劉耀川，張繼一，楊 森

（1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，沈陽 110164；2.阜新市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心遼寧 阜新 123000；3.阜新市林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 阜新 123000）

野禽因無固定的生活范圍，具有較高的自由度，使其成為許多病原體的天然運(yùn)載工具［1-3］。野禽在許多疫病流行過程中均起到了傳播的作用。麻雀作為野禽中留鳥的1 種，在自然界分布廣泛且種群數(shù)量龐大［4］。由于其對環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，大量棲息在城鎮(zhèn)人口密集地區(qū)、畜禽飼養(yǎng)場附近及野生動物密集地區(qū)，造成其與人、經(jīng)濟(jì)動物及野生環(huán)境中的其他動物均有較密切的接觸［5］。病原體若以麻雀為中間宿主，對人類生活社區(qū)、畜牧業(yè)飼養(yǎng)場、野生動物群體均會產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。因此，對麻雀這類分布范圍廣、種群數(shù)量龐大、適應(yīng)能力強(qiáng)的野禽進(jìn)行病原體本底調(diào)查，具有十分重要的流行病學(xué)意義［6，7］。

本研究以遼寧阜新地區(qū)不同環(huán)境的麻雀為調(diào)查對象，對其體內(nèi)攜帶的病原菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，為阜新地區(qū)防控以麻雀等野禽為媒介的疫病提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集地點(diǎn) 在阜新市內(nèi)選取了2 個大型露天農(nóng)貿(mào)市場及2個居民小區(qū)；在彰武縣選取了1個規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場、1 個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場、1 個規(guī)?；半u養(yǎng)殖場及1 個規(guī)?；i養(yǎng)殖場；同時選取了大青溝風(fēng)景區(qū)、千佛山風(fēng)景區(qū)及部分村間農(nóng)田、公路附近等自然環(huán)境作為采樣點(diǎn)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 無菌棉拭子、5 mL 離心管、10 mL離心管、眼科剪、眼科鑷、酒精燈、立式高壓蒸汽滅菌器（YXQ/BXM-30R）、超凈工作臺（BSC-1004）、100 μL 微量移液器（Eppednorf）、1 000μL 微量移液器（Thermo F3）、隔水式電熱微生物恒溫培養(yǎng)箱（SPX-PID）、恒溫振蕩式培養(yǎng)箱（THZ-98A）均由阜新市動物疫病預(yù)防控制中心提供；麻雀捕捉粘網(wǎng)等由阜新市林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心提供。

1.1.3 主要試劑 營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、麥康凱（MacConkey）培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；S-S 瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂粉（TSA）、M-H 培養(yǎng)基（Mueller-Hinton），青島海博科技公司；沙門氏菌生化鑒定管、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管，杭州微生物試劑有限公司；鏈球菌API鑒定條，梅里埃生物制品有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在采樣地附近，選取空曠、開闊場地，用大米等谷物作為誘餌，使用粘網(wǎng)抓捕麻雀。用無菌棉拭子涂擦麻雀泄殖腔及口腔內(nèi)容物，之后將棉拭子頭存放于無菌生理鹽水的離心管中。選取個別麻雀采集其心臟血液，每只麻雀采集0.5～1.0 mL，儲存于加入抗凝劑的無菌離心管中。將上述采集的樣本存放于4 ℃保鮮箱中，盡快送至實(shí)驗(yàn)室。同時在各采樣地附近區(qū)域內(nèi)尋找自然死亡的麻雀尸體，并將其密封保存于4 ℃保溫箱中一并收集。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 按照產(chǎn)品說明，使用滅菌去離子水對試驗(yàn)使用的各種液體、固體培養(yǎng)基進(jìn)行配置。配置好的培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃30 min 滅菌處理后，于潔凈工作臺中進(jìn)行分裝。將NB 培養(yǎng)基分裝于5 mL 離心管中，每管裝約4 mL；將各種固體培養(yǎng)基于直徑90 mm 培養(yǎng)皿中制成固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基需滿足一定厚度。將制備好的各種培養(yǎng)基放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)12 h 培養(yǎng)檢菌。檢菌合格的培養(yǎng)基封口并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.3 病原菌擴(kuò)增 將采樣棉拭子均勻涂布于普通固體瓊脂培養(yǎng)基上；用無菌三角玻璃棒對抗凝血液樣本進(jìn)行涂布；用無菌眼科手術(shù)鑷及手術(shù)剪對麻雀尸體進(jìn)行解剖，取大小適宜的肝臟、心臟、腦組織塊，用鑷子夾取，均勻涂布在普通固體瓊脂培養(yǎng)基上，并將固體瓊脂培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)結(jié)果，挑取形狀、大小、生長性質(zhì)明顯不同的單獨(dú)菌落，接種于NB 培養(yǎng)基中，37 ℃180 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h 進(jìn)行菌種擴(kuò)增，并將擴(kuò)增后的細(xì)菌于終濃度為30%的甘油溶液中，-80 ℃低溫保存、待檢［9］。

