蔡世欣,李 敏,侯余勇,王巍杰*,陳方見*
(1.華北理工大學生命科學學院,河北 唐山 063210;2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室,天津 300308)
隨著工業(yè)的迅速發(fā)展,世界石油消耗量急劇增長,能源短缺問題日益突出,生物質能源作為可再生能源逐漸成為世界各國研究的熱點[1]。然而,原料成本高成為制約生物質能源發(fā)展的主要瓶頸,低成本的植物纖維因可作為發(fā)酵底物而受到廣泛關注[2]。纖維素作為一種大分子多糖是目前分布最廣的生物質,為生物質能源的生產提供了大量原材料[3]。我國秸稈類生物質大多被直接燃燒,不但造成資源浪費,還污染環(huán)境。利用秸稈發(fā)酵生產燃料乙醇既能保護環(huán)境,也可充分利用資源,創(chuàng)造經濟價值[4]。鑒于此,作者以蘆葦秸稈為原料,用堿液對其進行預處理以促進秸稈纖維素糖化,再通過釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和產朊假絲酵母(Candidautilis)混合發(fā)酵制備乙醇,在單因素實驗的基礎上,采用Plackett-Burman(PB)實驗、最陡爬坡實驗和響應面實驗對制備工藝進行優(yōu)化。
蘆葦秸稈,采自華北理工大學曹妃甸校區(qū)周邊。
纖維素酶,和氏璧生物技術有限公司;酵母膏、胰蛋白胨,英國Oxoid公司;所用試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。
SLQ6A型粗纖維測定儀;THZ-92A型氣浴恒溫振蕩器;T6型紫外可見分光光度計;HHS-21-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋。
釀酒酵母,安琪酵母股份有限公司;產朊假絲酵母,鶴壁百惠生物科技有限公司。
基礎培養(yǎng)基:1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(9.2 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸溶液+10.8 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶液,pH值4.8)。
發(fā)酵培養(yǎng)基:2.0%蛋白胨、0.1%磷酸二氫鉀、1.0%磷酸氫二鉀、0.1%硫酸鎂、0.1%氯化鈉的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。
分別稱取5.0 g粉碎過20目、40目、60目和80目篩的蘆葦秸稈置于錐形瓶中,按料液比1∶10(g∶mL,下同)加入50 mL堿液(NaOH或NaOH∶尿素=3.85∶1),置于80 ℃水浴鍋中預處理2 h;將預處理過的蘆葦秸稈多次沖洗,烘干;采用粗纖維測定儀測定蘆葦秸稈中纖維素含量,以確定最優(yōu)的預處理方式。
發(fā)酵菌種的選擇:稱取預處理后的蘆葦秸稈5.0 g,按料液比1∶30加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液和10%纖維素酶。將在基礎培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期的釀酒酵母、產朊假絲酵母或混合酵母(1∶1,釀酒酵母和產朊假絲酵母的配比)按10%接種量分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中;于30 ℃、150 r·min-1發(fā)酵70 h;然后采用DNS法[5]測定發(fā)酵液中還原糖含量,采用重鉻酸鉀比色法[6]測定發(fā)酵液中乙醇含量,以確定最優(yōu)發(fā)酵菌種。
混合酵母配比的選擇:將不同配比(1∶1、2∶3、3∶2、4∶1、1∶4)的混合酵母按上述方法分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,測定發(fā)酵液中乙醇含量,以確定混合酵母的最優(yōu)配比。
1.5.1 單因素實驗
分別考察混合酵母接種量(6%、7%、8%、9%、10%、11%)、纖維素酶用量(6%、8%、10%、12%、14%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)、轉速(120 r·min-1、130 r·min-1、140 r·min-1、150 r·min-1、160 r·min-1)、發(fā)酵時間(24 h、48 h、60 h、72 h、84 h)、發(fā)酵溫度(28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃)對乙醇含量的影響。
