范恩帝 蔣夢迎 馮敏雪 陳葉福 肖冬光 郭學武，2

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點實驗室，宜賓 644000）

中國是白酒的主要生產(chǎn)國和消費國，白酒市場需求量巨大，2010-2016年白酒年平均產(chǎn)量接近1.0×107t，最近3年雖有下降，但也接近千萬噸（數(shù)據(jù)來源于國家統(tǒng)計局），而一般情況下生產(chǎn)1 t白酒會產(chǎn)生3 t左右酒糟廢物［1］，因此，我國白酒每年所產(chǎn)酒糟量巨大。白酒糟中還含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸等營養(yǎng)成分［2-3］，但是數(shù)量如此龐大且營養(yǎng)豐富的白酒糟卻難以利用，一方面是由于其水分含量高，酸度高，難以保存，另一方面是由于其中稻殼占比高等因素所導致的纖維含量高［2，4］難利用。所以其再利用研究具有重要意義，不僅可以實現(xiàn)傳統(tǒng)白酒綠色生產(chǎn)，同時也能實現(xiàn)資源合理利用，響應國家可持續(xù)發(fā)展號召。

白酒糟用途廣泛，可用于生產(chǎn)飼料、肥料、化工產(chǎn)品、生物質(zhì)能源等，其中以微生物發(fā)酵飼料研究較多，有利于解決我國飼料蛋白資源匱乏的問題［5-8］。但酒糟飼料除了粗纖維含量高外，還可能和普通蛋白飼料一樣存在功能單一的問題，常導致動物生長緩慢且易出現(xiàn)病死現(xiàn)象［9］。與之相對應的則是功能飼料，該類飼料除了擁有蛋白質(zhì)等基礎營養(yǎng)物質(zhì)外，還含有甾醇、萜類、氨基酸、多酚和皂苷等功能物質(zhì)，具有促進動物生長、改善繁殖性能、提高動物健康水平等作用［10］。所以通過多種微生物發(fā)酵酒糟生產(chǎn)功能飼料具有廣闊的應用前景。

具有不同功能的霉菌、酵母等微生物協(xié)同作用可發(fā)酵酒糟生產(chǎn)功能飼料?？祵幠久梗═richoderma koningii）、黑曲霉（Aspergillus niger）、嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila）等霉菌微生物可以通過產(chǎn)生纖維素酶及其相關酶類降解纖維素，且各類霉菌微生物產(chǎn)生的酶類有所差異，所以各霉菌在酒糟發(fā)酵過程中可以起到互補作用，另外蒸汽爆破預處理酒糟可以降解軟化其半纖維素和木質(zhì)素，并撕裂纖維素，進而破壞木質(zhì)纖維素穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并提高微生物源纖維素酶的可及性，蒸汽爆破與各酶類共同作用可較大程度地提高其降解粗纖維效果［11-16］。除此之外，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可以產(chǎn)生淀粉酶、葡聚糖酶等酶類物質(zhì)和改善飼料適口性的香味成分乙偶姻，并具有促進動物生長和增強免疫力等作用［17-20］；部分釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以產(chǎn)生煙酸等功能成分，具有促進動物生長并改善其肉質(zhì)等作用［21-22］；產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）則主要用于提高酒糟蛋白［23］；而植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等乳酸菌可以起到改善飼料適口性、抑制病原菌和維持腸道健康的作用［24-26］。綜上所述，本試驗欲通過蒸汽爆破預處理結(jié)合多種功能微生物協(xié)同發(fā)酵以降解酒糟粗纖維，并利用酒糟作為底物合成多種功能成分，生產(chǎn)含多種功能成分的酒糟飼料。

