ-CN的F1等位基因的牛乳凝乳效率顯著高于含其他等位基因的牛乳。Nguyen等[56]研究奧克蘭當(dāng)?shù)啬翀?chǎng)奶牛β-CN的A1與A2等位基因?qū)εＨ橹锈}分布、酸凝固、起泡特性及酸乳凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)含有β-CN A2等位基因的牛乳中游離Ca2＋含量顯著高于含A1等位基因的牛乳，泡沫形成能力增強(qiáng)，需要更長的時(shí)間才能凝固；A2A2亞型酸乳的凝膠強(qiáng)度較弱，微觀結(jié)構(gòu)較多孔，表明該凝膠更細(xì)膩，在外部機(jī)械力的作用下容易破裂和變形，因此，在處理和運(yùn)輸A2A2亞型酸乳產(chǎn)品期間可能需要格外小心，然而從健康和營養(yǎng)的角度來看，A2A2亞型酸乳較軟，而較弱和較多孔的凝膠有助于蛋白質(zhì)更快地分解，在胃中酸性條件下更好被消化。在對(duì)中國水牛β-CN基因多態(tài)性的研究過程中發(fā)現(xiàn)，體外消化實(shí)驗(yàn)表明，AB亞型消化最快，其次為AA亞型，BB亞型最難消化[50]。

3.2 酪蛋白基因多態(tài)性對(duì)人體健康的潛在影響

關(guān)于酪蛋白多態(tài)性對(duì)人體健康的影響，學(xué)者們大都聚焦在β-CN的A1與A2等位基因，這可能與β-CN含量及A1和A2等位基因發(fā)生頻率高有關(guān)。β-CN的A1等位基因在人體內(nèi)經(jīng)過胃蛋白酶的消化會(huì)產(chǎn)生一種阿片肽——β-酪啡肽7（β-casomorphin 7，BCM7），其產(chǎn)生機(jī)制見圖2。BCM7被認(rèn)為與Ⅰ型糖尿病、缺血型心臟病、精神分裂、自閉癥、嬰兒猝死綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈性心臟病、孤獨(dú)癥譜系障礙等疾病有關(guān)[16,32,57]。

圖 2 BCM7產(chǎn)生機(jī)制[57]Fig. 2 BCM7 generation mechanism[57]

多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)A1等位基因的攝入量與Ⅰ型糖尿病的發(fā)病率有顯著相關(guān)性；對(duì)BioBreeding（BB）大鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示，A1等位基因有誘發(fā)Ⅰ型糖尿病的作用[58]。關(guān)于誘發(fā)機(jī)制目前存在2 種假說：1）含A1等位基因的β-CN會(huì)刺激T免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)及抗體免疫反應(yīng)，這會(huì)促進(jìn)Ⅰ型糖尿病的發(fā)病；2）類似于BCM-7的阿片類藥物可能會(huì)干擾代謝過程，包括血糖水平的調(diào)節(jié)和胰島素的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致Ⅰ型糖尿病，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了阿片肽類藥物的共同給藥受體拮抗劑納洛酮有效減弱了A1等位基因的作用[58]。

對(duì)食物攝入的不良反應(yīng)具有非常多樣的病因和癥狀，在牛乳中主要表現(xiàn)為乳蛋白過敏和乳糖不耐癥。乳蛋白過敏是最常見的食物過敏癥狀，對(duì)兒童的影響較大，尤其是新生兒。一般認(rèn)為BCM7會(huì)刺激T免疫細(xì)胞，進(jìn)而引起乳蛋白過敏，β-CN的A2等位基因則會(huì)降低致敏乳蛋白的表達(dá)[59]。當(dāng)然，除了β-CN以外，β-Lg與α-La也是乳蛋白過敏的重要過敏原。乳糖不耐癥則是因?yàn)轶w內(nèi)缺乏乳糖酶，乳糖在腸道中分解為乳酸，破壞了腸道酸堿平衡，進(jìn)而引起腹瀉，是一種多發(fā)于亞洲地區(qū)的先天性遺傳疾病，部分人體內(nèi)的乳糖酶活力會(huì)隨著年齡的增加而降低。He Mei等[60]通過臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含A1β-CN牛乳會(huì)降低乳糖酶活性，并增加胃腸道癥狀，而含A2β-CN牛乳可減輕急性乳糜瀉引發(fā)的胃腸道不適癥狀。目前尚未有直接的證據(jù)解釋?duì)?CN的A1等位基因?qū)δc胃影響的機(jī)理。

氧化代謝是維持細(xì)胞生命活動(dòng)的重要功能之一，新陳代謝失調(diào)會(huì)產(chǎn)生許多活性氧和自由基，引起氧化應(yīng)激。過氧化物自由基、羥自由基、超氧自由基和過氧化氫等自由基不僅會(huì)引起蛋白變質(zhì)，還會(huì)損害生物系統(tǒng)。由于蛋白質(zhì)和多肽具有特定的或非特異性的生物學(xué)機(jī)制，如使活性氧失活、清除促氧化的金屬離子、降低氫過氧化物水平以及改變系統(tǒng)的內(nèi)部特性，因此蛋白質(zhì)和多肽具有抗氧化潛力；對(duì)中國水牛酪蛋白多態(tài)性與其抗氧化性的研究發(fā)現(xiàn)，AA亞型β-CN的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力優(yōu)于BB亞型，BB亞型的羥自由基清除能力和還原能力優(yōu)于AA亞型[50]。

4 結(jié) 語

酪蛋白作為牛乳中的重要組成部分，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值。4 種酪蛋白均存在基因多態(tài)性，這些多態(tài)性對(duì)牛乳的組成成分、牛乳品質(zhì)、牛乳的生產(chǎn)加工特性以及乳制品的營養(yǎng)、口感、品質(zhì)具有重要影響。加強(qiáng)對(duì)酪蛋白多態(tài)性的基礎(chǔ)研究可以為保護(hù)牛的基因多態(tài)性、奶牛的定向育種以及精準(zhǔn)設(shè)計(jì)功能性乳制品提供理論基礎(chǔ)，引導(dǎo)中國乳業(yè)向高附加值、高收益多樣化發(fā)展。