林碧琦，孟艷秋

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

積雪草酸(asiatic acid，AA)又名亞細(xì)亞酸，存在于丁龍腦香科植物龍腦香的樹脂和揮發(fā)油巾中，也可由傘形科植物積雪草中的積雪草苷水解而得，是一種五環(huán)三萜類化合物，具有烏蘇烷型結(jié)構(gòu)，不溶于水，易溶于DMF、THF等有機(jī)溶劑[1-3].積雪草酸具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗抑郁、保護(hù)肝臟，以及抗炎等作用[4-7].有研究發(fā)現(xiàn)，對積雪草酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可以提高其抗腫瘤活性.Gon?alves[8]等通過對積雪草酸的A環(huán)進(jìn)行改造，得到了化合物1、2，并且選用HT-29和HeLa細(xì)胞系評估其抗腫瘤活性，結(jié)果顯示目標(biāo)化合物的活性優(yōu)于母體積雪草酸.Huang等[9]將積雪草酸C-2、C-3、C-23位羥基改造為乙酰氧基，在C-28位引入不同的氨基膦酸酯，并采用MTT法檢測化合物對癌細(xì)胞的抑制活性，結(jié)果表明該化合物與母體積雪草酸相比抗腫瘤活性明顯提高.基于課題組前期工作積累[10-12]，筆者以積雪草酸為先導(dǎo)化合物進(jìn)行一系列結(jié)構(gòu)改造，提高積雪草酸抗腫瘤活性.

由于積雪草酸水溶性不好、生物利用度低等因素，限制了其在抗腫瘤方面的應(yīng)用.筆者在保留積雪草酸五環(huán)三萜骨架的基礎(chǔ)上，以積雪草酸為先導(dǎo)化合物對其A環(huán)上的3個(gè)羥基、C-12位不飽和雙鍵，以及C-28位的羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與改造，設(shè)計(jì)合成了8個(gè)積雪草酸衍生物，以期得到活性更高的化合物.

1 儀器與試劑

Büchi B-540熔點(diǎn)測定儀,Büchi公司；Bruker ARX-300型核磁共振分析儀，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，Bruker公司；積雪草酸，純度95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；柱層析色譜用200～300目硅膠，薄層色譜用GF254，青島海洋化工廠，顯色劑為體積分?jǐn)?shù)分?jǐn)?shù)10%的硫酸乙醇溶液，實(shí)驗(yàn)室自制；活性測試所用的RPMI-1640培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、蛋白酶 K(proteinase K)和小牛血清蛋白(BSA)，上海圖赫實(shí)業(yè)有限公司；活性測試用人癌細(xì)胞HepG2和A549，沈陽藥科大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室；陽性對照物吉非替尼(Gefitinib)和阿霉素(Adriamycin)，阿斯利康制藥有限公司.所有試劑均為分析純或化學(xué)純.

2 合成路線

目標(biāo)化合物的合成路線如圖1所示.

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route of target compound

3 目標(biāo)化合物的合成

3.1 2-羥基-3β，23-O-異亞丙基-12-烯-28-羧酸的合成(AA-1)

取AA(100 mg 0.19 mmol)充分溶解在20 mL 的DMF中，依次加入對甲基苯磺酸(17.0 mg，0.10 mmol)和2，2-二甲氧基丙烷(0.5 mL，2.0 mmol)，室溫下反應(yīng)，TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn)[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1].用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaOH調(diào)節(jié)pH為7～8，用乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取3次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸餾得白色固體AA-1，產(chǎn)率為64.2%.

3.2 2-羰基-3β，23-O-異亞丙基-12-烯-28-羧酸的合成(AA-2)

取AA-1(100 mg，0.19 mmol)置于50 mL茄形瓶中，溶于10 mL二氯甲烷中，加入負(fù)載硅膠的重鉻酸吡啶鎓鹽(450 mg)，室溫反應(yīng)2 h，TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn)[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1].反應(yīng)結(jié)束后，抽濾除去硅膠，乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取3次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸餾得白色固體AA-2，產(chǎn)率為72.5%.

3.3 2-肟基-3β，23-O-異亞丙基-12-烯-28-羧酸的合成(AA-3)

將中間產(chǎn)物AA-2(100 mg，0.18 mmol)在吡啶中完全溶解，加入15 mg鹽酸羥胺，在115 ℃下回流1.5 h，TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)結(jié)束后，加入25 mL水?dāng)嚢?0 min，析出白色固體，減壓抽濾，得到化合物AA-3，產(chǎn)率73.2%.