本試驗以蒸汽爆破（1.7 MP壓強條件處理15 min）進行預處理的白酒糟為原料，將前期篩選（待發(fā)表）的釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、康寧木霉、黑曲霉H7、黑曲霉H1496和嗜熱毀絲霉作為發(fā)酵菌種，以粗蛋白含量和煙酸含量為主要指標，粗纖維和乙偶姻含量為次要指標，探究發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、初始pH、裝料量及麩皮添加量對混菌發(fā)酵酒糟的影響，以期優(yōu)化酒糟飼料發(fā)酵條件，生產(chǎn)富含蛋白質(zhì)、煙酸、乙偶姻等功能物質(zhì)的酒糟飼料，進而推動畜牧業(yè)的發(fā)展，實現(xiàn)傳統(tǒng)白酒升級轉(zhuǎn)型為環(huán)境友好型產(chǎn)業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酒糟和試劑 白酒糟，由河北省某酒廠提供；麩皮，市售；庚烷磺酸鈉、甲醇、煙酸、二水合乙二胺四乙酸二鈉、冰乙酸、三乙胺、三氟乙酸、乙偶姻均為色譜純，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口優(yōu)級純試劑。

1.1.2 試驗儀器 汽爆工藝試驗臺（中國鶴壁正道生物能源有限公司）；Unity SpectraStar XT Series 近紅外光譜儀（美國Unity）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市實驗儀器廠）；電子天平（上海精密科技儀器有限公司）；高效液相色譜儀（北京安捷倫科技有限公司）；馬福爐（上海錦屏儀器儀表有限公司）；超凈臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；移液器（法國吉爾森公司）。

1.1.3 菌種 產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、黑曲霉H7、黑曲霉H1496、康寧木霉、嗜熱毀絲霉，以上菌株由天津科技大學現(xiàn)代釀造實驗室提供；釀酒酵母（CICC1746），購于中國工業(yè)微生物保藏中心。

1.1.4 培養(yǎng)基 酵母培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%（配制固體培養(yǎng)基需加入2%瓊脂）。115℃高壓滅菌20 min。

乳酸菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，無水乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，調(diào)節(jié)pH為6.2-6.8（如配制固體培養(yǎng)基需加入2%瓊脂）。121℃高壓滅菌20 min。

芽孢桿菌培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：酵母浸粉0.5%，氯化鈉1%，蛋白胨1%（如配制固體培養(yǎng)基需加入2%瓊脂）。121℃高壓滅菌20 min。

霉菌培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：稱取200 g去皮的馬鈴薯，切碎，加入800 mL蒸餾水，放在電爐上煮沸30 min左右，用8層紗布過濾，留取濾液，加入20 g葡萄糖，加水至1 000 mL（如配制固體培養(yǎng)基需加入20 g瓊脂，定容至1 000 mL）。121℃高壓滅菌20 min。

麩皮種子培養(yǎng)基：稱取1 000 g麩皮，加入800 mL蒸餾水，混勻分裝于500 mL錐形瓶，每瓶分裝75 g。121℃高壓滅菌30 min。滅菌后麩皮中添加2%菌液，于各自最適溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6 d。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 酵母接種于YPD培養(yǎng)基于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h。乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h。各霉菌均使用接種環(huán)挑取1環(huán)均勻涂布于斜面培養(yǎng)基，并于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6-7 d，長成后向各斜面培養(yǎng)基添加10 mL生理鹽水洗滌即可制得霉菌種子液（嗜熱毀絲霉培養(yǎng)溫度為37℃）。

1.2.2 酒糟發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 麩皮添加量的優(yōu)化 以釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、康寧木霉、黑曲霉H7、黑曲霉H1496和嗜熱毀絲霉作為發(fā)酵菌種，將發(fā)酵時間控制為5 d，發(fā)酵溫度控制為30℃，初始pH控制為3.70，總接種量控制為裝料量的10%且各菌株按等比例接種，裝料量控制為100 g，基料汽爆酒糟中麩皮添加量依次設置為5%、10%、15%、20%、25%。

1.2.2.2 裝料量的優(yōu)化 以釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、康寧木霉、黑曲霉H7、黑曲霉H1496和嗜熱毀絲霉作為發(fā)酵菌種，將發(fā)酵時間控制為5 d，發(fā)酵溫度控制為30℃，初始pH控制為3.70，總接種量控制為裝料量的10%且各菌株按等比例接種，基料為汽爆酒糟，裝料量依次設置為 40 g、60 g、80 g、100 g、120 g。

