潘鏡宇 陳佳樂 錢玙呈 劉鑫 楊昊寧 劉立 魏步云 趙洪新

（1. 浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院 浙江省植物與次生代謝重點實驗室，杭州 310018；2. 遼寧工程技術(shù)大學生物工程系，阜新 123000）

微生物多糖（microbial polysaccharides，MPS）如 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）、 莢 膜 多糖（capsular polysaccharide，CPS）、 胞 外 多 糖（exopolysaccharides，EPS）等是由細菌、真菌、藻類等微生物代謝過程中產(chǎn)生的糖類高聚物，在材料、石油、食品、化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領域有十分廣泛的應用，是具有極高開發(fā)價值的天然產(chǎn)物［1］。普魯蘭多糖（pullulan）主要是由短梗霉屬（Aureobasidium spp.）一些菌產(chǎn)生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性黏質(zhì)多糖，是一種特殊的微生物多糖［2］。其基本單元為由α-1，4糖苷鍵連接的麥芽三糖（maltotriose）重復單元，再經(jīng)α-1，6糖苷鍵聚合而成的直鏈狀多糖，具有優(yōu)越的理化性質(zhì)、材料學和流變學特性，可廣泛應用于化工、食品、醫(yī)藥、化妝品等領域，是極具開發(fā)價值的一類天然微生物多糖［3-4］。出芽短梗霉菌（Aureobasidium spp.）是廣泛存在自然界中（如水、土壤、植物表面）的酵母樣真菌，具有特殊的細胞和菌株轉(zhuǎn)換生長特性。不同來源菌株產(chǎn)生的普魯蘭多糖分子量、聚合度和生物活性、副產(chǎn)物多少等方面都存在較大差異［5］。因此，尋找和篩選高產(chǎn)糖量，性狀好，副產(chǎn)物少的新菌株一直受到研究者的高度關(guān)注。

本研究以從太平洋（Pacific Ocean）深海沉積物分離的一株產(chǎn)胞外多糖的微生物為出發(fā)菌株，在確定其分類歸屬的基礎上，對其菌株特性、產(chǎn)糖條件、胞外多糖結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物抑菌活性進行了探究，尋找和開發(fā)海洋資源微生物、尋找海洋源微生物多糖提供了新菌株及研究借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

出發(fā)菌株：出芽短梗霉（Aureobasidium sp.3A00493），由浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院微生物實驗室保藏。

拮抗指示菌：革蘭氏陰性菌（G-）大腸桿菌（Escherichia coli ATCC8091）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；革蘭氏陽性菌（G+）包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC6051）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC6538）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis ATCC29212）；真菌：白色念珠菌（Monilia albican ATCC10231）。以上菌株均由浙江理工大學微生物實驗室保藏。

培養(yǎng)基制作過程參照文獻［6］。產(chǎn)糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50 g/L，酵母浸粉1.5 g/L，（NH4）2SO40.8 g/L，NaCl 2 g/L，K2HPO44 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.5。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，自然pH，固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。

分子鑒定所用試劑盒：真菌基因組DNA提取 試 劑 盒（Genomic DNA Isolation Kit，Solarbio，China）、DNA凝 膠 回 收 試 劑 盒（Gel Purification Kit，Promaga，USA）、PCR 反應試劑盒（PCR Kit，Sangon Biotech（Shanghai）Co.，Ltd. China）。

主要大型儀器：凝膠成像系統(tǒng)（天能，上海）、恒溫搖床（培英，江蘇）、高速冷凍離心機（Thermo，美國）、超凈工作臺（博訊，上海）、PCR儀（Bio-Rad，美國）、Nanodrop 2000（Thermo，美國）。

1.2 方法

1.2.1 菌株特征 菌株活化：用移液槍吸取甘油管保藏菌種5 μL，轉(zhuǎn)接到250 mL盛有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28℃，200 r/min條件下，活化培養(yǎng)。

插片培養(yǎng)：接菌環(huán)蘸取活化液體種子液，劃線接種到PDA固體平板培養(yǎng)基上，28℃ 培養(yǎng)1 d后，在菌落邊緣用無菌鑷子將無菌蓋玻片的1/3-1/2，30° 傾斜插片到培養(yǎng)基里，每個培養(yǎng)基設5枚插片，連續(xù)培養(yǎng)5 d。每24 h取下一枚蓋玻片制成臨時裝片。

