蔡世欣，李 敏，侯余勇，王巍杰*，陳方見*

(1.華北理工大學生命科學學院，河北 唐山 063210；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津 300308)

隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，世界石油消耗量急劇增長，能源短缺問題日益突出，生物質能源作為可再生能源逐漸成為世界各國研究的熱點[1]。然而，原料成本高成為制約生物質能源發(fā)展的主要瓶頸，低成本的植物纖維因可作為發(fā)酵底物而受到廣泛關注[2]。纖維素作為一種大分子多糖是目前分布最廣的生物質，為生物質能源的生產提供了大量原材料[3]。我國秸稈類生物質大多被直接燃燒，不但造成資源浪費，還污染環(huán)境。利用秸稈發(fā)酵生產燃料乙醇既能保護環(huán)境，也可充分利用資源，創(chuàng)造經濟價值[4]。鑒于此，作者以蘆葦秸稈為原料，用堿液對其進行預處理以促進秸稈纖維素糖化，再通過釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和產朊假絲酵母(Candidautilis)混合發(fā)酵制備乙醇，在單因素實驗的基礎上，采用Plackett-Burman(PB)實驗、最陡爬坡實驗和響應面實驗對制備工藝進行優(yōu)化。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

蘆葦秸稈，采自華北理工大學曹妃甸校區(qū)周邊。

纖維素酶，和氏璧生物技術有限公司；酵母膏、胰蛋白胨，英國Oxoid公司；所用試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

SLQ6A型粗纖維測定儀；THZ-92A型氣浴恒溫振蕩器；T6型紫外可見分光光度計；HHS-21-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；產朊假絲酵母，鶴壁百惠生物科技有限公司。

基礎培養(yǎng)基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(9.2 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸溶液+10.8 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶液，pH值4.8)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：2.0%蛋白胨、0.1%磷酸二氫鉀、1.0%磷酸氫二鉀、0.1%硫酸鎂、0.1%氯化鈉的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.3 預處理方式的選擇

分別稱取5.0 g粉碎過20目、40目、60目和80目篩的蘆葦秸稈置于錐形瓶中，按料液比1∶10(g∶mL,下同)加入50 mL堿液(NaOH或NaOH∶尿素=3.85∶1)，置于80 ℃水浴鍋中預處理2 h；將預處理過的蘆葦秸稈多次沖洗，烘干；采用粗纖維測定儀測定蘆葦秸稈中纖維素含量，以確定最優(yōu)的預處理方式。

1.4 發(fā)酵方式的選擇

發(fā)酵菌種的選擇：稱取預處理后的蘆葦秸稈5.0 g，按料液比1∶30加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液和10%纖維素酶。將在基礎培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期的釀酒酵母、產朊假絲酵母或混合酵母(1∶1，釀酒酵母和產朊假絲酵母的配比)按10%接種量分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中；于30 ℃、150 r·min-1發(fā)酵70 h；然后采用DNS法[5]測定發(fā)酵液中還原糖含量，采用重鉻酸鉀比色法[6]測定發(fā)酵液中乙醇含量，以確定最優(yōu)發(fā)酵菌種。

混合酵母配比的選擇：將不同配比(1∶1、2∶3、3∶2、4∶1、1∶4)的混合酵母按上述方法分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，測定發(fā)酵液中乙醇含量，以確定混合酵母的最優(yōu)配比。

1.5 蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素實驗

分別考察混合酵母接種量(6%、7%、8%、9%、10%、11%)、纖維素酶用量(6%、8%、10%、12%、14%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)、轉速(120 r·min-1、130 r·min-1、140 r·min-1、150 r·min-1、160 r·min-1)、發(fā)酵時間(24 h、48 h、60 h、72 h、84 h)、發(fā)酵溫度(28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃)對乙醇含量的影響。

1.5.2 響應面實驗

做好鄉(xiāng)鎮(zhèn)基層農業(yè)統(tǒng)計工作任重而道遠，只有結合鄉(xiāng)鎮(zhèn)基層農業(yè)統(tǒng)計工作實際，在提高認識、加強制度建設和管理，以及提高人員隊伍素質等多方面入手，不斷努力改進，才能切實形成整體合力，推動基層農業(yè)統(tǒng)計工作扎實開展、有力開展。