1.2.2.3 初始pH的優(yōu)化 以釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、康寧木霉、黑曲霉H7、黑曲霉H1496和嗜熱毀絲霉作為發(fā)酵菌種等比例接種，將發(fā)酵時間控制為5 d，發(fā)酵溫度控制為30℃，接種量控制為10%，總接種量控制為裝料量的10%且各菌株按等比例接種，基料為汽爆酒糟，用氫氧化鈣和鹽酸將初始pH依次設置為3.70、4.67、5.83、6.71、7.82。

1.2.2.4 發(fā)酵時間的優(yōu)化 以釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、康寧木霉、黑曲霉H7、黑曲霉H1496和嗜熱毀絲霉作為發(fā)酵菌種等比例接種，將發(fā)酵溫度控制為30℃，初始pH控制為3.70，總接種量控制為裝料量的10%且各菌株按等比例接種，裝料量控制為100 g（加上麩曲質(zhì)量），基料為汽爆酒糟，發(fā)酵時間依次設置為1 d、3 d、5 d、7 d、9 d。

1.2.2.5 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 以釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、康寧木霉、黑曲霉H7、黑曲霉H1496和嗜熱毀絲霉作為發(fā)酵菌種等比例接種，將發(fā)酵時間控制為5 d，初始pH控制為3.70，接種量控制為10%，總接種量控制為裝料量的10%且各菌株按等比例接種，基料為汽爆酒糟，發(fā)酵溫度依次設置為27℃、30℃、33℃、36℃、39℃。

1.2.2.6 接種量的優(yōu)化 以釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、康寧木霉、黑曲霉H7、黑曲霉H1496和嗜熱毀絲霉作為發(fā)酵菌種等比例接種，將發(fā)酵時間控制為5 d，發(fā)酵溫度控制為30℃，初始pH控制為3.70，裝料量控制為100 g，基料為汽爆酒糟，總接種量依次設置為裝料量的5%、10%、15%、20%、25%，且各菌株按等比例接種。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗確定的對酒糟發(fā)酵有明顯影響的培養(yǎng)基條件（麩皮添加量、裝料量和初始pH）進行L9（34）正交試驗，其它條件如下：發(fā)酵時間5 d，發(fā)酵溫度30℃，接種量10%。以粗蛋白、粗纖維、煙酸和乙偶姻為指標，確定酒糟發(fā)酵時最佳的培養(yǎng)基條件，各因素和水平的選擇選擇見表1。

表1 正交試驗的因素和水平設計Table 1 Factors and level design of orthogonal test

1.2.4 酒糟飼料的綜合評價

1.2.4.1 感官評價 采用德國農(nóng)業(yè)協(xié)會（Deutsche Lan Dwirtschafts Gesellschaft）評分法對工藝優(yōu)化后的酒糟發(fā)酵飼料進行感官評價，根據(jù)發(fā)酵飼料氣味、質(zhì)地、色澤進行評分，根據(jù)得分可將飼料分為優(yōu)良、尚好、中等、腐敗4個等級，評分標準見表2［27］。

表2 發(fā)酵飼料感官評價標準（DLG）Table 2 Sensory evaluation standard of fermented feed（DLG）

1.2.4.2 營養(yǎng)價值分析 對上述酒糟發(fā)酵飼料中粗蛋白、粗纖維、煙酸和乙偶姻4項指標含量進行測定，以汽爆未發(fā)酵酒糟作為空白對照，同時對各項指標優(yōu)化前后變化率進行計算。

1.2.5 分析方法 酒糟烘干采用105℃烘干恒質(zhì)量法［28］；水分測定采用105℃烘干恒質(zhì)量法［28］；粗纖維含量測定采用GB/T 6434-2006方法進行測定，用纖維網(wǎng)袋代替其中過濾裝置［29］；粗蛋白含量測定采用Unity近紅外光譜儀進行測定［30］；煙酸含量測定采用GB 7300-2017方法進行測定［31］；乙偶姻含量測定采用高效液相色譜進行測定［32］；pH測定時取樣10 g加入40 mL去二氧化碳水，攪拌20 min，用pH 計進行測定［33-34］。