形態(tài)學觀察：PDA平板畫線培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征；插片培養(yǎng)法觀察出發(fā)菌株生長的菌絲狀態(tài)；涂片法顯微鏡（1 000×）觀察菌株的細胞和菌絲體形態(tài)［7-8］。

1.2.2 菌體基因組DNA提取及檢測 將活化好的種子液接種于100 mL 三角瓶，盛有25 mL 的PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min條件，培養(yǎng)48 h，離心收集2 mL培養(yǎng)物中的菌體，無菌水重懸離心洗滌2次，去除殘留培養(yǎng)基。按照真菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio）說明書，提取菌株基因組DNA。取5 μL提取的基因組DNA，用0.8% 濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA；取2 μL，用 Nanodrop 2000超微量分光光度計，檢測DNA的純度。

1.2.3 菌株分子鑒定 以提取的基因組DNA為模板，用真菌鑒定通用引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTG TCTC-3′）和 NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′），ITS1（5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′），對出發(fā)菌株的18S rDNA基因和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔D1/D2區(qū)的部分序列進行PCR擴增；凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物；回收的PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果進行輸入NCBI數(shù)據(jù)庫比對，選取典型菌株信息，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［9］，確定出發(fā)菌株的分類歸屬。

PCR擴增反應條件：在冰浴200 μL PCR小管中，依次加入 10×PCR buffer 5 μL、dNTP 混合物 4 μL、引物 ITS1和 NS1或引物ITS4和NS6各2 μL、Taq酶1 μL、模板DNA 1 μL，最后添加ddH2O定容至50 μL?；靹蚝笾糜赑CR儀內(nèi)，95℃預變性4 min；93℃ 變性 40 s，50-58℃ 退火 30 s，72℃ 擴增 60 s，30個循環(huán)；72℃ 保溫10 min，4℃保存。

1.2.4 菌株最適生長條件測定 pH測定：用NaOH（1 mol/L）和HCl（1 mol/L）溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 為 3、4、5、6、6.5、7、8、9、10。 用 培 養(yǎng)基稀釋種子液，調(diào)整接種量，使初始OD600一致，于28℃，200 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，根據(jù)1.2.5測定菌株的生物量（biomass）、粗多糖的產(chǎn)量（crude polysaccharide yield）和產(chǎn)率（多糖產(chǎn)量/生物量）（crude polysaccharide productivity）。

生長溫度測定：用培養(yǎng)基稀釋種子液，調(diào)整接種量，使初始OD600一致，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于不同溫度條件（24℃、26℃、28℃、30℃），200 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，離心收集菌體，根據(jù)1.2.5測定菌株的生物量。

搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)糖影響：用培養(yǎng)基稀釋種子液，調(diào)整接種量，使初始OD600一致，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，不同轉(zhuǎn)速（160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min）條件下，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，離心收集菌體及上清液，醇沉上清液提取多糖，根據(jù)1.2.5測定粗多糖的產(chǎn)量。

不同裝液量對產(chǎn)糖影響：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并分別按照250 mL錐形瓶最大裝液量250 mL的 10%、20%、30%、40%、50% 分裝培養(yǎng)基。用培養(yǎng)基稀釋種子液，調(diào)整接種量，使初始OD600一致，28℃，200 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，離心收集菌體及上清液，醇沉上清液提取多糖，根據(jù)1.2.5測定粗多糖的產(chǎn)量。

1.2.5 生長曲線和產(chǎn)糖曲線測定 將出發(fā)菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min條件下培養(yǎng)60 h。用培養(yǎng)基稀釋菌液10-30倍，使其OD600的吸光值為0.500 Abs，作為種子液。根據(jù)三角瓶中培養(yǎng)基的體積，調(diào)整接種量，使初始OD600一致，接種后28℃、200 r/min條件下，連續(xù)培養(yǎng)7 d。每12 h隨機選取3瓶培養(yǎng)物，取20 mL菌液，5 000 r/min離心20 min，取5 mL上清液并加入10 mL無水乙醇，充分震蕩混勻后，4℃過夜沉淀多糖。12 h后再于5 000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀再次加入無水乙醇清洗3次，并離心去上清，將沉淀物置于85℃烘箱干燥至恒重，稱量計算粗多糖產(chǎn)量。

