郭成栓，楊桂玲，劉曉珊

(廣東食品藥品職業(yè)學院生物技術學院，廣東 廣州 510520)

纖維素酶包括β-葡聚糖外切酶、β-葡聚糖內(nèi)切酶和纖維二糖酶[1-3]。纖維素酶通常在酸性條件下發(fā)揮其催化作用，在堿性條件下酶活較低甚至沒有，從而限制了其在堿性環(huán)境中的應用。堿性纖維素酶是一種缺少β-葡聚糖外切酶和纖維二糖酶的非全纖維素酶組分的β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶，不會破壞纖維素的結構，可以在堿性條件下發(fā)揮催化作用,被廣泛應用于洗滌劑、脫墨等行業(yè)[4-6]。洗滌劑中加入堿性纖維素酶，一方面可增強洗滌劑的去污能力，有效去除棉織物上的污垢；另一方面還能對棉織物起到保護作用，避免變黃、變硬，使顏色鮮艷并保持柔軟。分離堿性纖維素酶基因、構建基因工程菌是提高堿性纖維素酶產(chǎn)量的重要方法之一[7-9]。此外，酶分子的定點突變和定向進化也為酶分子的改造提供了新的思路[10-13]。酶分子體外定向進化模擬自然進化，通過酶編碼基因的一輪或多輪突變，構建酶突變基因文庫，經(jīng)過篩選得到所需性質(zhì)的酶[14-15]。定向進化的方法主要有易錯PCR、DNA shuffling等，根據(jù)待進化的酶分子特性可選擇不同的方法。作者根據(jù)陽性轉化子在IPTG誘導下可以在LB-CMC平板上產(chǎn)生水解圈的原理[16-17]，在初篩和搖瓶復篩的基礎上，采用易錯PCR法對β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因進行定向進化，從陽性轉化子中篩選酶活提高的突變菌株。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

PCR產(chǎn)物純化試劑盒、IPTG，上海生工；膠回收試劑盒，Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、DNase Ⅰ、XhoⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、RNase A、dNTPs、DNA抽提試劑，大連寶生物公司。

熱循環(huán)儀，凝膠成像系統(tǒng)，低溫冷凍離心機，全溫度恒溫氣浴搖床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，酸度計，垂直凈化工作臺，電子天平，滅菌鍋。

1.2 菌株、載體與培養(yǎng)基

大腸桿菌BL21(DE3)、表達載體pET20b，中科院昆明動物研究所；pMD18T，大連寶生物公司。

LB培養(yǎng)基[18]。

1.3 β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶的易錯PCR擴增

參照文獻[18]，提取短小芽孢桿菌DNA，克隆編碼β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶的基因，構建表達載體pET20b，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，得到重組菌BL21(DE3)/pET20b-EglA；在PCR反應體系中添加不同量Mn2+，進行易錯PCR擴增，通過酶活比較篩選最佳的Mn2+添加量；參照TaKaRa公司的說明書進行易錯PCR擴增產(chǎn)物DNA的酶切及連接；按Qiagen公司試劑盒說明進行易錯PCR擴增產(chǎn)物DNA的回收。

1.4 易錯PCR突變文庫的構建及陽性轉化子的篩選

設計一對引物5′-ATCTGGATCCATGCACATTTTTG-3′、5′-ATCGCTCGAGTTATTTATTCGGAAG-3′，分別引入BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，對酶切片段進行鑒定[18]，構建易錯PCR突變文庫。根據(jù)陽性轉化子在IPTG誘導下可以在LB-CMC平板上產(chǎn)生水解圈的原理進行初篩，挑選水解圈與菌落直徑比值較大的陽性轉化子進行搖瓶復篩[19]，以篩選出酶活提高的突變菌株。

1.5 β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶重組菌的誘導表達及酶活測定

挑取BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA及BL21(DE3)/pET20b-EglA單菌落按1%的接種量接種至含50 μg·mL-1氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值在0.5～1.0之間；加入誘導物IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37 ℃誘導一定時間，取樣測定酶活[19]。

1.6 突變酶與野生酶的表達量分析

將BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA和BL21(DE3)/pET20b-EglA分別于LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)10 h，按1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期，加入誘導物IPTG后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，10 000 r·min-1離心5 min，收集菌體，用2×SDS上樣緩沖液于沸水浴中加熱5 min裂解菌體，離心，取上清進行SDS-PAGE分析，利用BandScan軟件測定突變酶及野生酶的表達量。

1.7 突變酶基因DNA及氨基酸序列分析

提取酶活提高突變菌株的重組質(zhì)粒，進行DNA序列測定，在GenBank數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST軟件對突變酶基因進行DNA及氨基酸序列分析。

2 結果與討論

2.1 易錯PCR堿基錯配的引入

PCR反應體系中的Mg2+或Mn2+不僅會使Taq DNA聚合酶的保真性大大降低，還會影響酶活。Mn2+添加量對易錯PCR產(chǎn)物的影響如圖1所示。

M.DL5000 DNA marker 1.Mn2+添加量1 mL 2.Mn2+添加量2 mL 3.Mn2+添加量3 mL 4.Mn2+添加量4 mL

從圖1可以看出，隨著PCR反應體系中Mn2+添加量的增加，DNA條帶亮度減弱，說明催化合成的DNA量減少，突變率隨著Mn2+添加量的增加而升高。

將添加不同量Mn2+擴增得到的PCR產(chǎn)物進行純化、回收、酶切、連接表達載體，轉化大腸桿菌，構建突變文庫，根據(jù)平板上陽性轉化子比率篩選合適的Mn2+添加量。結果表明，50 μL反應體系加入1 μL Mn2+，陽性轉化子比率在60%左右，對建立隨機突變體系較合適。若Mn2+添加量過多，反應體系的突變率太高，陽性轉化子太少，此時大部分為負向突變，不利于篩選到正向突變菌株。