2 結(jié)果

2.1 酒糟發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 麩皮添加量對酒糟發(fā)酵的影響 由圖1可知，隨著發(fā)酵酒糟中麩皮比例的提高，粗蛋白和乙偶姻含量表現(xiàn)為先增長后下降的趨勢，分別在麩皮添加量在10%和20%處取得最大值，并且麩皮添加量為10%的實驗組粗蛋白含量遠高于高麩皮添加量實驗組且與低麩皮添加量實驗組相比也有較大提高，而煙酸和粗纖維含量則大體呈現(xiàn)為遞減趨勢，但煙酸含量整體變化幅度較小，而粗纖維含量主要在麩皮添加量由5%增加至10%和麩皮添加量由15%增加至20%兩處出現(xiàn)了顯著降低。綜合考慮，酒糟發(fā)酵中最佳麩皮添加量確定為10%。

圖1 麩皮添加量對酒糟發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of bran addition amount on the fermentation of distiller’s grains

2.1.2 裝料量對酒糟發(fā)酵的影響 由圖2可知，隨著裝料量增加，酒糟中粗蛋白和煙酸含量均表現(xiàn)為先增長后下降的趨勢，分別在裝料量為100 g和80 g時達到最大值，且裝料量為80 g與100 g發(fā)酵酒糟中煙酸產(chǎn)量極為接近，乙偶姻含量則大致為遞增趨勢，而粗纖維含量在裝料量小于等于100 g時變化不太明顯，僅當裝料量從100 g增加至120 g時出現(xiàn)了較大幅度的增長。綜合考慮，酒糟發(fā)酵中最佳裝料量確定為100 g。

圖2 裝料量對酒糟發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of loading amount on the fermentation of distiller’s grains

2.1.3 初始pH值對酒糟發(fā)酵的影響 從圖3可以看出，酒糟中粗蛋白、煙酸含量隨著酒糟pH升高大致呈現(xiàn)遞減趨勢，但當pH從3.70升高至4.67時，粗蛋白和煙酸含量變化較??；乙偶姻含量則先增加后降低，在pH為4.67時到達最高點，且遠高于其余組；而酒糟中粗纖維含量則大體呈現(xiàn)遞增趨勢，但當pH從3.70升高至4.67時粗纖維含量下降了0.5%左右。綜合考慮，酒糟發(fā)酵中最佳初始pH值確定為4.67。

圖3 初始pH對酒糟發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of initial pH on the fermentation of distiller’s grains

2.1.4 發(fā)酵時間對酒糟發(fā)酵的影響 從圖4可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，酒糟中煙酸、乙偶姻和粗蛋白含量均大體呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，其中煙酸和粗蛋白含量在酒糟發(fā)酵時間為5 d時出現(xiàn)最高點，乙偶姻含量則在發(fā)酵時間為3 d時達到最高點；而酒糟中粗纖維含量早期表現(xiàn)為顯著下降狀態(tài)，后期變化幅度較小，其中發(fā)酵時間為5 d和7 d實驗組粗纖維降解效果最佳。綜合考慮，酒糟發(fā)酵中最佳時間確定為5 d。

圖4 發(fā)酵時間對酒糟發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of fermentation time on the fermentation of distiller’s grains

2.1.5 發(fā)酵溫度對酒糟發(fā)酵的影響 從圖5可以看出，發(fā)酵酒糟中粗蛋白、煙酸和乙偶姻受溫度變化影響較大，而溫度改變對酒糟中粗纖維影響較小。隨著發(fā)酵溫度的提高，酒糟粗蛋白含量出現(xiàn)先增長后下降趨勢，當發(fā)酵溫度為33℃時酒糟粗蛋白含量取得最大值，且30℃發(fā)酵的酒糟粗蛋白含量與之極為接近；煙酸含量隨發(fā)酵溫度的升高而逐漸降低，但當發(fā)酵溫度從 27℃升至30℃時，其含量變化較?。欢遗家龊縿t大致呈現(xiàn)遞增趨勢。綜合考慮，酒糟發(fā)酵中最佳溫度確定為30℃。

圖5 發(fā)酵溫度對酒糟發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on the fermentation of distiller’s grains

2.1.6 接種量對酒糟發(fā)酵的影響 由圖6可知，接種量對酒糟中粗蛋白、煙酸和乙偶姻存在顯著影響，而對于粗纖維影響較小。隨著接種量的增加，粗蛋白和煙酸含量呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，分別在接種量為10%和15%時取得最大值，而乙偶姻含量則逐漸減少。綜合考慮，酒糟發(fā)酵中最佳接種量確定為10%。

圖6 接種量對酒糟發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of inoculum amount on the fermentation of distiller’s grains

2.2 正交試驗結(jié)果及方差分析

在單因素試驗基礎上，設計了關于麩皮添加量、裝料量和初始pH三個因素的L9（34）正交試驗，以優(yōu)化酒糟發(fā)酵培養(yǎng)基條件，結(jié)果見表3。

從表3中各類目標物極差結(jié)果可知，影響粗蛋白含量的主次因素順序為：C＞A＞B；影響粗纖維含量的主次因素順序為：A＞B＞C；影響乙偶姻含量的主次因素順序為：C＞A＞B；影響煙酸含量的主次因素順序為：C＞A＞B。以粗蛋白、粗纖維、乙偶姻和煙酸為指標時，得出的最優(yōu)培養(yǎng)基條件分別為 ：A1B2C1、A3B3C1、A1B1C1、A1B2C3。由于 A3B3C1、A1B1C1、A1B2C3三組試驗均包含在表中，所以只需要進行A1B2C1組試驗即可確定培養(yǎng)基最優(yōu)條件，結(jié)果見表4。在酒糟飼料中粗蛋白含量是最基礎且重要的指標，其次是具有促進動物生長等功能的煙酸，而與前兩者相比粗纖維和乙偶姻重要性更低，根據(jù)這個評判標準，最終選擇了A1B1C1（即麩皮添加量為5%，裝料量為80 g，初始pH值為3.70）作為最優(yōu)培養(yǎng)基條件，其粗蛋白和乙偶姻含量遠高于其余3組，同時含有適中含量的粗纖維和煙酸。

表3 正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test

表4 最優(yōu)培養(yǎng)基條件篩選Table 4 Screening of optimal medium conditions

2.3 酒糟飼料的綜合評價

2.3.1 感官評價 根據(jù)上述德國農(nóng)業(yè)協(xié)會飼料評價標準，從氣味、質(zhì)地、色澤三方面對工藝優(yōu)化后的酒糟發(fā)酵飼料進行感官評價，具體結(jié)果見表5。經(jīng)過綜合評分，優(yōu)化條件下生產(chǎn)的酒糟飼料最終得分17分，為優(yōu)良（1級）發(fā)酵飼料。

表5 酒糟發(fā)酵飼料感官評價Table 5 Sensory evaluation of distiller’s grains fermented feed

2.3.2 營養(yǎng)價值分析 經(jīng)工藝優(yōu)化后，酒糟發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白、粗纖維、煙酸和乙偶姻含量及其優(yōu)化前后變化率見表6。

由表6可以看出，經(jīng)過工藝優(yōu)化后，酒糟發(fā)酵飼料各項指標相對于未發(fā)酵酒糟都有顯著變化，酒糟飼料中粗蛋白含量提高至35.21%，粗纖維含量降低至12.73%，煙酸含量提高至1.21 mg/g酒糟，乙偶姻含量變?yōu)?7.30 mg/g酒糟，相較于優(yōu)化前發(fā)酵酒糟，粗蛋白含量提高了1.56%，粗纖維含量降低了33.11%，煙酸含量提高了290.32%，乙偶姻含量則基本保持不變。

表6 酒糟發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分Table 6 Nutrient composition of fermented distiller’s grains

3 討論

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酒糟飼料不僅可以解決大量酒糟引起的環(huán)境污染問題，還能彌補國內(nèi)蛋白飼料空缺，具有較大的應用前景［5-6］，但酒糟飼料還存在纖維高、功能單一等問題亟待解決［4］。另外，發(fā)酵條件如發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量及初始pH是影響微生物生長和目標代謝產(chǎn)物積累的重要因素，通過對發(fā)酵條件進行優(yōu)化可進一步為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供可能。本研究利用蒸汽爆破技術對酒糟進行預處理，利用釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、康寧木霉、黑曲霉H7、黑曲霉H1496和嗜熱毀絲霉作為混菌發(fā)酵菌種，以粗蛋白含量和煙酸含量作為主要指標，粗纖維含量和乙偶姻含量作為次要指標，探究發(fā)酵時間、溫度、初始pH、接種量、裝料量及麩皮添加量對酒糟發(fā)酵的影響，進而優(yōu)化酒糟發(fā)酵工藝，并對優(yōu)化后發(fā)酵生產(chǎn)的酒糟飼料進行綜合評價。

在發(fā)酵條件優(yōu)化試驗中，單因素試驗能最直觀的反映各因素對于發(fā)酵的影響［35］，故本研究采用單因素試驗和正交試驗結(jié)合優(yōu)化酒糟發(fā)酵條件。探究麩皮添加量對酒糟發(fā)酵影響試驗中，粗蛋白和乙偶姻含量的變化可能是因為酒糟中添加適當麩皮有利于酒糟間氧氣傳輸，使得產(chǎn)朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌代謝旺盛，但是當麩皮添加量過大時，酒糟間氧氣充足，上述微生物則利用酒糟營養(yǎng)物質(zhì)進行大量繁殖，使得粗蛋白和乙偶姻產(chǎn)量下降；另外煙酸含量有下降趨勢可能是由于釀酒酵母合成煙酸的底物來自于酒糟，而麩皮不能提供，麩皮添加量增加則意味著酒糟加入量的減少，故酒糟中煙酸合成量減少；而粗纖維含量發(fā)生變化則可能是因為降解纖維的霉菌微生物屬于嚴格好氧微生物，適當增加麩皮可以增加錐形瓶內(nèi)氧氣濃度，從而提高霉菌生長繁殖速度進而有利于纖維物質(zhì)的降解，但當麩皮添加量達到一定程度時，錐形瓶內(nèi)氧氣濃度對于霉菌而言不再是限制性因素。探究裝料量對酒糟發(fā)酵影響試驗中，引起粗蛋白和煙酸含量變化的原因可能是裝料量過少（過多）時，錐形瓶中酒糟堆積程度偏低（高），使得酒糟溫度低于（高于）產(chǎn)朊假絲酵母和釀酒酵母最適溫度，進而導致兩者生長代謝慢，同時裝料量過大時會造成錐形瓶氧氣含量低，也不適宜酵母目標產(chǎn)物的產(chǎn)生。另外乙偶姻含量逐漸提高的原因可能與粗蛋白、煙酸提高的原因相似，裝料量逐漸增加使得酒糟溫度接近并達到枯草芽孢桿菌最適溫度，進而使得其乙偶姻產(chǎn)量得到提高。而粗纖維含量僅在裝料量過大時出現(xiàn)上升趨勢可能是由于裝料量過大導致錐形瓶中氧氣含量低，進而使得霉菌等產(chǎn)纖維素酶的嚴格好氧微生物生長代謝緩慢。

