趙霞

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南鄭州 450004）

乳腺癌為全球范圍內(nèi)女性常見的惡性腫瘤，約占所有女性惡性腫瘤的22%，每年全球有50 余萬女性死于乳腺癌［1］。三陰性乳腺癌為特殊亞型乳腺癌類型，是指孕激素受體（PR）、雌激素受體（ER）及人表皮生長因子受體2（HER-2）均為陰性的乳腺癌類型，常發(fā)于年輕女性，大部分均屬基底細(xì)胞樣乳腺癌，細(xì)胞同源性高，組織分化程度差，對(duì)內(nèi)分泌及分子靶向治療不敏感，預(yù)后差，病死率高［2］。在分子及遺傳學(xué)方面，惡性腫瘤系基因表達(dá)調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果，其病變過程包括抑癌基因失活及原癌基因激活，而明確三陰性乳腺癌腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)基因，并阻斷靶基因表達(dá)，則可為其靶向治療提供指導(dǎo)。miRNA 為真核細(xì)胞內(nèi)分布的微小內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 對(duì)多類腫瘤相關(guān)基因表達(dá)均存在一定的負(fù)調(diào)節(jié)作用，在惡性腫瘤發(fā)病及進(jìn)展中有重要作用［3］。miRNA-21 是目前研究較多的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNA，在胃癌、肺癌中均可見miRNA-21高表達(dá)［4-5］，且體外試驗(yàn)證實(shí)，miRNA-21 與癌細(xì)胞生長及凋亡均存在密切聯(lián)系［6］。miRNA-210 則為與食管癌、尿路上皮細(xì)胞癌發(fā)病密切相關(guān)癌基因，位于染色體11p15.5 上，可降低DNA 的修復(fù)能力，促進(jìn)腫瘤新生血管生成［7］。但對(duì)miRNA-21、miRNA-210 與三陰性乳腺癌發(fā)病的關(guān)系尚未明確。基于此，為明確miRNA-21、miRNA-210 在三陰性乳腺癌患者血清中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)對(duì)河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的64 例三陰性乳腺癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2015 年5 月至2017 年7 月河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的64 例三陰性乳腺癌患者作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為三陰性乳腺癌，且符合國際抗癌聯(lián)盟（UICC）相關(guān)分期標(biāo)準(zhǔn)，為Ⅰ～Ⅳ期患者；年齡>18 歲；入組前均未接受任何治療；病例及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院3 個(gè)月內(nèi)有激素依賴史者；合并其他惡性腫瘤者；合并心、肝、腎肺器質(zhì)性功能障礙者；合并嚴(yán)重精神疾病者；合并自身免疫性疾病者；合并全身代謝紊亂者；采集血樣前已接受放化療或靶向治療者；妊娠或哺乳期女性；病例資料不完整者?；颊吣挲g22～73 歲，平均（42.6±5.7）歲；月經(jīng)狀況：絕經(jīng)前43 例，絕經(jīng)后21 例；臨床分期：Ⅰ期4 例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期24 例，Ⅳ期10例。選擇同期來醫(yī)院體檢的40 例正常健康女性作為對(duì)照組，均經(jīng)體格檢查心肝腎肺功能正常，無乳腺癌家族病史。對(duì)照組年齡21～69 歲，平均（41.9±6.3）歲；月經(jīng)狀況：絕經(jīng)前27 例，絕經(jīng)后13 例。

1.2 主要材料與儀器

RNA 抽提試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒、miRNA cDNA 合成試劑盒（均購自美國Invitrogen 公司），Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自大連寶生物工程公司），引物設(shè)計(jì)及合成（上海生工生物工程股份有限公司）；7900HT 型熒光定量PCR 儀（購自美國ABI 公司），Allegra X-15R高速冷凍離心機(jī)（購自美國Beckman Coulter 公司），-80℃超低溫冰箱（購自中國海爾電器公司），紫外分光光度計(jì)（購自德國Eppendorf 公司），倒置顯微鏡（購自日本Olympus 公司）。