3.4 2-肟基-3β，23-O-異亞丙基-12，13-二羥基-28-乙酯的合成(Ⅰ1)

將中間體AA-3(100 mg，0.18 mmol)溶解在DMF(20 mL)中，依次加入K2CO3(70 mg，0.5 mmol)和溴乙烷(0.2 mL)，室溫反應(yīng)6 h，TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn).乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取3次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸除溶劑，得白色固體AA-4-1.使用CH2Cl2(10 mL)溶解中間產(chǎn)物AA-4-1，加入間氯過氧苯甲酸(75 mg 0.44 mmol)，在室溫條件下反應(yīng)8 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn).用二氯甲烷和飽和食鹽水反復(fù)萃取3次，然后用飽和NaHCO3洗滌至中性，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除得到白色固體.白色固體用10 mL氯仿溶解，2 mL濃鹽酸攪拌2 h，TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn).用飽和食鹽水和CHCl3萃取3次，加入少量NaHCO3溶液洗至中性，減壓，蒸除溶劑，粗品經(jīng)過柱色譜純化，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1，得到化合物Ⅰ1，產(chǎn)率為30.5%.mp 224.2～228.8 ℃.ESI-MS(m/z):604.1(M+H)+.1H-NMR(300 MHz，CDCl3),δ:11.40(s，1H，NOH)，4.07(t，J=7.9 Hz，2H，COOCH2CH3)，3.88(s，1H，H-3)，3.60(d，2H，J=9.6 Hz，H-23)，3.49(s，1H，H-12)，1.19～1.11(m，3H，COOCH2CH3)，1.09(s，3H，CH3)，1.07(s，3H，CH3)，0.91(d，J=8.8 Hz，3H，CH3)，0.88(s，3H，CH3)，0.85(s，3H，CH3)，0.78(s，3H，CH3).

3.5 2-肟基-3β，23-O-異亞丙基-12，13-二羥基-28-丙酯的合成(Ⅰ2)

按照制備Ⅰ1的方法，將中間體AA-3(100 mg，0.18 mmol)與溴丙烷(0.2 mL)反應(yīng)，粗品經(jīng)過柱色譜純化，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1，得到化合物Ⅰ2，產(chǎn)率為27.6%.mp 227.4～232.6 ℃.ESI-MS(m/z):617.7(M+H)+.1H-NMR(300 MHz，CDCl3),δ:11.39(s，1H，NOH)，4.42(t，J=7.9 Hz，2H，COOCH2CH2CH3)，3.85(s，1H，H-3)，3.59(d，2H，J=9.6 Hz，H-23)，3.47(s，1H，H-12)，1.71～1.55(m，2H，COOCH2CH2CH3)，1.25(t，J=7.1 Hz，3H，COOCH2CH2CH3)，1.23(s，3H，CH3)，1.07(s，3H，CH3)，0.94(d，J=8.8 Hz，3H，CH3)，0.87(s，3H，CH3)，0.85(s，3H，CH3)，0.81(s，3H，CH3).

3.6 2-肟基-3β，23-O-異亞丙基-12，13-二羥基-28-丁酯的合成(Ⅰ3)

按照制備Ⅰ1的方法，將中間體AA-3(100 mg，0.18 mmol)與溴丁烷(0.2 mL)反應(yīng)，粗品經(jīng)過柱色譜純化，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1，得到化合物Ⅰ3，產(chǎn)率為28.6%.mp 231.3～235.9 ℃.ESI-MS(m/z):631.8(M+H)+.1H-NMR(300 MHz，CDCl3),δ:11.43(s，1H，NOH)，4.22(t，J=7.9 Hz，2H，COOCH2CH2CH2CH3)，3.91(s，1H，H-3)，3.59(d，2H，J=9.6 Hz，H-23)，3.47(s，1H，H-12)，1.84(t，J=7.1 Hz，3H，COOCH2CH2CH2CH3)，1.77～1.34(m，4H，COOCH2(CH2)2CH3)，1.29(s，3H，CH3)，1.08(d，J=8.8 Hz，3H，CH3)，0.96(s，3H，CH3)，0.87(s，3H，CH3)，0.75(s，3H，CH3).

