付 翔，李明新，彭馳偉，王凱旋*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001；2.唐山中心醫(yī)院，河北 唐山 063000)

石墨烯(graphene)是一種單原子層石墨，是零維富勒烯的基本結(jié)構(gòu)單元,具有超薄、超高強(qiáng)度等特性，被廣泛應(yīng)用于超輕防彈衣、超薄超輕型飛機(jī)材料等領(lǐng)域[1]。氧化石墨烯(GO)和還原氧化石墨烯(rGO)是石墨烯最重要的2種衍生物[2]。rGO具有細(xì)胞毒性，并且還原度越高的rGO細(xì)胞毒性越大；與GO相比，rGO更易黏附在細(xì)胞表面[3]。石墨烯及其衍生物具有高度的生物相容性、低毒性和大劑量的負(fù)載能力[4]，近10年來，在生物醫(yī)學(xué)方面的研究受到了前所未有的關(guān)注[5]，但其在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用尚處于早期階段[6]。

成纖維細(xì)胞(fibroblasts)是皮膚真皮網(wǎng)織層中最重要的細(xì)胞，主要存在于疏松結(jié)締組織中，能合成和分泌大量膠原蛋白，對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用[7]。成纖維細(xì)胞對不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷的修復(fù)有著十分重要的作用[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞具有不同類型，它們的獨(dú)特性能可幫助修復(fù)受損皮膚，并降低年齡老化對皮膚的影響[11]。通過皮膚表皮信號的刺激可增加成纖維細(xì)胞的數(shù)量，有助于傷口愈合過程中毛囊的形成，進(jìn)而降低皮膚愈合后落下疤痕的幾率[12]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的大多是GO或石墨烯薄膜在醫(yī)學(xué)方面的研究，對rGO毒理特性的報(bào)道較少。但rGO是新型骨架材料的優(yōu)良選擇，有必要研究其對細(xì)胞的毒性。因此，作者用GO制備rGO，通過CCK8法細(xì)胞活性檢測及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究rGO對人原代成纖維細(xì)胞的毒性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

人表皮組織，由桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。

氧化石墨烯(GO)，江蘇先豐納米材料科技有限公司；DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液，美國GIBCO公司；胎牛血清(FBS)，巴西Lonsera公司；CCK8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)，德國艾本德公司；超凈工作臺，上海蘇凈實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；YXQ-IS-75SⅡ型壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；IX73型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)盤，南寧精密儀器廠；Infinite F200型連續(xù)光柵型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；純水超純水制作系統(tǒng)，Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 rGO溶液的制備

將GO平鋪于盛有石墨的帶蓋平面器皿上，放入微波爐中高溫微波10 s，得到黑色物質(zhì)，輕輕用鑷子將其移入另一個(gè)器皿中，輕觸器皿壁使之鋪平，再高溫微波10 s[13]，即得rGO。用蒸餾水配制成濃度為1.0 mg·mL-1的rGO母液，再稀釋成不同濃度(0、5、10、15、20、25、30、35、40，μg·mL-1)，備用。

1.2.2 人原代成纖維細(xì)胞的提取

將人表皮組織放入預(yù)冷的75%酒精中浸泡，然后移至超凈臺，Hanks液清洗3次后用剪刀剪成4 mm左右的碎塊，再用Hanks液清洗2～3次以除去血球和脂肪組織。將預(yù)處理過的人表皮組織放入培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中孵育，待組織貼壁5 d后，換液(注意動作輕，避免組織脫落)；觀察到細(xì)胞觸角生出后，將組織塊拿出，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用Hanks液洗滌，棄上清，PBS緩沖液清洗2～3次后加入胰蛋白酶消化細(xì)胞并分瓶培養(yǎng)[14]。

1.2.3 人原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

采用含100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS的 DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人原代成纖維細(xì)胞，每隔2 d換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 rGO的表征

將濃度為1.0 mg·mL-1的rGO超聲30 s后，吸取1滴，滴在200目的超薄銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干后用透射電子顯微鏡觀察rGO的形貌特征。