在單因素實驗的基礎上，選取混合酵母接種量、纖維素酶用量、料液比、轉速、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等6個因素的高、低水平(表1)，利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件設計Plackett-Burman(PB) 實驗，篩選出影響最大的3個因素進行最陡爬坡實驗；以最陡爬坡實驗確定的中心點、采用Box-Behnken(BB)設計響應面實驗，優(yōu)化蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的工藝條件。

表1 PB實驗的因素與水平

2 結果與討論

2.1 葡萄糖和乙醇的標準曲線(圖1)

圖1 葡萄糖(a)和乙醇(b)的標準曲線

對圖1曲線進行擬合，得葡萄糖和乙醇的線性回歸方程分別為：y=1.017x-0.0294(R2=0.9948)，y=20.047x-0.1046(R2=0.9988)。表明，葡萄糖含量在0～1.2 g·L-1范圍內、乙醇含量在0～7 g·L-1范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2 預處理方式對纖維素含量的影響(圖2)

從圖2可以看出，對于不同目數(shù)的蘆葦秸稈，采用添加尿素的混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理后的纖維素含量均明顯高于采用單一堿液(NaOH)的；其中60目蘆葦秸稈用混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理后，纖維素含量達到60.7%。因此，確定采用混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)對60目蘆葦秸稈進行預處理。

圖2 預處理方式對纖維素含量的影響

2.3 單一酵母發(fā)酵和混合酵母發(fā)酵效果對比(圖3)

圖3 單一酵母發(fā)酵和混合酵母發(fā)酵效果對比

從圖3可以看出，混合酵母(1∶1)發(fā)酵時的乙醇含量明顯高于單一酵母發(fā)酵，比釀酒酵母和產朊假絲酵母發(fā)酵時的乙醇含量分別提高了28.76%和42.78%。表明，蘆葦秸稈混合酵母發(fā)酵可以有效提高乙醇含量。因此，確定采用蘆葦秸稈混合酵母發(fā)酵制備乙醇。

2.4 混合酵母配比對乙醇含量的影響

當釀酒酵母與產朊假絲酵母配比分別為1∶1、2∶3、3∶2、4∶1、1∶4時，發(fā)酵液中乙醇含量分別為7.24 g·L-1、8.17 g·L-1、9.05 g·L-1、8.92 g·L-1、6.17 g·L-1。其中，在釀酒酵母與產朊假絲酵母配比為3∶2時，乙醇含量最高。因此，確定混合酵母最優(yōu)配比為3∶2。

2.5 最優(yōu)制備工藝

2.5.1 單因素實驗結果(圖4)

從圖4a可以看出，隨著混合酵母接種量的增加，乙醇含量先快速升高后趨于穩(wěn)定；在混合酵母接種量為10%時，乙醇含量達到最高。因此，混合酵母接種量以10%較為適宜。

圖4 單因素實驗結果

從圖4b可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，乙醇含量快速升高；當纖維素酶用量超過10%后，乙醇含量升速趨緩。綜合考慮成本等因素，纖維素酶用量以12%較為適宜。

從圖4c可以看出，隨著料液比的減小，即檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量的增加，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢。可能是因為，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量較少時，發(fā)酵液中酵母菌的密度較大，抑制了酵母菌的生長，乙醇含量較低；當含水量超過35%(料液比為1∶35)時，由于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量過多造成發(fā)酵液中酵母菌濃度降低，且發(fā)酵液體積大容易染菌、酵母菌與還原糖接觸的概率降低等原因導致乙醇含量下降。因此，料液比以1∶35較為適宜。

從圖4d可以看出，隨著轉速的增大，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢；在轉速為140 r·min-1時，乙醇含量達到最高，為8.32 g·L-1。這是因為，在一定范圍內轉速的增大為發(fā)酵提供了更多的溶氧，為纖維素酶和蘆葦秸稈的充分接觸提供了有利條件，也為培養(yǎng)基提供了更多的溶氧，促進了酵母菌的生長，進而積累了更多的乙醇。因此，轉速以140 r·min-1較為適宜。

從圖4e可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇含量不斷升高；當發(fā)酵時間超過72 h后，乙醇含量趨于穩(wěn)定，可能是因為還原糖被完全消耗。因此，發(fā)酵時間以72 h較為適宜。