1.5.2 響應面實驗
做好鄉(xiāng)鎮(zhèn)基層農業(yè)統(tǒng)計工作任重而道遠,只有結合鄉(xiāng)鎮(zhèn)基層農業(yè)統(tǒng)計工作實際,在提高認識、加強制度建設和管理,以及提高人員隊伍素質等多方面入手,不斷努力改進,才能切實形成整體合力,推動基層農業(yè)統(tǒng)計工作扎實開展、有力開展。
在單因素實驗的基礎上,選取混合酵母接種量、纖維素酶用量、料液比、轉速、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等6個因素的高、低水平(表1),利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件設計Plackett-Burman(PB) 實驗,篩選出影響最大的3個因素進行最陡爬坡實驗;以最陡爬坡實驗確定的中心點、采用Box-Behnken(BB)設計響應面實驗,優(yōu)化蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的工藝條件。
表1 PB實驗的因素與水平
圖1 葡萄糖(a)和乙醇(b)的標準曲線
對圖1曲線進行擬合,得葡萄糖和乙醇的線性回歸方程分別為:y=1.017x-0.0294(R2=0.9948),y=20.047x-0.1046(R2=0.9988)。表明,葡萄糖含量在0~1.2 g·L-1范圍內、乙醇含量在0~7 g·L-1范圍內與吸光度線性關系良好。
從圖2可以看出,對于不同目數(shù)的蘆葦秸稈,采用添加尿素的混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理后的纖維素含量均明顯高于采用單一堿液(NaOH)的;其中60目蘆葦秸稈用混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理后,纖維素含量達到60.7%。因此,確定采用混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)對60目蘆葦秸稈進行預處理。
圖2 預處理方式對纖維素含量的影響
圖3 單一酵母發(fā)酵和混合酵母發(fā)酵效果對比
從圖3可以看出,混合酵母(1∶1)發(fā)酵時的乙醇含量明顯高于單一酵母發(fā)酵,比釀酒酵母和產朊假絲酵母發(fā)酵時的乙醇含量分別提高了28.76%和42.78%。表明,蘆葦秸稈混合酵母發(fā)酵可以有效提高乙醇含量。因此,確定采用蘆葦秸稈混合酵母發(fā)酵制備乙醇。
當釀酒酵母與產朊假絲酵母配比分別為1∶1、2∶3、3∶2、4∶1、1∶4時,發(fā)酵液中乙醇含量分別為7.24 g·L-1、8.17 g·L-1、9.05 g·L-1、8.92 g·L-1、6.17 g·L-1。其中,在釀酒酵母與產朊假絲酵母配比為3∶2時,乙醇含量最高。因此,確定混合酵母最優(yōu)配比為3∶2。
2.5.1 單因素實驗結果(圖4)
從圖4a可以看出,隨著混合酵母接種量的增加,乙醇含量先快速升高后趨于穩(wěn)定;在混合酵母接種量為10%時,乙醇含量達到最高。因此,混合酵母接種量以10%較為適宜。
圖4 單因素實驗結果
從圖4b可以看出,隨著纖維素酶用量的增加,乙醇含量快速升高;當纖維素酶用量超過10%后,乙醇含量升速趨緩。綜合考慮成本等因素,纖維素酶用量以12%較為適宜。
從圖4c可以看出,隨著料液比的減小,即檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量的增加,乙醇含量呈先升高后降低的趨勢。可能是因為,檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量較少時,發(fā)酵液中酵母菌的密度較大,抑制了酵母菌的生長,乙醇含量較低;當含水量超過35%(料液比為1∶35)時,由于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量過多造成發(fā)酵液中酵母菌濃度降低,且發(fā)酵液體積大容易染菌、酵母菌與還原糖接觸的概率降低等原因導致乙醇含量下降。因此,料液比以1∶35較為適宜。
從圖4d可以看出,隨著轉速的增大,乙醇含量呈先升高后降低的趨勢;在轉速為140 r·min-1時,乙醇含量達到最高,為8.32 g·L-1。這是因為,在一定范圍內轉速的增大為發(fā)酵提供了更多的溶氧,為纖維素酶和蘆葦秸稈的充分接觸提供了有利條件,也為培養(yǎng)基提供了更多的溶氧,促進了酵母菌的生長,進而積累了更多的乙醇。因此,轉速以140 r·min-1較為適宜。
從圖4e可以看出,隨著發(fā)酵時間的延長,乙醇含量不斷升高;當發(fā)酵時間超過72 h后,乙醇含量趨于穩(wěn)定,可能是因為還原糖被完全消耗。因此,發(fā)酵時間以72 h較為適宜。