同樣取20 mL菌液，5 000 r/min離心20 min棄上清，沉淀用無菌水離心洗滌3次，棄上清，離心收集菌體，85℃烘箱中干燥至恒重，稱量用以計算菌體生物量［10］。

1.2.6 多糖產(chǎn)量測定 粗多糖產(chǎn)量測定方法同1.2.5。

1.2.7 抑菌活性測定 濾紙片法：將3枚6 mm無菌濾紙片等間距貼到PDA固體平板上。接種10 μL 出發(fā)菌株種子液于濾紙片上，30℃培養(yǎng)48 h。以10 μL氨芐青霉素（濃度50 μg/mL）和卡那霉素（濃度50 μg/mL）作為陽性對照（positive control），以 10 μL PDA液體培養(yǎng)基作為陰性對照（negative control）。

將加熱融化的LB固體培養(yǎng)基，冷卻至45℃左右時，按1∶50接種量，接種稀釋后的指示菌菌液（調(diào)整指示菌菌液的OD600為0.800），顛倒混勻，輕倒并鋪滿已經(jīng)接種出發(fā)菌株的培養(yǎng)基上，制成雙層平板。雙層平板凝固后倒置，于30℃培養(yǎng)48 h以上，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.8 多糖提取、純化及結(jié)構(gòu)分析 粗多糖提?。喝?0 mL發(fā)酵液，5 000 r/min 離心20 min，取上清液，加入2倍體積預冷的無水乙醇，充分振蕩混勻，4℃隔夜沉淀；12 h后將沉淀物于5 000 r/min，離心20 min，去上清；用無水乙醇離心洗滌沉淀3次，棄上清獲得粗多糖提取物。將粗多糖提取物置于85℃烘箱烘干至恒重，得到粗多糖干品［11-12］。

多糖純化：將粗多糖提取物溶解于蒸餾水制成飽和溶液，于5 000 r/min離心20 min，取上清液并加入2倍體積的氯仿異戊醇（24∶1）混合液，顛倒混勻，靜置5 min后于5 000 r/min離心20 min，小心將上層液體移到新的離心管中，氯仿異戊醇重復萃取2-3次，得到去除蛋白及雜質(zhì)的多糖水溶液；向多糖水溶液加入2倍體積預冷的無水乙醇，充分震蕩混勻，并于4℃ 過夜沉淀，5 000 r/min離心20 min，并用無水乙醇洗滌3次，離心去上清，得到純化的多糖沉淀［13-14］。

多糖薄層層析（thin layer chromatography，TLC）分析［15］：配制0.05 g/mL純化后的普魯蘭多糖樣品和普魯蘭多糖標準品，分別吸取出3 mL于2個潔凈10 mL的燒杯中，按10 μL/mL比例向燒杯中加入普魯蘭酶（pullulanase），于室溫消化6-8 h。

將硅膠層析板于110℃ 烘箱中活化30 min備用，按乙腈∶水=50∶1的比例配置展開劑，將2個標準品實驗組和2個樣品實驗組用毛細管點樣在層析板底邊向上約1 cm處，層析板于乙腈-水展開劑混合液中進行層析。待層析帶上升至層析板3/4左右時取出層析板，靜置晾干，并再次放回層析槽中進行層析，共層析3次。按照甲醇∶濃硫酸=3∶1的比例配置好顯色劑，將顯色劑噴于層析板表面，晾干，后置于110℃ 烘箱中加熱顯色；多糖紅外光譜（FTIR）分析：將純化得到的多糖組分，采用KBr與多糖混勻（1∶100），壓片，并在4 000-400 cm-1進行紅外光譜掃描IR吸收［16-18］。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)特征 菌株3A00493在PDA培養(yǎng)基上的生長形態(tài)如圖1中A、B所示，圖中箭頭分別指示光滑單菌落和產(chǎn)生菌絲體的單菌落。菌落初期呈乳白色光滑圓形菌落（圖1-A），在30℃條件下培養(yǎng)48 h后，菌落周圍生出菌絲體，菌落顏色變深為肉色，說明有色素產(chǎn)生（圖1-B）。從圖1-B可以看出3A00493具有酵母樣細胞，菌落周圍生有類似菌絲延伸；光學顯微鏡（100×）下觀察3A00493菌株如圖1-C中箭頭所示，其酵母樣單細胞形態(tài)具橢圓形與典型酵母菌單細胞相似，并能觀察到芽痕；菌絲體細胞則呈現(xiàn)無隔和有隔菌絲體兩種，且菌絲體周圍附著大量酵母樣細胞，如圖1-D中箭頭指示的變形為菌絲體樣的單細胞菌體。這些特征與《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）關(guān)于出芽短梗霉的典型特征描述相似，初步確定出發(fā)菌株3A00493隸屬于短梗霉菌屬（Aureobasidium）。