1.2.4 病原菌初步鑒定 將保存的甘油菌進(jìn)行復(fù)蘇、擴(kuò)增后，取100 μL 菌液均勻涂布于各鑒別培養(yǎng)基中，并用三角玻璃棒涂抹均勻。將培養(yǎng)基正置片刻待菌液完全吸收后，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～12 h，對病原菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 病原菌分離株生化反應(yīng)鑒定 在鑒別培養(yǎng)基中選取具有典型生長特性的菌落，進(jìn)行相應(yīng)的生化反應(yīng)鑒定。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中選取圓形且呈現(xiàn)明顯金屬紅色光澤的菌落；在沙堡氏培養(yǎng)基中選取圓形、濕潤的白色菌落；在高鹽甘露醇培養(yǎng)基中選取圓形、黃色小菌落。將選取的典型菌落分別接種于相應(yīng)的微量生化反應(yīng)管中，接種后用2～3 滴液體石蠟對反應(yīng)液面進(jìn)行封閉，再用封口膜對整個反應(yīng)管進(jìn)行封口并標(biāo)記序號，之后將微量生化反應(yīng)管放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h。觀察培養(yǎng)后微量生化反應(yīng)管中液體顏色變化情況，根據(jù)生化反應(yīng)編碼手冊對病原菌分離株進(jìn)行賦碼，并最終確定病原菌種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集結(jié)果

本次試驗(yàn)共捕獲了83 只麻雀，采集了80 個泄殖腔棉拭子、25 個口腔棉拭子及6 個血液樣本，83只麻雀在樣品采集后均放生。在自然環(huán)境中共收集到13 只麻雀尸體，采集了4 份腦組織樣本、8 份肝臟組織樣本和6份心臟組織樣本。

2.2 病原菌分離、鑒定結(jié)果

樣品經(jīng)擴(kuò)增、培養(yǎng)、鑒別培養(yǎng)基初步分離、生化反應(yīng)編碼鑒定后，共確定了300 株病原菌分離株。其中包括大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌及巴氏桿菌，4 種病原菌分別為98 株、76 株、92 株及34 株，占比分別為32.67%（98/300）、25.33%（76/300）、30.67%（92/300）及11.33%（34/300）。具體病原菌分離及病原菌來源見表1。

由表1 可知，在遼寧阜新地區(qū)麻雀攜帶的主要病原菌為大腸桿菌，其次為葡萄球菌，沙門氏菌和巴氏桿菌次之。

表1 阜新地區(qū)麻雀病原菌鑒定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

野禽在自然環(huán)境中因具有較高的自由度而成為許多病原的理想載體。目前，關(guān)于野禽攜帶不同病原的報(bào)道較多，在多種野禽中已發(fā)現(xiàn)禽流感、新城疫等影響力高、威脅性強(qiáng)的病原。麻雀作為野禽中留鳥的1 種，因其種群數(shù)量龐大、生活范圍廣泛，經(jīng)常在人類生活環(huán)境及野生自然環(huán)境中活動。病原若以麻雀為中間宿主，則可輕易在人群及野生環(huán)境中快速傳播，將會對人類社會及生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重威脅。因此，對麻雀開展病原攜帶情況調(diào)查意義重大。

本試驗(yàn)通過對不同環(huán)境、不同病理來源的樣本進(jìn)行病原菌分離、生化反應(yīng)鑒定，最終確定阜新地區(qū)麻雀源病原菌的種類及組成。結(jié)果表明，在129個樣本來源中共鑒定出300 株病原菌，其中大腸桿菌98 株（32.67%）、沙門氏菌76 株（25.33%）、葡萄球菌92 株（30.67%）、巴氏桿菌34 株（11.33%），大腸桿菌及葡萄球菌為該地區(qū)麻雀攜帶的主要病原菌。

病原攜帶種類、組成和占比均表現(xiàn)出較為明顯的地域特性。張宗植等［6］報(bào)道，吉林延邊地區(qū)野生鵪鶉主要攜帶病原菌以大腸桿菌和沙門氏菌的混合感染為主，并未發(fā)現(xiàn)葡萄球菌與巴氏桿菌；金志民等［7］報(bào)道，牡丹江地區(qū)城市留鳥主要攜帶病原為大腸桿菌和沙門氏菌，而葡萄球菌較少；周方永等［8］報(bào)道，在新疆地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場附近的麻雀主要攜帶病原為分枝桿菌；黃銀云等［9］對江蘇地區(qū)野雞調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其攜帶的主要病原菌為白色念珠菌；李楠等［1］對長春地區(qū)野鳥糞便進(jìn)行病原菌調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)野鳥主要攜帶病原菌為麥?zhǔn)匣【?、普通變形桿菌、出血性大腸桿菌及雷氏普羅威登斯菌。

本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的野鳥病原攜帶情況進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，阜新地區(qū)麻雀攜帶病原種類與優(yōu)勢菌株均有所差異，表明阜新地區(qū)野鳥攜帶病原菌也具有明顯的地區(qū)特點(diǎn)?？筛鶕?jù)本試驗(yàn)結(jié)果，制定阜新地區(qū)野鳥保護(hù)措施，有效預(yù)防因野鳥引起的流行性疾病。