張蓬勃，宋艷玲

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是分布于自然界中的齊墩果烷型五環(huán)三萜類天然產(chǎn)物[1]，不僅具有良好的肝臟保護(hù)生物活性[2]、抗炎[3]、抗病毒[4-5]、降血糖[6]、降血脂[7]等，而且具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用[8].由于其分子結(jié)構(gòu)剛性強(qiáng)、水溶性差等原因，因此，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)修飾，以期得到具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的衍生物是現(xiàn)今主要的研究目的.肺癌、肝癌為常見(jiàn)惡性腫瘤，具有較高發(fā)病率和死亡率.本文以人肺癌細(xì)胞(A549)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)為生物模型，測(cè)試化合物的生物學(xué)活性.

咪唑環(huán)具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其能夠容易地與生物體內(nèi)蛋白受體和酶等形成氫鍵，因此，咪唑結(jié)構(gòu)作為一種優(yōu)良的化學(xué)骨架在藥學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究[9].研究發(fā)現(xiàn)，母核引入咪唑的化合物，其生物活性大幅提升，具有廣泛的生物活性，如作為質(zhì)子泵抑制劑、組胺受體拮抗劑、抗寄生蟲(chóng)、抗腫瘤等，在臨床應(yīng)用上具有良好的應(yīng)用前景.已上市的抗腫瘤藥物，如維利帕尼、達(dá)卡巴嗪、硫唑嘌呤等均具有咪唑活性片段(圖1).本文以齊墩果酸為原料，通過(guò)化學(xué)合成在A環(huán)引入咪唑結(jié)構(gòu)，28位結(jié)構(gòu)修飾合成Ⅰ1、Ⅱ1-2兩類齊墩果酸衍生物.

圖1 咪唑類已上市抗腫瘤藥物Fig.1 Imidazoles have been marketed as anti-tumor drugs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-600型核磁共振儀，美國(guó)Bruker公司；Büchi B-540熔點(diǎn)測(cè)定儀，瑞士Büchi公司；薄層色譜(GF-254)、柱色譜硅膠(200～300目)，青島海洋化工有限公司；齊墩果酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；芳香胺類藥品，上海麥克林化學(xué)試劑有限公司.其他溶劑和藥品均為分析純.

1.2 合成實(shí)驗(yàn)

OA衍生物的合成路線見(jiàn)圖2.

試劑和反應(yīng)條件:(a) 瓊斯試劑,丙酮,異丙醇,0 ℃; (b) 二氧化硒,乙酸,118 ℃; (c) 甲酰胺,100 ℃; (d) 碳酸鉀,碘甲烷,N,N-二甲基甲酰胺,室溫; (e) 草酰氯,芳香胺,室溫.圖2 OA衍生物的合成路線Fig.2 Synthetic route of OA derivatives

1.2.1 3-羰基-齊墩果酸(1)的制備

將齊墩果酸 OA(4.40 g，9.35 mmol)溶于100 mL丙酮中，冰浴下緩慢滴加Jones試劑11.5 mL，室溫下反應(yīng)2 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)完畢，加入130 mL異丙醇淬滅.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除部分溶劑，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌，水洗，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，甲醇重結(jié)晶得白色晶體化合物(1)4.15 g，產(chǎn)率95%，mp 186～187 ℃(文獻(xiàn)mp 185～186 ℃)[10].

1.2.2 2,3-二羰基-齊墩果酸(2)的制備

將3-羰基-齊墩果酸(4.15 g，8.87 mmol)溶于50 mL無(wú)水乙酸中，加入二氧化硒(0.118 g，1.07 mmol)回流24 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去乙酸溶劑，二氯甲烷萃取，飽和Na2CO3溶液洗滌，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物(2) 3.16 g，產(chǎn)率76.3%，mp 191～193 ℃.

1.2.3 A環(huán)并咪唑齊墩果酸(3)的制備

將2,3-二羰基-齊墩果酸(1.00g，2.14 mmol)溶于20 mL甲酰胺中，100 ℃下反應(yīng)4 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后，加入適量二氯甲烷稀釋，飽和NaCl溶液洗滌，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物(3) 0.66 g，產(chǎn)率66%，mp 232～235 ℃.

1.2.4 化合物Ⅰ1的制備

將A環(huán)并咪唑齊墩果酸(0.35 g，0.732 mmol)和無(wú)水碳酸鉀(0.253 g，1.83 mmol)溶于20 mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，攪拌下緩慢加入碘甲烷(0.208 g，1.46 mmol)，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后加水稀釋，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干溶劑，硅膠柱層析分離(200～300目，洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯)，得到白色固體產(chǎn)物化合物Ⅰ10.162 g，產(chǎn)率46.29%，mp 240～244 ℃.1H-NMR(600 MHz,DMSO)，δ:12.50 (s,1H),8.01 (s,1H),5.29 (s,1H),3.63 (s,3H),1.15 (s,3H),1.01 (s,3H),0.98 (s,3H),0.94 (s,3H),0.91 (s,3H),0.82 (s,3H),0.77 (s,3H).

1.2.5 化合物Ⅱ1～2的制備

1.2.5.1 化合物Ⅱ1的制備

將A環(huán)并咪唑齊墩果酸(0.30 g，0.627 mmol)溶于20 mL干燥二氯甲烷溶液中，冰浴條件下緩慢滴加草酰氯(0.399 g，3.14 mmol)，0.5 h后撤冰，40 ℃下反應(yīng)2～3 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后蒸發(fā)有機(jī)溶劑，干燥環(huán)己烷沖洗3次.將其溶于20 mL無(wú)水二氯甲烷中，緩慢滴入溶于10 mL苯胺(0.293 g，3.14 mmol)的二氯甲烷溶液，加入干燥吡啶(0.5 mL)、DMAP(0.001 4 g，0.04 mmol)在25～30 ℃條件下反應(yīng)12 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后二氯甲烷萃取，蒸餾水洗滌，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸干，硅膠柱色譜分離，甲醇/二氯甲烷洗脫，得白色固體化合物 Ⅱ10.131 g，產(chǎn)率43.6%，mp 211～212 ℃.1H-NMR (600 MHz,DMSO)，δ:12.52 (s,1H),9.29 (s,1H),8.00 (s,1H),7.74～7.72 (m,2H),7.41～7.37 (m,3H),5.31 (s,1H),1.16 (s,3H),1.01 (s,3H),0.98 (s,3H),0.93 (s,3H),0.90 (s,3H),0.78 (s,3H),0.76 (s,3H).

1.2.5.2 化合物Ⅱ2的制備

實(shí)驗(yàn)步驟同化合物Ⅱ1的制備，A環(huán)并咪唑齊墩果酸(0.30 g，0.627 mmol)與對(duì)氟苯胺(0.349 g，3.14 mmol)反應(yīng)得到淡黃色固體化合物Ⅱ20.118 g，產(chǎn)率39.3%，mp 215～218 ℃.1H-NMR (600 MHz,DMSO)，δ:12.52 (s,1H),9.52 (s,1H),8.00 (s,1H),7.76～7.73 (m,2H),7.39～7.37 (m,2H),5.34 (s,1H),1.14 (s,3H),1.01 (s,3H),0.98 (s,3H),0.94 (s,3H),0.90 (s,3H),0.79 (s,3H),0.76 (s,3H).

2 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

以維利帕尼為陽(yáng)性對(duì)照藥，維利帕尼結(jié)構(gòu)中含有咪唑活性片段，其抑制腫瘤細(xì)胞活性具有參考意義.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌細(xì)胞(A549)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)，以每孔5×103個(gè)接種于96孔板內(nèi)，每組3個(gè)復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后備用.待細(xì)胞貼壁后,分別加入待測(cè)化合物、OA和維利帕尼，藥品濃度為10 μmol/L，空白組為陰性對(duì)照組，維利帕尼為陽(yáng)性對(duì)照組.培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h.加入MTT溶液(5 g/mL，20 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去每孔上清液，加入二甲基亞砜200 μL，震蕩器上震蕩5 min.然后用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)OD值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值，計(jì)算各組細(xì)胞的IC50.抑制率=[(對(duì)照組OD值-藥物組OD值)/對(duì)照組OD值]×100%.化合物抗腫瘤活性和抑制率見(jiàn)表1.

表1 化合物對(duì)A549和HepG2細(xì)胞株的抗腫瘤活性Table 1 Anti-tumor activity of the target compounds on A549 and HepG2 cell lines

表1中數(shù)據(jù)顯示，化合物Ⅱ2對(duì)A549、HepG2細(xì)胞具有良好的生長(zhǎng)抑制作用，取代基苯環(huán)上取代官能團(tuán)的改變，使其抑制率具有差別.引入氟原子，其活性增強(qiáng)(22.32 μmol/L)，無(wú)取代基苯環(huán)活性較低(27.61 μmol/L).設(shè)計(jì)合成的3個(gè)化合物均優(yōu)于原料OA.

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)并合成了3個(gè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的齊墩果酸衍生物.活性試驗(yàn)表明，設(shè)計(jì)合成的化合物對(duì)A549和HepG2腫瘤細(xì)胞均有明顯的抑制生長(zhǎng)作用.這表明引入咪唑活性片段提高了其抗腫瘤活性，與設(shè)計(jì)思路相符，尤其是化合物Ⅱ2對(duì)A549、HepG2細(xì)胞具有良好的抑制作用.以維利帕尼為陽(yáng)性對(duì)照藥物，進(jìn)一步說(shuō)明了咪唑活性基團(tuán)的抗腫瘤活性優(yōu)點(diǎn).由于實(shí)驗(yàn)條件有限，對(duì)于咪唑活性基團(tuán)的研究不足，對(duì)于該類化合物構(gòu)效關(guān)系正在進(jìn)一步研究.本研究結(jié)果對(duì)齊墩果酸衍生物的進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)具有一定的指導(dǎo)意義.