1.3 方法

①血清miRNA-21、miRNA-210 測定。病例組入院次日采集外周空腹靜脈血6 mL，對(duì)照組體檢當(dāng)日采集空腹靜脈血6 mL，室溫靜置，3 500 r/min離心10 min 后分離血清，嚴(yán)格參照RNA 抽提試劑盒使用說明提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 模板1 μL+5×RT 緩沖液5 μL+dNTP 0.75 μL+RNA 酶抑制劑0.25 μL+反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL+去離子水補(bǔ)足至20 μL，反轉(zhuǎn)錄條件：16℃30 min，42℃30 min，75℃15 min，獲得cDNA 產(chǎn)物；采用RT-PCR 法測定miRNA-21、miRNA-210 表達(dá)量，應(yīng)用RT-PCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，U6 為內(nèi)參，上游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGCAT-3'，下游：5'-GGGTGGAATACATTGGAACATGT-3'；miRNA-21上游：5'-GTGCAAGCGAAATTAAGGGA-3'，下游：5'-CTGCACCACCTTTCTTTGGT-3'；miRNA-210 上游：5'-ATTATACAATAG-TGCAGGGTCCGAGGTATT-3'，下游；5'-TAAAATATTACTGTGCGTGTGACAGC GG-3'；反應(yīng)體系：cDNA 產(chǎn)物2 μL+miRNA qPCR Mix 10 μL+miRNA-21/miRNA-210 上下游引物各1 μL+雙蒸水補(bǔ)足至20 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性60 s，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸40 s，共50 個(gè)循環(huán)，均設(shè)2 復(fù)孔，獲得樣品RT-PCR 曲線，獲取目的基因循環(huán)閾值（Ct 值），血清miRNA-21、miRNA-210 相對(duì)表達(dá)量參照2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算。②臨床病理資料收集。均收集所有病例組患者臨床病理資料，包括年齡、絕經(jīng)狀況、腫瘤直徑、病理分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，分析血清miRNA-21、miRNA-210 與三陰性乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，并以多重線性回歸分析miRNA-21、miRNA-210 與三陰性乳腺癌臨床病理的關(guān)系，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組、對(duì)照組血清miRNA-21、miRNA-210 表達(dá)比較

病例組血清miRNA-21、miRNA-210 相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1 與圖1、2。

2.2 三陰性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑三陰性乳腺癌患者miRNA-21、miRNA-210 相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織分化程度為低分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 相對(duì)表達(dá)量高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織分化程度為中高分化及未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表1 病例組、對(duì)照組血清miRNA-21、miRNA-210 表達(dá)比較 （）

表1 病例組、對(duì)照組血清miRNA-21、miRNA-210 表達(dá)比較 （）

圖1 兩組miRNA-21 表達(dá)量比較

圖2 兩組miRNA-210 表達(dá)量比較

表2 三陰性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 （）

表2 三陰性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 （）

2.3 miRNA-21、miRNA-210 與臨床病理參數(shù)關(guān)系多元逐步回歸分析

納入單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)據(jù)進(jìn)入多元逐步回歸分析方程，結(jié)果顯示：miRNA-21、miRNA-210 均為三陰性乳腺癌患者臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素（P<0.05），見表3。