圖1 菌株3A00493的特征Fig. 1 Characteristics of strain 3A00493

2.1.2 菌株的分子鑒定及進化樹分析 以3A00493的基因組DNA為模板，用真菌鑒定通用引物ITS1/ITS4與NS1/NS6，PCR擴增部分18S rDNA基因和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)D1/D2區(qū)，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果18S rDNA（GenBank No：MW5 05968）和D1/D2區(qū)（GenBank No：MH129527）通過 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，結(jié)果2段序列均與發(fā)表的Aureobasidium sp.菌株相應的序列相似性≥98%。選取典型8-12個典型或標準菌株的相應序列，用MEGA7.0軟件繪制發(fā)育進化樹如圖2所示。

圖2 菌株3A00493系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain 3A00493

出發(fā)菌株3A00493的18S rDNA部分基因序列發(fā)育進化樹顯示，3A00493與A. pullulans PED6聚類在一起（圖2-A）；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1/2區(qū)序列發(fā)育進化樹顯示，3A00493與A. pullulans 383/30 和A.pullulans HN4-6聚類在一起（圖2-B）。結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST相似性、圖2進化樹聚類結(jié)果、形態(tài)特征、生長特性，確定出發(fā)菌株3A00493為隸屬屬于短梗霉屬（Aureobasidium），命名為出芽短梗霉A.pullulans 3A00493。

2.2 生長曲線、產(chǎn)糖曲線測定

通過對菌株生長不同時間生物量（biomass）和粗多糖產(chǎn)量（crude polysaccharide yield）進行測定，繪制出產(chǎn)糖曲線和生長曲線如圖3所示。菌株3A00493生長遲緩期大約在0-12 h，此時菌株在培養(yǎng)基上生長處于不活躍的狀態(tài)，逐漸適應環(huán)境；培養(yǎng)12-84 h則菌株進入對數(shù)生長期，菌株分裂加快，呈指數(shù)分裂增殖；從培養(yǎng)84-168 h進入穩(wěn)定期，菌株生長受到環(huán)境限制，生長速度開始減慢（圖3）。

菌株在0-12 h的生長遲緩期即開始產(chǎn)生多糖，而在12-24 h的對數(shù)生長前期多糖產(chǎn)量的增加幅度小于0-12 h遲緩期。推測此時菌株已經(jīng)適應新的環(huán)境，開始進入快速分裂期，培養(yǎng)基中的碳源更參與菌株的生長繁殖，增加細胞數(shù)量，代謝流向多糖生產(chǎn)增長較慢。隨著菌株生長使其逐漸進入對數(shù)生長后期，粗多糖產(chǎn)量也隨之增加較快。菌株在培養(yǎng)的第144小時時粗多糖產(chǎn)量達到峰值為24.58 g/L，隨后發(fā)酵液內(nèi)多糖含量趨穩(wěn)，后緩降產(chǎn)糖減少（圖3）。

圖3 菌株3A00493生長曲線及產(chǎn)糖曲線（n=3）Fig. 3 Growth curve and sugar production curve of strain 3A00493（n=3）

2.3 最適生長、發(fā)酵條件測定

為了進一步探究3A00493的最適產(chǎn)糖潛力，改變培養(yǎng)基不同的pH、不同培養(yǎng)溫度、搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速與發(fā)酵三角瓶裝液量，對其生長與產(chǎn)糖能力的影響進行了測定，并繪制出生物量與多糖產(chǎn)量關(guān)系（圖 4）。