3.7 2-肟基-3β，23-O-異亞丙基-121，3-二羥基-28-戊酯的合成(Ⅰ4)

按照制備Ⅰ1的方法，將中間體AA-3(100 mg，0.18 mmol)與溴戊烷(0.2 mL)反應(yīng)，粗品經(jīng)過柱色譜純化，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1，得到化合物Ⅰ4，產(chǎn)率為26.7%.mp 235.7～239.9 ℃.ESI-MS(m/z):646.2(M+H)+.1H-NMR(300 MHz，CDCl3),δ:11.43(s，1H，NOH)，4.10(t，J=7.9 Hz，2H，COOCH2CH2CH2CH2CH3)，3.89(s，1H，H-3)，3.58(d，2H，J=9.6 Hz，H-23)，3.44(s，1H，H-12)，1.88～1.41(m，4H，COOCH2(CH2)2CH3)，1.31(s，3H，CH3)，1.13(s，3H，CH3)，1.10(d，J=8.8 Hz，3H，CH3)，0.98(t，J=7.1 Hz，3H，COOCH2CH2CH2CH2CH3)，0.91(s，3H，CH3)，0.88(s，3H，CH3).

3.8 N-(2-肟基-3β，23-O-二異亞丙基-12，13-羥基-28酰)-苯胺的合成(Ⅰ5)

將化合物AA-3(100 mg，0.18 mmol)溶解在CH2Cl2(10 mL)中，滴加草酰氯(0.80 mmol)反應(yīng)24 h，減壓蒸除溶劑，加入2 mL環(huán)己烷，蒸除環(huán)己烷，反復(fù)3次，得到化合物AA-5，然后加入CH2Cl2(10 mL)溶解后，再加入少量三乙胺調(diào)節(jié)酸堿度至微堿性(pH=9～10)，在此基礎(chǔ)上加入苯胺(0.40 mmol)，TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn).減壓，蒸除CH2Cl2，加入10 mL水和少量稀鹽酸調(diào)至酸性(pH=3～4)，減壓抽濾，用蒸餾水洗濾餅至中性.用硅膠柱色譜進(jìn)行純化，洗脫劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1，得白色固體AA-6-1，產(chǎn)率為46.5%.將CH2Cl2(10 mL)溶解中間產(chǎn)物AA-6-1后，加入間氯過氧苯甲酸(75 mg,0.44 mmol)，在室溫條件下反應(yīng)8 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn).用二氯甲烷和飽和食鹽水反復(fù)萃取3次，然后用飽和NaHCO3洗滌至中性，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除得到白色固體.白色固體用10 mL氯仿溶解，2 mL濃鹽酸攪拌2 h，TLC檢測反應(yīng)終點(diǎn).用飽和食鹽水和CHCl3萃取3次，加入少量NaHCO3溶液洗滌至中性，減壓，蒸除溶劑，粗品經(jīng)過柱色譜純化，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=8∶1，得到化合物Ⅰ5，產(chǎn)率為28.9%.mp 220.3～222.1 ℃.ESI-MS(m/z):651.1(M+H)+.1H-NMR(300 MHz，CDCl3),δ:11.39(s，1H，NOH)，7.55～7.09(m，5H，NH(C6H5))，3.77(s，1H，H-3)，3.53(d，2H，J=9.6 Hz，H-23)，3.44(s，1H，H-12)，1.25(s，3H，CH3)，1.02(s，3H，CH3)，0.92(d，J=8.8 Hz，3H，CH3)，0.90(s，3H，CH3)，0.89(s，3H，CH3).

3.9 N-(2-肟基-3β，23-O-異亞丙基-12，13-二羥基-28-酰)-間硝基苯胺的合成(Ⅰ6)

按照制備Ⅰ5的方法，由中間體AA-3與間硝基苯胺(0.4 mmol)反應(yīng)得到粗品，粗品經(jīng)過柱色譜純化，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=8∶1，得到化合物Ⅰ6，產(chǎn)率為30.2%.mp 215.5～218.6 ℃.ESI-MS(m/z):695.2(M+H)+.1H-NMR(300 MHz，CDCl3),δ:11.41(s，1H，NOH)，8.39～7.41(m，4H，NH(C6H4)NO2)，3.66(s，1H，H-3)，3.53(d，2H，J=9.6 Hz，H-23)，3.47(s，1H，H-12)，1.04(s，3H，CH3)，1.02(s，3H，CH3)，0.90(d，J=8.8 Hz，3H，CH3)，0.89(s，3H，CH3)，0.89(s，3H，CH3).