探究初始pH對酒糟發(fā)酵影響試驗中，出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能是因為pH過高不利于酵母生長代謝，使得粗蛋白和煙酸合成受到影響，同時過高的pH也可能會導致酒糟中煙酸被中和進而使其含量下降，而乙偶姻和粗纖維含量變化的主要原因很有可能是乙偶姻合成酶類和纖維素酶最適pH為4.67左右，pH過高或過低均會降低酶類活性，進而影響乙偶姻的合成和粗纖維的降解。探究發(fā)酵時間對酒糟發(fā)酵影響試驗中，煙酸、乙偶姻和粗蛋白的含量出現(xiàn)先增長后下降趨勢可能由于發(fā)酵后期酒糟營養(yǎng)不足，使得微生物僅依靠酒糟成分無法正常生長代謝，故微生物利用部分目標產(chǎn)物進行自身的生長代謝，導致煙酸、乙偶姻和粗蛋白的含量在發(fā)酵后期出現(xiàn)下降趨勢；而粗纖維含量先下降后穩(wěn)定的原因可能是產(chǎn)纖維素酶微生物可以在酒糟發(fā)酵前期將酒糟中非晶體結(jié)構(gòu)粗纖維降解，而以晶體結(jié)構(gòu)存在的粗纖維部分由于其結(jié)構(gòu)致密，導致纖維素酶等無法作用或難作用于粗纖維，使得酒糟發(fā)酵后期粗纖維含量變化較小［12］。探究發(fā)酵溫度對酒糟發(fā)酵影響試驗中，出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是酵母最適生長溫度為30-32℃左右，溫度過高或過低均不利于酵母生長代謝，進而影響粗蛋白和煙酸的合成；而乙偶姻主要由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生，故乙偶姻在枯草芽孢桿菌最適溫度（37℃）附近到達最高點，且當溫度過高時，乙偶姻增長較慢或下降；而粗纖維含量變化不明顯則可能是因為溫度對霉菌等產(chǎn)纖維素酶微生物生長代謝影響較小。探究接種量對酒糟發(fā)酵影響試驗中，接種量過大時粗蛋白、煙酸和乙偶姻含量下降的原因可能是接種量過大導致酒糟原料不足以提供發(fā)酵過程中各微生物正常生長代謝的營養(yǎng)，以致于發(fā)酵后期各微生物利用目標產(chǎn)物進行自身的生長代謝，進而使得目標產(chǎn)物含量降低。另外接種量從5%提高至10%時，酒糟粗蛋白含量呈現(xiàn)增長趨勢，接種量從5%提高至15%時，煙酸含量也呈現(xiàn)增長趨勢，而乙偶姻含量在這期間卻一直呈現(xiàn)下降趨勢，所以可以判斷接種量過大時產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌等微生物間可能還存在一定的競爭關系。從單因素試驗結(jié)果可以看出，作為飼料主要營養(yǎng)物質(zhì)的粗蛋白受麩皮添加量和初始pH影響較大，而作為酒糟飼料主要功能物質(zhì)的煙酸受初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量影響較為明顯。

另外從培養(yǎng)基條件的正交優(yōu)化實驗可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對酒糟中粗蛋白、乙偶姻和煙酸均有較大影響，而對粗纖維含量基本無影響，其中初始pH與粗蛋白和乙偶姻含量呈負相關，與煙酸含量呈正相關。這一結(jié)果表明微生物中粗蛋白、乙偶姻和煙酸合成酶類受pH影響較大，部分適宜偏酸性環(huán)境，部分適宜弱酸性環(huán)境或堿性環(huán)境。另外麩皮添加量則對粗蛋白、粗纖維和煙酸有較大影響，高麩皮添加量對粗纖維含量降低和煙酸合成有積極影響，但是不利于粗蛋白合成。

在優(yōu)化條件下，酒糟飼料中粗蛋白含量為35.21%，粗纖維含量為12.73%，煙酸含量為1.21 mg/g酒糟，乙偶姻含量為37.30 mg/g酒糟，與優(yōu)化前酒糟飼料相比，粗蛋白含量提高了1.56%，粗纖維含量降低了33.11%，煙酸含量增長為原來的3.90倍，乙偶姻含量基本持平，此酒糟飼料粗蛋白水平高于目前文獻已報道酒糟發(fā)酵粗蛋白水平，其粗纖維水平低于相關研究中粗纖維水平［34，36-38］，且通過發(fā)酵產(chǎn)生了煙酸和乙偶姻等功能性成分，對酒糟飼料工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導意義。

4 結(jié)論

本試驗通過單因素試驗和正交試驗結(jié)合探究麩皮添加量、裝料量、初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量對酒糟發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白、煙酸等功能性成分的影響，確定了酒糟飼料生產(chǎn)的最佳條件如下：基料中麩皮添加量為5%、裝料量為80 g、初始pH為3.70、發(fā)酵時間為5 d、發(fā)酵溫度為30℃、接種量為10%。經(jīng)工藝優(yōu)化后，酒糟飼料中粗蛋白含量為35.21%，粗纖維含量為12.73%，煙酸含量為1.21 mg/g酒糟，乙偶姻含量為37.30 mg/g酒糟，相較于優(yōu)化前發(fā)酵酒糟，粗蛋白含量提高了1.56%，粗纖維含量降低了33.11%，煙酸含量增長率達到290.32%，乙偶姻含量則基本持平。