2.2 高酶活菌株的篩選

將易錯PCR擴增得到的DNA片段構建到表達載體pET20b上，轉化大腸桿菌，在IPTG誘導下，陽性轉化子周圍可以看到清晰的水解圈(圖2a)；挑選水解圈與菌落直徑比值較大的陽性轉化子進行搖瓶復篩(圖2b)，可以看到，大部分的陽性轉化子都發(fā)生了負向突變，有些陽性轉化子由于發(fā)生錯配的堿基較多，從而失去了產(chǎn)酶活性，只有少部分的陽性轉化子發(fā)生了正向突變。

圖2 陽性轉化子在LB-CMC平板上產(chǎn)生的水解圈

選取5株水解圈和菌落直徑比值較大的陽性轉化子，經(jīng)過1輪易錯PCR的定向進化，測得酶活(U·mL-1)分別為3.42、4.78、4.02、4.23、4.15，其中4株突變菌株所產(chǎn)酶的酶活得到提高，BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA2所產(chǎn)酶的酶活達到4.78 U·mL-1，為野生菌株BL21(DE3)/pET20b-EglA所產(chǎn)酶(3.60 U·mL-1)的1.32倍。

2.3 突變酶與野生酶的表達量分析

對BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA和BL21(DE3)/pET20b-EglA發(fā)酵產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析，結果如圖3所示。

從圖3可以看出，誘導4 h后，菌株BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA和BL21(DE3)/pET20b-EglA均在73 kDa左右有β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶目的蛋白的表達條帶。利用BandScan軟件測定蛋白條帶的相對含量，發(fā)現(xiàn)突變酶的表達量比野生酶提高了5%，而酶活卻提高了1.32倍，說明突變酶的催化效率得到了提高。

M.molecular mass marker 1.誘導4 h后的BL21(DE3)/pET20b-Mut-EglA 2.誘導4 h后的BL21(DE3)/pET20b-EglA 3.未誘導的BL21(DE3)/pET20b-EglA

2.5 突變酶與野生酶氨基酸序列的比較

基因測序結果表明，重組基因片段長度為1 980 bp。對DNA序列分析可知突變酶基因序列中有3個堿基發(fā)生了突變，其中2個為胸腺嘧啶堿基突變?yōu)榘奏A基，突變位點分別位于1 760 bp和1 962 bp處，導致酶的氨基酸序列中2個氨基酸發(fā)生了改變：其中野生酶突變位點的密碼子AAA(106 bp)突變?yōu)镚AA，其編碼的氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝彼?；野生酶突變位點的密碼子TTT(1 760 bp)突變?yōu)門CT，其編碼的苯丙氨酸變?yōu)橘嚢彼?；? 962 bp處密碼子GGT突變?yōu)镚GC，但是其編碼的氨基酸沒有發(fā)生改變，為同義突變。

2.6 討論

應用PCR方法對酶分子進行改造，每一輪反應堿基突變太多會造成負向效應，一般要經(jīng)過多輪反應才能將有益突變進行積累，使進化向正向突變定向進行，從而取得較好的效果。

一級序列差異很大的蛋白質(zhì)能折疊成相似的三維結構，而僅有少數(shù)氨基酸差異的蛋白質(zhì)卻呈現(xiàn)不同的三維結構，蛋白質(zhì)空間結構形成的規(guī)律還遠未被認知，如何根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列折疊出其三維結構是當前研究的核心問題。突變酶氨基酸改變太少，其空間結構一般無法從三維結構上觀察到。突變酶活性的提高可能是由于N端氨基酸的改變導致酶分子空間結構發(fā)生了改變，進而提高了其催化效率；也可能是由于C端結合結構域的氨基酸改變使空間結構發(fā)生了改變，導致酶分子周圍底物濃度增大，從而使底物更容易與催化結構域結合，進而提高其催化效率[20-22]。

3 結論

根據(jù)陽性轉化子在IPTG誘導下可以在LB-CMC平板上產(chǎn)生水解圈的原理，在初篩和搖瓶復篩的基礎上，采用易錯PCR法對β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因進行定向進化，從陽性轉化子中篩選酶活提高的突變菌株。突變酶活性是野生酶的1.32倍，催化效率約為野生酶的1.26倍。突變酶基因DNA序列中有3個堿基發(fā)生了突變，導致氨基酸序列中有2個氨基酸發(fā)生了改變：野生酶突變位點的密碼子AAA(106 bp)突變?yōu)镚AA，其編碼的氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝彼?；野生酶突變位點的密碼子TTT(1 760 bp)突變?yōu)門CT，其編碼的苯丙氨酸變?yōu)橘嚢彼?；野生酶突變位點的密碼子GGT(1 962 bp)突變?yōu)镚GC，但是其編碼的氨基酸沒有發(fā)生改變，為同義突變。