表3 miRNA-21、miRNA-210 與臨床病理參數(shù)關(guān)系多元逐步回歸分析

3 討論

miRNA 為一類內(nèi)源性、微小型非編碼單鏈RNA 分子，調(diào)節(jié)多種生物學(xué)信號(hào)通路，可與靶基因互補(bǔ)點(diǎn)位配對(duì)結(jié)合，影響靶基因轉(zhuǎn)錄，影響miRNA 降解及蛋白質(zhì)合成［8］。近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 異常表達(dá)可能參與任一惡性腫瘤形成過程，包括結(jié)腸癌、食管癌、肺癌等［9-10］，低表達(dá)miRNA 可能存在一定的抑癌基因作用，而高表達(dá)miRNA 則存在癌基因作用，體內(nèi)miRNA 調(diào)節(jié)紊亂可能是惡性腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。三陰性乳腺癌為特殊亞型乳腺癌，發(fā)病年齡年輕，且惡性程度高，組織分化程度低，大部分臨床分期較晚，常伴腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，較一般亞型乳腺癌侵襲性高，病情進(jìn)展速度快，復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率明顯高于其他類型乳腺癌［11］。且對(duì)化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療敏感度低，預(yù)后差。目前尚未完全明確三陰性乳腺癌發(fā)病的機(jī)制，隨著醫(yī)學(xué)分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到miRNA 在乳腺癌發(fā)病中可能存在一定的調(diào)控作用［12］。

miRNA-21 定位于17q23.2，位于液泡膜蛋白基因編碼區(qū)，文獻(xiàn)報(bào)道，宮頸癌、大腸癌、胰腺癌等多種腫瘤標(biāo)本及細(xì)胞系內(nèi)均可檢出miRNA-21異常高表達(dá)，認(rèn)為miRNA-21 為公認(rèn)致癌性miRNA，其過度表達(dá)可促進(jìn)腫瘤新生血管生成［13-14］。楊晨等［15］指出，miRNA-21 在腫瘤化療藥物敏感性存在一定的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA-21 表達(dá)水平上升可影響抗癌復(fù)合物效能［16］。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA-21 表達(dá)與惡性腫瘤侵襲性有關(guān)，隨腫瘤惡性程度的上升，miRNA-21 表達(dá)水平上調(diào)［17］。本研究采用RT-PCR法測定三陰性乳腺癌與正常健康人血清miRNA-21水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組miRNA-21 水平明顯高于正常健康人，提示miRNA-21 異常表達(dá)可能參與三陰性乳腺癌的發(fā)病過程。同時(shí)，對(duì)miRNA-21 與三陰性乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，臨床分期越晚、組織學(xué)分級(jí)越低且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌患者血清miRNA-21 相對(duì)表達(dá)量越高，提示miRNA-21 異常表達(dá)與三陰性乳腺癌生物學(xué)行為存在密切聯(lián)系，高表達(dá)miRNA-21 可能參與三陰性乳腺癌癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程，且與患者病情進(jìn)展存在緊密關(guān)聯(lián)。

miRNA-210 則為近年來發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移有關(guān)的miRNA，其為細(xì)胞缺氧應(yīng)答的關(guān)鍵分子，參與血管內(nèi)皮生長因子所介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程［18］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-210 參與乏氧細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)節(jié)，持續(xù)高表達(dá)miRNA-210 可調(diào)節(jié)缺氧條件下癌細(xì)胞線粒體功能，促進(jìn)乏氧癌細(xì)胞生長［19］。ZHU 等［20］表示，miRNA-210 可通過調(diào)節(jié)纖維母細(xì)胞生長因子受體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)miRNA-210可通過靶向定位乙型肝炎病毒基因促使病毒復(fù)制，造成持續(xù)性感染［21］。張雙鶴等［22］指出，乳腺癌細(xì)胞株miRNA-210 過表達(dá)與癌細(xì)胞乏氧分?jǐn)?shù)有關(guān)，miRNA-210 高表達(dá)乳腺癌患者預(yù)后通常較差。本研究發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌患者血清miRNA-210 相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常健康人，且進(jìn)行病理參數(shù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，miRNA-210 表達(dá)受三陰性乳腺癌病理分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，提示miRNA-210 在三陰性乳腺癌血管形成、癌細(xì)胞存活、DNA 修復(fù)等過程均發(fā)揮一定的作用，同時(shí)可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，可將其作為三陰性乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，三陰性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常健康人，且其表達(dá)量受三陰性乳腺癌臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，臨床分期越晚、組織分化程度越低且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 表達(dá)水平越高。