從圖4f可以看出,隨著發(fā)酵溫度的升高,乙醇含量呈先升高后降低的趨勢;在發(fā)酵溫度為32 ℃時,乙醇含量達到最高,為8.02 g·L-1。這是因為,發(fā)酵溫度較低時,酵母菌活性低,且纖維素酶糖化速率慢,導致糖供給不足影響了乙醇含量;雖然在較高的發(fā)酵溫度下,纖維素酶能更有效地促進蘆葦秸稈纖維素糖化,但會影響酵母菌活性。因此,發(fā)酵溫度以32 ℃較為適宜。
2.5.2 PB實驗結果
PB實驗設計與結果見表2,結果分析見表3。
表2 PB實驗設計與結果
表3 PB實驗結果分析
從表2、表3可以看出,6個因素對乙醇含量影響的大小順序為:發(fā)酵時間>混合酵母接種量>發(fā)酵溫度>料液比>纖維素酶用量>轉速;其中發(fā)酵時間、混合酵母接種量和發(fā)酵溫度對乙醇含量的影響較大,且這3個因素對乙醇含量的影響均呈正效應,效應大小順序為:發(fā)酵時間>混合酵母接種量>發(fā)酵溫度。
2.5.3 最陡爬坡實驗結果
采用最陡爬坡實驗快速獲得最大乙醇含量區(qū)域,有效建立響應面擬合方程。最陡爬坡實驗設計與結果見表4。
表4 最陡爬坡實驗設計與結果
從表4可以看出,當混合酵母接種量為12%、發(fā)酵時間為72 h、發(fā)酵溫度為34 ℃時,乙醇含量達到最高,為9.65 g·L-1。
2.5.4 響應面實驗結果
在PB實驗的基礎上,以最陡爬坡實驗確定的混合酵母接種量12%、發(fā)酵時間72 h、發(fā)酵溫度34 ℃作為中心點,采用Box-Behnken設計響應面實驗,因素與水平見表5,結果見6,方差分析見表7。
用Design-Expert軟件對響應面實驗結果進行二次多項回歸擬合,得回歸方程為:Y=-2345.18306+37.28339A+57.22313B+4.95892C+0.10856AB-0.12215AC+0.027879BC-1.84015A2-0.41166B2-0.082820C2。
從表7可以看出,模型F值為22.64,P值為0.000 2,表明模型有效;模型預測復相關系數(shù)R2為0.990 6,精密度為46.981,表明模型數(shù)據可信度和精確度高,適應性好,分析結果較為可靠;一次項A對乙醇含量影響顯著,二次項A2、B2和C2對乙醇含量影響極顯著。
表5 響應面實驗的因素與水平
表6 響應面實驗結果
表7 方差分析
2.5.5 響應面分析
響應面圖和等高線圖顯示每個變量對響應值的影響,可以直觀反映各因素之間的交互作用?;旌辖湍附臃N量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等3個因素交互作用的響應面圖和等高線圖如圖5所示。
圖5 各因素交互作用對乙醇含量影響的響應面圖和等高線圖
從圖5可以看出,各等高線圖中心呈橢圓形,表明混合酵母接種量與發(fā)酵時間、混合酵母接種量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度之間交互作用明顯;同時,響應面圖開口朝下,表明乙醇含量和3個因素之間呈拋物線關系。
通過響應面分析得到蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)條件為:混合酵母接種量12.27%、發(fā)酵溫度33.86 ℃、發(fā)酵時間72.12 h??紤]實際操作情況,確定最優(yōu)條件為:混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理60目蘆葦秸稈、釀酒酵母與產朊假絲酵母配比3∶2、混合酵母接種量12%、發(fā)酵溫度34 ℃、纖維素酶用量12%、轉速140 r·min-1、料液比1∶35(g∶mL)、發(fā)酵時間72 h、pH值4.8。
2.5.6 驗證實驗
在最優(yōu)工藝條件下進行5組平行實驗,得到乙醇含量平均值為9.81 g·L-1,與理論值偏差小于1%,符合預測范圍。因此,該模型可用于優(yōu)化蘆葦秸稈混合發(fā)酵制備乙醇的工藝。
以蘆葦秸稈為原料,利用混合堿液對其進行預處理促進秸稈纖維素糖化,在單因素實驗的基礎上,通過Plackett-Burman(PB)實驗、最陡爬坡實驗和響應面實驗確定了混合酵母發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)工藝為:混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理60目蘆葦秸稈、釀酒酵母與產朊假絲酵母配比3∶2、混合酵母接種量12%、發(fā)酵溫度34 ℃、纖維素酶用量12%、轉速140 r·min-1、料液比1∶35(g∶mL)、發(fā)酵時間72 h、pH值4.8,在此條件下,乙醇含量達到9.81 g·L-1。