3.10 N-(2-肟基-3β，23-O-異亞丙基-12，13-二羥基-28-酰)-間氟苯胺的合成(Ⅰ7)

按照制備Ⅰ5的方法，由中間體AA-3與間氟苯胺(0.4 mmol)反應(yīng)得到粗品.粗品經(jīng)過柱色譜純化，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=8∶1，得到化合物Ⅰ7，產(chǎn)率為27.1%.mp 213.5～214.9 ℃.1H-NMR(300 MHz，CDCl3),δ:11.43(s，1H，NOH)，7.24～6.82(m，4H，NH(C6H4)F)，3.90(s，1H，H-3)，3.56(d，2H，J=9.6 Hz，H-23)，3.46(s，1H，H-12)，1.42(s，3H，CH3)，1.27(s，3H，CH3)，1.08(s，3H，CH3)，1.04(s，3H，CH3)，0.96(s，J=8.8 Hz，3H，CH3)，0.75(d，3H，CH3).

3.11 N-(2-肟基-3β，23-O-異亞丙基-12，13-二羥基-28-酰)-嗎啡啉的合成(Ⅰ8)

按照制備Ⅰ5的方法，由中間體AA-3與嗎啡啉(0.4 mmol)反應(yīng)得到粗品.粗品經(jīng)過柱色譜純化，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=8∶1，得到化合物Ⅰ8，產(chǎn)率為29.3%.mp 216.3～218.7 ℃.1H-NMR(300 MHz，CDCl3),δ:11.46(s，1H，NOH)，4.52～4.32(m，8H，N(CH2)2(CH2)2O)，3.80(s，1H，H-3)，3.53(d，2H，J=9.6 Hz，H-23)，3.45(s，1H，H-12)，1.30(s，3H，CH3)，1.27(s，3H，CH3)，1.04(s，3H，CH3)，0.93(s，3H，CH3)，0.87(s，J=8.8 Hz，3H，CH3)，0.85(s，3H，CH3).

4 體外活性測試

為考察目標(biāo)化合物Ⅰ1～Ⅰ8的抗腫瘤活性，選取吉非替尼(Gefitinib)和阿霉素(Adriamycin)作為陽性對照物，人肝癌細(xì)胞(HepG2)和人肺癌細(xì)胞(A549)為腫瘤細(xì)胞，采用MTT法對目標(biāo)化合物進(jìn)行活性測試.將對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，埋于96孔板中，每孔160 μL，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.將待測藥品配制成不同質(zhì)量濃度(初始質(zhì)量濃度為1000 mg/L，稀釋后為400 mg/L、40 mg/L、4 mg/L、0.4 mg/L、0.04 mg/L)的藥液，各取20 μL加入96孔板內(nèi)，每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)平行孔.加藥完畢后，放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.72 h后，將孔板內(nèi)培養(yǎng)基吸出，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃培養(yǎng)3 h后，棄去上清液，每孔加100 μL的DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm下測光密度(OD)，通過IC50計(jì)算軟件計(jì)算所測化合物的IC50值.不同化合物對HepG2和A549的IC50值如表1所示.

表1 目標(biāo)化合物對HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞的活性抑制Table 1 Inhibitory effect of target compound on HepG2 cells and A549 cells

表1結(jié)果顯示：目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性均顯著提高，并優(yōu)于母體積雪草酸.化合物Ⅰ4、Ⅰ6對HepG2細(xì)胞和A549表現(xiàn)出良好的抑制活性.化合物Ⅰ4、Ⅰ6對HepG2細(xì)胞的IC50值分別是7.13、7.09 μmol/L，對A549的IC50值分別是8.02、6.43μmol/L，較吉非替尼強(qiáng)，較阿霉素弱.從表1可知通過改造積雪草酸A環(huán)上的3個(gè)羥基，C-28位羧基以及將C-12位雙鍵打開可以顯著提高積雪草酸的生物活性.

5 結(jié) 論

筆者設(shè)計(jì)合成了8種積雪草酸衍生物.體外抗腫瘤活性結(jié)果顯示：化合物Ⅰ4、Ⅰ6的抗腫瘤活性明顯優(yōu)于其他化合物；在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，化合物活性Ⅰ4>Ⅰ3>Ⅰ2>Ⅰ1，說明酯鏈越長，抗腫瘤活性越高；化合物Ⅰ5～Ⅰ8活性明顯強(qiáng)于AA，且強(qiáng)于化合物Ⅰ3、Ⅰ2、Ⅰ1，說明C-28位引入胺基時(shí)抗腫瘤活性提高.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對積雪草酸進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化具有一定的指導(dǎo)意義，為以后新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ).