丁明雪，鄔月嬌，梅 宇，孟艷秋

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是一種五環(huán)三萜類化合物，主要以游離或組合糖苷的形式存在于各種植物中，包括青葉膽、孕牛漆、灌木膽等植物[1-2]，齊墩果酸衍生物具有多種藥理活性，包括保肝抗炎、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等[3-7].近年來(lái)，孟艷秋課題研究小組開(kāi)展了齊墩果酸、積雪草酸、熊果酸等五環(huán)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)修飾及體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，并且通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，在對(duì)化合物與蛋白靶點(diǎn)結(jié)合的模擬和分析方面取得了一定的進(jìn)展[8-14].

靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體VEGFR的藥物會(huì)降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，消耗腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而抑制腫瘤血管生成和抑制腫瘤生長(zhǎng).研究表明，OA可以抑制腫瘤細(xì)胞中VEGFR的表達(dá)，是其抗腫瘤作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)[15].阿昔替尼(Axitinib)是由輝瑞公司開(kāi)發(fā)的靶向VEGFR小分子酪氨酸激酶抑制劑，用于晚期腎細(xì)胞癌癥患者[16-19].筆者利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)研究了阿昔替尼與VEGFR目標(biāo)蛋白(PDB編號(hào)：5ew3)之間的相互作用，由結(jié)果可知阿昔替尼結(jié)構(gòu)中的胺基片段與VEGFR蛋白的氨基酸殘基TYR1136形成氫鍵，并與目標(biāo)蛋白形成強(qiáng)大的結(jié)合力，且胺基是抗腫瘤作用的重要藥效團(tuán).筆者將孟艷秋研究小組提出的五環(huán)三萜化合物的結(jié)構(gòu)修飾與參與臨床研究的抗腫瘤化合物相結(jié)合，在齊墩果酸A環(huán)形成含氮雜環(huán)并將芳香胺活性基團(tuán)引入到C-28 位，設(shè)計(jì)合成了5個(gè)衍生物 Ⅰ1～Ⅰ5.使用Glide軟件對(duì)設(shè)計(jì)的化合物進(jìn)行基于分子對(duì)接的虛擬篩選，結(jié)果顯示VEGFR蛋白與化合物Ⅰ5的結(jié)合方式顯示出較強(qiáng)的結(jié)合能力.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 目標(biāo)化合物的合成路線

化合物的合成路線見(jiàn)圖1.

a 丙酮，瓊斯試劑，室溫 b 草酰氯，芳香胺，吡啶，1，2-二氯乙烷，室溫，4 h c 甲酸乙酯，叔丁醇鉀，二氯甲烷，室溫，10 h d 水合肼，無(wú)水乙醇，83 ℃回流4 h圖1 目標(biāo)化合物的合成路線Fig.1 Synthetic routes of the target compounds

1.2 目標(biāo)化合物的合成

1.2.1 3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-羧酸(OA-1) 的制備

取0.500 g OA(1.10 mmol)置于100 mL茄形瓶中，用50 mL丙酮將其充分溶解，在冰浴條件下滴加0.65 mL(5.78 mmol)瓊斯試劑，25 min后轉(zhuǎn)室溫反應(yīng)約2.5 h.滴加20 mL異丙醇淬滅45 min，減壓蒸除溶劑，用飽和食鹽水和乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，無(wú)水NaSO4干燥.粗制產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱色譜純化得0.474 g白色固體OA-1，產(chǎn)率95.6%，mp 221.6～222.9 ℃.

1.2.2 3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺(OA-2) 的制備

取OA-1(0.500 g，1.10 mmol)放入100 mL茄形瓶中，加入25 mL干燥的1，2-二氯乙烷溶解，冰浴條件下滴加草酰氯(0.47 mL，1.20 mmol)，40 ℃加熱并且回流，反應(yīng)約4 h，減壓蒸除溶劑，殘余物用10 mL環(huán)已烷洗滌3次.取苯胺溶解到30 mL二氯甲烷中，滴加制備的酰氯，放入0.10 g 4-二甲氨基吡啶和0.5 mL吡啶，室溫下反應(yīng)12 h.加入15 mL飽和食鹽水，用2 mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為3～4，分離有機(jī)層，飽和食鹽水和二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，無(wú)水NaSO4干燥.粗制品經(jīng)硅膠柱色譜純化得0.359 g淡黃色晶體OA-2，產(chǎn)率67.3%，mp 123.6～126.7 ℃.

1.2.3 2-羥亞甲基-3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺(OA-3)的制備

取OA-2(0.400 g，0.8 mmol)放入100 mL茄形瓶中，加入15 mL無(wú)水甲苯溶解，冰浴條件下加入0.20 g叔丁醇鉀，滴加1 mL甲酸乙酯，20 min后升為室溫反應(yīng)12 h.減壓蒸除溶劑，得淡黃色油狀固體，經(jīng)稀鹽酸洗滌，用飽和食鹽水和乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，無(wú)水NaSO4干燥.粗品用硅膠柱色譜純化得0.315 g淡黃色片狀固體OA-3，產(chǎn)率78.8%，mp 196.2～197.5 ℃.

1.2.4 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-苯胺(Ⅰ1)的制備

取OA-3(0.300 g，0.8 mmol)放入100 mL茄形瓶中，溶于20 mL無(wú)水乙醇，滴加0.2 mL水合肼，83 ℃冷凝回流4 h.減壓蒸除溶劑無(wú)水乙醇，再用乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取3次，合并有機(jī)相得到黃色澄明液體，減壓蒸除溶劑乙酸乙酯，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.173 g淡黃色固體Ⅰ1，產(chǎn)率57.7%，mp 183.5～184.7 ℃.

1.2.5 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-對(duì)甲氧基苯胺(Ⅰ2)的制備

根據(jù)Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-1(1.10 mmol)與對(duì)甲氧基苯胺(2.20 mmol)反應(yīng),最終粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.186 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ2，產(chǎn)率62.0%，mp 189.5～190.7 ℃.

1.2.6 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-間氟苯胺(Ⅰ3)的制備

根據(jù)Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-1(1.10 mmol)與間氟苯胺(2.20 mmol)反應(yīng),最終粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.166 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ3，產(chǎn)率55.3%，mp 191.5～192.7 ℃.

1.2.7 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-對(duì)硝基苯胺(Ⅰ4)的制備

根據(jù)Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-1(1.10 mmol)與對(duì)硝基苯胺(2.20 mmol)反應(yīng),最終粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.156 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ4，產(chǎn)率52.0%，mp 187.6～188.9 ℃.

1.2.8 N-[吡唑-齊墩果烷型-12-烯-28-酰]-間氯苯胺(Ⅰ5)的制備

根據(jù)Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-1(1.10 mmol)與間氯苯胺(2.20 mmol)反應(yīng),最終粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得0.193 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ5，產(chǎn)率64.3%，mp 192.1～193.7 ℃.

2 分子對(duì)接

使用Glide軟件(Maestro版11.5.011，MMshare版4.1.011、2018-1版)對(duì)設(shè)計(jì)的化合物進(jìn)行基于分子對(duì)接的虛擬篩選.用VEGFR作為靶點(diǎn)(PDB編號(hào)：5ew3)，從http://www.rcsb.org/pdb下載.Protein Preparation Wizard模塊用于蛋白結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備，例如添加氫，填充缺失的側(cè)鏈和去除結(jié)合口袋中水分子等.Receptor Gride Generation模塊用于生成受體格點(diǎn)文件.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的共結(jié)晶配體確定結(jié)合位點(diǎn)的位置，以超高精度(XP)模式進(jìn)行分子對(duì)接篩選，化合物Ⅰ1～Ⅰ5對(duì)接結(jié)果打分見(jiàn)表1.能量分?jǐn)?shù)的絕對(duì)值越大，結(jié)合能力越強(qiáng).由表1可以看出：化合物Ⅰ5與靶蛋白自身配體能量分?jǐn)?shù)幾乎一致，表現(xiàn)出與VEGFR有較強(qiáng)的結(jié)合能力，值得進(jìn)一步研究.通過(guò)對(duì)比阿昔替尼和化合物Ⅰ5與靶蛋白的對(duì)接圖(圖2、圖3) 發(fā)現(xiàn)阿昔替尼和化合物Ⅰ5與靶蛋白連有相同的疏水氨基酸殘基(關(guān)鍵氨基酸：TYR1136、ARG1126、LEU1140、ARG1124)，且胺基片段均與TYR1136產(chǎn)生氫鍵作用，初步判斷化合物Ⅰ5和阿昔替尼與靶蛋白具有相同的結(jié)合位點(diǎn).

表1 不同化合物與VEGFR的能量得分比較Table 1 Comparison of energy scores between different compounds and VEGFR

圖2 阿昔替尼與VEGFR活性位點(diǎn)的結(jié)合Fig.2 Binding of Axitinib to the active site of VEGFR

圖3 化合物Ⅰ5與VEGFR活性位點(diǎn)的結(jié)合Fig.3 Binding of compound Ⅰ5 to the active site of VEGFR

3 結(jié)果與討論

3.1 目標(biāo)化合物的表征

設(shè)計(jì)合成的5個(gè)新型齊墩果酸衍生物的結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、NMR確證，結(jié)果見(jiàn)表2、表3和表4.

表2 MS目標(biāo)化合物數(shù)據(jù)Table 2 MS target compound data

表3 1H-NMR目標(biāo)化合物數(shù)據(jù)Table 3 1H-NMR target compound data

表4 13C-NMR目標(biāo)化合物數(shù)據(jù)Table 4 13C-NMR target compound data

3.2 初步體外活性測(cè)試

采用MTT比色法測(cè)試合成的化合物初步體外抗腫瘤活性.以吉非替尼和阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[20]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5.由表5可知:目標(biāo)化合物對(duì)HepG2 和 MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，目標(biāo)化合物IC50值Ⅰ5>Ⅰ4>Ⅰ2>Ⅰ1>Ⅰ3.因此，OA在C-28位酰胺化結(jié)構(gòu)修飾時(shí)化合物會(huì)有更好的活性，其化合物Ⅰ5值得進(jìn)一步研究.

表5 目標(biāo)化合物對(duì)HEPG2和MCF-7細(xì)胞增殖的抑制活性Table 5 Inhibitory activity of the target compounds on the HepG2 and MCF-7 cells proliferation

3.3 VEGFR受體抑制實(shí)驗(yàn)

采用熒光偏振免疫分析法，對(duì)通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)模擬結(jié)合力較好且體外生物活性較好的化合物Ⅰ5進(jìn)行VEGFR受體抑制活性測(cè)試，通過(guò)GraphPad Prism 5計(jì)算得Ⅰ5在10 mg/L時(shí)的IC50值為3.57 μmol/L，結(jié)果表明化合物Ⅰ5對(duì)VEGFR蛋白具有較好的抑制作用.

4 結(jié) 論

筆者以O(shè)A為起始原料，使用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)對(duì)接模擬，將含氮雜環(huán)引入A環(huán)并在C-28位形成酰胺，合成了5種新的齊墩果酸衍生物，其結(jié)構(gòu)通過(guò)MS和NMR確證，且在人肝癌細(xì)胞(HepG2)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中均具有良好的生長(zhǎng)抑制活性，其中化合物Ⅰ5對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照物吉非替尼，說(shuō)明齊墩果酸A環(huán)引入吡唑環(huán)具有更好的抗腫瘤活性.VEGFR受體蛋白抑制實(shí)驗(yàn)表明化合物Ⅰ5對(duì)VEGFR受體表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性.該研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)齊墩果酸衍生物作為VEGFR受體抑制劑的研究具有一定的指導(dǎo)意義，為研發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物奠定良好的理論基礎(chǔ).