1.2.5 CCK8法檢測細(xì)胞活性

在人原代成纖維細(xì)胞生長至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用1 mL PBS緩沖液清洗后吸出，用2 mL胰蛋白酶消化后收集，重懸為單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按式(1)計(jì)算細(xì)胞密度(個(gè)·mL-1)：

(1)

根據(jù)計(jì)算出的細(xì)胞密度，配制密度為6×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，加入96孔板中，每孔100 μL，即每孔細(xì)胞數(shù)為6 000個(gè)。96孔板周邊培養(yǎng)孔中，加入100 μL PBS緩沖液以避免細(xì)胞培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)液蒸發(fā)導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。將96孔板放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長、每孔細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，分別給予不同濃度的rGO，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h后，移除孔板內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入預(yù)先配制的100 μL CCK8溶液，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，按式(2)計(jì)算細(xì)胞活性：

(2)

式中：A為含有細(xì)胞、CCK8、rGO的溶液吸光度；A空白為僅含CCK8的溶液吸光度；A0為含有細(xì)胞、CCK8而不含rGO的溶液吸光度。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)·mL-1， 接種于24 孔板中，每孔1 mL；待細(xì)胞貼壁生長24 h、細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)，棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗3次；在孔板底部中央垂直劃痕，PBS緩沖液清洗3次，去除多余的死細(xì)胞，用顯微鏡觀察并拍照；采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和rGO組(0、5、10、15、20、25、30、35、40，μg·mL-1)，將24孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出，棄培養(yǎng)液，用顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)方法及數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并作圖，多個(gè)樣本間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 rGO的表征

與GO比較，所制備的rGO的顏色更深，粉末更細(xì)，透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的薄層和典型的褶皺形態(tài)，如圖1所示。

圖1 rGO的TEM照片

2.2 人原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

按1.2.2提取人原代成纖維細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)至第10 d時(shí)，細(xì)胞開始慢慢從組織中伸出；培養(yǎng)至第15 d時(shí)，細(xì)胞開始伸出觸角且數(shù)量越來越多，分布越來越密集，如圖2所示。

圖2 人原代成纖維細(xì)胞的顯微鏡照片(黑色部分為組織塊)

2.3 rGO對人原代成纖維細(xì)胞活性的影響(圖3)

*P<0.05

由圖3可以看出，當(dāng)rGO濃度小于5 μg·mL-1時(shí)，不影響人原代成纖維細(xì)胞的生長，細(xì)胞活性與rGO干預(yù)前相當(dāng)；當(dāng)rGO濃度為10～40 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活性呈濃度依賴性降低。因此，5 μg·mL-1是rGO對人原代成纖維細(xì)胞的安全濃度。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4可以看出，當(dāng)rGO濃度小于5 μg·mL-1時(shí)，不影響人原代成纖維細(xì)胞的愈合；當(dāng)rGO濃度大于5 μg·mL-1后，細(xì)胞愈合能力受到影響，且隨著rGO濃度的增加，影響越來越明顯。

本實(shí)驗(yàn)僅在體外初步研究了rGO對人原代成纖維細(xì)胞愈合的影響，在實(shí)際應(yīng)用中還需要重點(diǎn)解決其毒性問題。目前關(guān)于rGO對皮膚的影響研究少見報(bào)道，今后可以更進(jìn)一步研究rGO對皮膚的影響，探討影響機(jī)制，發(fā)掘rGO對人類機(jī)體更多的生物作用。

3 結(jié)論

以GO制備的rGO顏色變深，粉末變細(xì)，具有明顯的薄層和褶皺結(jié)構(gòu)。以rGO溶液作用于人原代成纖維細(xì)胞，干預(yù)24 h后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，5 μg·mL-1是rGO對人原代成纖維細(xì)胞的安全濃度，濃度大于5 μg·mL-1后，細(xì)胞毒性隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)；當(dāng)rGO濃度小于5 μg·mL-1時(shí)，不影響人原代成纖維細(xì)胞的愈合。