朱佳文 ， 邱時秀 ， 李峪鵬 ， 曹衍波 ， 凌乙丹 ， 謝鐘煒 ， 楊 雪 ， 許禎瑩

（1.成都市農林科學院畜牧研究所，四川成都 611130；2.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川雅安 611130）

桑葉在我國資源豐富， 具有非常高的營養(yǎng)價值，且藥食均可，粗蛋白質含量為20% ～30%，粗脂肪含量為 4% ～10%， 粗纖維含量為 8% ～15%， 無氮浸出物含量為 30% ～ 35%（Zhou，2011），維生素含量高，氨基酸種類齊全，還具有許多天然的活性物質，能夠抗應激，增加免疫力（李瑞雪，2009），目前已被廣泛應用到動物飼料中（黃自然，2006）。 對桑葉進行青貯發(fā)酵可以提高桑葉的保存時間， 通過添加微生物還可以加快消除桑葉中的有毒物質，提升飼料品質和口感。

研究表明， 混合菌液作用于桑葉發(fā)酵能夠改善桑葉的飼料功能（張鴻，2015）。而枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌均被允許用于動物養(yǎng)殖。因此，本試驗選擇實驗室已鑒定出的兩種芽孢桿菌協同發(fā)酵桑葉飼料，研究其對桑葉營養(yǎng)品質的影響，為篩選良好的復合菌劑配方提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus Licheniformis）均來自成都市農林科學院分離鑒定菌株。 桑葉取自成都市農林科學院羊馬科研實驗基地，于2019年8 月采收。 胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。 青貯飼料發(fā)酵袋規(guī)格為 30 cm×40 cm，22 絲。

1.2 復合菌液配方的設計 采用常規(guī)的微生物培養(yǎng)、活化及擴大培養(yǎng)法。分別將新鮮的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌于37 ℃用TSB 或TSA 復蘇擴大培養(yǎng)8 h，搖床轉速為180 r/min，使芽孢桿菌生長速度達到穩(wěn)定期，進行計數。按兩種芽孢桿菌的菌落形成單位（cfu）比例（1:1、1:4 和 4:1）配制成H1、H2 和 H3 混合制劑。

1.3 青貯桑葉試驗設計 青貯窖采用青貯飼料發(fā)酵袋，將新鮮桑葉和柄切成3 ～5 cm，混勻，隨機分為30 袋，每袋1000 g。 對照組和處理組（H1組、H2 組和 H3 組）每個發(fā)酵時間點各 3 袋，保證處理組細菌添加量水平為1×107cfu/g 桑葉鮮重，充分混勻，人工壓實后系上袋口，并用膠帶密封，置于室溫發(fā)酵。 在青貯后第7、28、56 天打開發(fā)酵袋，分析青貯飼料各項指標。

1.4 發(fā)酵飼料樣品處理 分別在青貯后不同發(fā)酵時間點，隨機取出對照組3 袋和處理組各3 袋，每袋稱取20 g 放入250 mL 錐形瓶，加入100 mL去離子水，4 ℃浸提24 h， 先用雙層紗布過濾，再用濾紙過濾，測定各個時期的pH。 將剩余的青貯飼料烘干，稱重，測定各個時期的粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。

1.5 測定指標及方法 粗纖維含量測定采用消煮法，參照GB/T 6434-2006《飼料中粗纖維的測定方法》， 中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維利用Ankom 220 型纖維分析系統進行測定； 粗脂肪含量測定采用索氏提取法， 參照GB/T 6433-2006《飼料中粗脂肪的測定方法》； 粗蛋白質含量測定采用凱氏定氮法，參照GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白質測定方法》。

2 結果與分析

2.1 菌種的活化 對試驗用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌進行復蘇，其在TSA 培養(yǎng)基上的生長狀況良好。

2.2 青貯桑葉發(fā)酵后的pH 變化 隨著青貯時間的延長，樣品的pH 總體呈下降趨勢。 由表1 可知， 桑葉青貯發(fā)酵過程中，H1、H2 和 H3 組的 pH變化和對照組沒有明顯的差異性。

表1 復合芽孢桿菌對桑葉青貯過程中pH 的影響

2.3 青貯桑葉營養(yǎng)成分的鑒定

2.3.1 復合芽孢桿菌對桑葉粗纖維、 中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的影響 隨著青貯時間的延長，添加復合芽孢桿菌的樣品粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均呈下降趨勢。

由表2 看出，桑葉青貯發(fā)酵過程中，添加復合芽孢桿菌 H1 和 H2 組在第 7 天、28 天和 56 天較對照組的粗纖維含量差異顯著 （P ≤ 0.5）， 在第56 天分別下降了7.53%和12.69%；H3 組在第56天和對照組的粗纖維未見明顯差異。 其中，H2 組的粗纖維含量在第56 天下降幅度最大， 只占（12.217±0.039）%。

表2 復合芽孢桿菌對桑葉青貯過程中粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的影響%

添加復合芽孢桿菌H1 和H2 組從第7 天開始均和對照組的中性洗滌纖維含量差異顯著（P ≤0.5），在第56 天分別下降了0.33 %和7.69 %；H3組和對照無明顯差異。

添加復合芽孢桿菌H1 組在第28 天和對照組的酸性洗滌纖維含量差異顯著（P ≤0.5），下降了8.05%，H2、H3 組在桑葉發(fā)酵期間酸性洗滌纖維含量變化和對照組無明顯差異。 在第56 天時，添加復合芽孢桿菌H1、H2 和 H3 的試驗組的酸性洗滌纖維含量和對照組并無顯著差異。

2.3.2 復合芽孢桿菌對桑葉粗脂肪的影響 隨著青貯時間的延長， 添加復合芽孢桿菌的樣品粗脂肪含量均呈下降趨勢。

由表3 可知，桑葉青貯發(fā)酵過程中，添加復合芽孢桿菌H1 組在第28、56 天和對照組的粗脂肪含量差異顯著（P ≤ 0.5），分別下降了5.77 %和5.81 %；H2 組在第28 天和對照組的粗脂肪含量差異顯著（P ≤ 0.5），下降了 6.70 %；H3 組在第28、56 天和對照組的粗脂肪含量差異顯著 （P ≤0.5），分別下降了 15.99 %和 20.99%。 其中，H3 組的粗脂肪含量在第56 天下降幅度最大， 只占（5.884±0.003）%。

表3 復合芽孢桿菌對桑葉青貯過程中粗脂肪的影響 %

2.3.3 復合芽孢桿菌對桑葉粗蛋白質的影響 隨著青貯時間的延長， 添加復合芽孢桿菌的樣品粗蛋白質含量均有增加。

由表4 可知，桑葉青貯發(fā)酵過程中，添加復合芽孢桿菌H1 組和H2 組從第7 天開始均和對照組的粗蛋白質含量差異顯著（P ≤ 0.5），在第56天分別增加8.97 %和7.24 %；H3 組在第7 天、28天和對照組無明顯差異，在第56 天和對照組的粗蛋白質含量差異顯著（P ≤ 0.5），增加了3.73 %。因此，H1、H2 和 H3 組的粗蛋白質含量在第 56 天都有所增加，分別為（21.861±0.120）%、（21.515±0.059）%和（20.810±0.140）%。

表4 復合芽孢桿菌對桑葉青貯過程中粗蛋白質的影響 %

3 討論

3.1 芽孢桿菌對桑葉發(fā)酵的影響 芽孢桿菌是一類好氧細菌，兼性厭氧，代謝為嚴格的呼吸或發(fā)酵代謝。芽孢桿菌能夠產生淀粉酶、脂肪酶等多種消化酶，提高飼料利用率，而且進入動物體內后能夠消耗宿主腸道內的氧氣，抑制病原菌生長，調節(jié)腸道菌群的平衡（張劍偉，2019；徐海燕，2006）。

玉米青貯飼料發(fā)酵過程中添加枯草芽孢桿菌能夠提高粗蛋白質含量（Shi，2017）。 采用枯草芽孢桿菌、米曲霉、釀酒酵母、植物乳桿菌混合發(fā)酵桑葉， 能夠提高桑葉蛋白質利用率 （任元元，2016）。 朱佳文（2020）研究發(fā)現，添加枯草芽孢桿菌能夠使青貯桑葉中的粗纖維和粗脂肪的含量有所下降，使發(fā)酵品質得到一定程度的改善。

3.2 添加復合芽孢桿菌對桑葉發(fā)酵營養(yǎng)成分的影響 桑葉青貯發(fā)酵過程中， 試驗組和對照組的pH 變化沒有明顯的差異，說明添加復合芽孢桿菌H1、H2 和 H3 組對桑葉發(fā)酵 pH 的影響不大。 粗纖維、 粗脂肪和粗蛋白質等指標的檢測可用于評價青貯飼料的營養(yǎng)性質 （馮懷蓉，2006； 黃榮生，1984）。 桑葉青貯發(fā)酵過程中，隨著青貯時間的延長，添加復合芽孢桿菌H1、H2 和 H3 組的樣品粗纖維、 中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均呈下降趨勢，說明枯草芽孢桿菌/地衣芽孢桿菌都具有降解纖維的作用。在青貯發(fā)酵的第56 天，H2 組的粗纖維含量和中性洗滌纖維含量下降幅度最大，分別占（12.217±0.039）%和（16.976±0.234）%。 而H2 組中的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌量的添加比例為1：4， 說明地衣芽孢桿菌分解纖維的能力可能更強。隨著青貯時間的延長，添加復合芽孢桿菌的樣品粗脂肪含量均有下降趨勢。 說明枯草芽孢桿菌/地衣芽孢桿菌都具有分解脂肪的作用。復合芽孢桿菌H3 組的粗脂肪含量在第56 天下降幅度最大，只占（5.884±0.003）%。 而 H3 組中的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌量的添加比例為4：1， 說明枯草芽孢桿菌分解脂肪的能力可能更強。 隨著青貯時間的延長， 添加復合芽孢桿菌的樣品粗蛋白質含量均有增加。 在第56 天時，H1、H2 和H3 組粗蛋白質含量都有所增加， 分別為（21.861±0.120）%、（21.515±0.059）%和 （20.810±0.140）%， 說明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌都具有提高青貯桑葉蛋白質含量的能力。

4 結論

桑葉青貯發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌/地衣芽孢桿菌都具有降解纖維、分解脂肪、提高粗蛋白質含量的能力，其中，地衣芽孢桿菌分解纖維的能力可能相對較強， 枯草芽孢桿菌分解脂肪的能力可能相對較強， 不同比例的復合芽孢桿菌提高青貯桑葉蛋白質含量的能力相當， 具有提高飼料營養(yǎng)品質的效果。