從圖4f可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢；在發(fā)酵溫度為32 ℃時，乙醇含量達到最高，為8.02 g·L-1。這是因為，發(fā)酵溫度較低時，酵母菌活性低，且纖維素酶糖化速率慢，導致糖供給不足影響了乙醇含量；雖然在較高的發(fā)酵溫度下，纖維素酶能更有效地促進蘆葦秸稈纖維素糖化，但會影響酵母菌活性。因此，發(fā)酵溫度以32 ℃較為適宜。

2.5.2 PB實驗結果

PB實驗設計與結果見表2，結果分析見表3。

表2 PB實驗設計與結果

表3 PB實驗結果分析

從表2、表3可以看出，6個因素對乙醇含量影響的大小順序為：發(fā)酵時間>混合酵母接種量>發(fā)酵溫度>料液比>纖維素酶用量>轉速；其中發(fā)酵時間、混合酵母接種量和發(fā)酵溫度對乙醇含量的影響較大，且這3個因素對乙醇含量的影響均呈正效應，效應大小順序為：發(fā)酵時間>混合酵母接種量>發(fā)酵溫度。

2.5.3 最陡爬坡實驗結果

采用最陡爬坡實驗快速獲得最大乙醇含量區(qū)域，有效建立響應面擬合方程。最陡爬坡實驗設計與結果見表4。

表4 最陡爬坡實驗設計與結果

從表4可以看出，當混合酵母接種量為12%、發(fā)酵時間為72 h、發(fā)酵溫度為34 ℃時，乙醇含量達到最高，為9.65 g·L-1。

2.5.4 響應面實驗結果

在PB實驗的基礎上，以最陡爬坡實驗確定的混合酵母接種量12%、發(fā)酵時間72 h、發(fā)酵溫度34 ℃作為中心點，采用Box-Behnken設計響應面實驗，因素與水平見表5，結果見6，方差分析見表7。

用Design-Expert軟件對響應面實驗結果進行二次多項回歸擬合，得回歸方程為：Y=-2345.18306+37.28339A+57.22313B+4.95892C+0.10856AB-0.12215AC+0.027879BC-1.84015A2-0.41166B2-0.082820C2。

從表7可以看出，模型F值為22.64，P值為0.000 2，表明模型有效；模型預測復相關系數(shù)R2為0.990 6，精密度為46.981，表明模型數(shù)據可信度和精確度高，適應性好，分析結果較為可靠；一次項A對乙醇含量影響顯著，二次項A2、B2和C2對乙醇含量影響極顯著。

表5 響應面實驗的因素與水平

表6 響應面實驗結果

表7 方差分析

2.5.5 響應面分析

響應面圖和等高線圖顯示每個變量對響應值的影響，可以直觀反映各因素之間的交互作用?；旌辖湍附臃N量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等3個因素交互作用的響應面圖和等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對乙醇含量影響的響應面圖和等高線圖

從圖5可以看出，各等高線圖中心呈橢圓形，表明混合酵母接種量與發(fā)酵時間、混合酵母接種量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度之間交互作用明顯；同時，響應面圖開口朝下，表明乙醇含量和3個因素之間呈拋物線關系。

通過響應面分析得到蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)條件為：混合酵母接種量12.27%、發(fā)酵溫度33.86 ℃、發(fā)酵時間72.12 h?？紤]實際操作情況，確定最優(yōu)條件為：混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理60目蘆葦秸稈、釀酒酵母與產朊假絲酵母配比3∶2、混合酵母接種量12%、發(fā)酵溫度34 ℃、纖維素酶用量12%、轉速140 r·min-1、料液比1∶35(g∶mL)、發(fā)酵時間72 h、pH值4.8。

2.5.6 驗證實驗

在最優(yōu)工藝條件下進行5組平行實驗，得到乙醇含量平均值為9.81 g·L-1，與理論值偏差小于1%，符合預測范圍。因此，該模型可用于優(yōu)化蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的工藝。

3 結論

以蘆葦秸稈為原料，利用混合堿液對其進行預處理促進秸稈纖維素糖化，在單因素實驗的基礎上，通過Plackett-Burman(PB)實驗、最陡爬坡實驗和響應面實驗確定了混合酵母發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)工藝為：混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理60目蘆葦秸稈、釀酒酵母與產朊假絲酵母配比3∶2、混合酵母接種量12%、發(fā)酵溫度34 ℃、纖維素酶用量12%、轉速140 r·min-1、料液比1∶35(g∶mL)、發(fā)酵時間72 h、pH值4.8，在此條件下，乙醇含量達到9.81 g·L-1。