圖4-A為不同pH條件對出發(fā)菌株生長及發(fā)酵的影響，在8個不同pH的生長條件下，當培養(yǎng)基初始pH為6.5時，菌株的粗多糖產(chǎn)量最大，為11.00 g/L，多糖產(chǎn)率為1.49 g粗多糖每克生物量。隨著培養(yǎng)基pH的增加，菌株生物量呈下降趨勢，當培養(yǎng)基pH等于4時，產(chǎn)生的生物量最大，達到8.68 g/L發(fā)酵液。因此，培養(yǎng)基初始pH 4為菌株3A00493最適生長pH；培養(yǎng)基初始pH 6.5為其最佳發(fā)酵pH。

圖4-B為不同溫度條件對出發(fā)菌株生長及發(fā)酵的影響，從圖中可以看出，菌株粗多糖產(chǎn)量在26℃時最大，為14.43 g/L，并且多糖產(chǎn)率為1.74 g/g，均高于28℃條件下指標。培養(yǎng)溫度為30℃時，多糖率與26℃條件下產(chǎn)率無顯著性差異。隨溫度升高，菌株生物量整體呈下降趨勢，在26℃時擁有最大生物量8.28 g/L。因此，培養(yǎng)溫度26℃為出發(fā)菌株的最佳生長和產(chǎn)糖發(fā)酵溫度。

圖4-C為不同裝液量條件對出發(fā)菌株生長及發(fā)酵的影響，從圖中可以看出，隨培養(yǎng)基裝液量的提升，菌株產(chǎn)粗多糖能力大致呈下降趨勢，當裝液量為30%（75 mL）時菌株擁有最大粗多糖產(chǎn)量11.8 g/L和最大多糖產(chǎn)率2.08 g粗多糖/g生物量。當裝液量為10%（25 mL）時菌株生物量最大8.32 g/L。

圖4-D為不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速條件對出發(fā)菌株生長及發(fā)酵的影響，從圖中可以看出，當培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時菌株的粗多糖產(chǎn)量12.9 g/L和生物量8.11 g/L最大，顯著高于200 r/min和220 r/min實驗組。當轉(zhuǎn)速為220 r/min時，菌株的多糖產(chǎn)率最大為2.07 g粗多糖每克生物量，并顯著高于其他實驗組。

圖4 不同培養(yǎng)條件對菌株3A00493的產(chǎn)糖及菌株生長的影響（n=3）Fig. 4 Effects of different culture conditions on the sugar production and growth of strain 3A00493（n=3）

通過對菌株不同培養(yǎng)條件下指標的測定，發(fā)現(xiàn)菌株3A00493產(chǎn)糖量對培養(yǎng)基pH值要求較高，培養(yǎng)基pH在6.5左右輕微的變化即會對最終的多糖產(chǎn)量造成較大影響。較低的pH值則適合菌體的生長繁殖，較高的pH則會同時降低菌體的生長與產(chǎn)糖發(fā)酵能力。26℃同時適合菌株的生長與發(fā)酵，隨著培養(yǎng)基裝液量的提升，菌株生物量呈下降趨勢，說明較低的裝液量適合菌體的生長，而中等體積的裝液量適合菌株產(chǎn)糖發(fā)酵。

根據(jù)對菌株最適生長、發(fā)酵條件的測定，最終得到菌株的最適生長繁殖條件：pH 4，培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)基裝液量10%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min；和菌株最佳產(chǎn)糖發(fā)酵條件：pH 6.5，培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)基裝液量30%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速220 r/min。

2.4 不同培養(yǎng)條件發(fā)酵液的pH變化

發(fā)酵液pH的變化可以反映菌體生長過程中是否產(chǎn)酸性物質(zhì)。發(fā)酵過程如果產(chǎn)酸對菌體的生長和代謝產(chǎn)物的組成都會影響較大，所以確定發(fā)酵液的pH對產(chǎn)糖條件的優(yōu)化具有重要意義。為了準確掌握出發(fā)菌株的最佳發(fā)酵產(chǎn)糖條件，測定了3A00493在不同pH、溫度、培養(yǎng)基裝液量和搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速條件下，發(fā)酵液pH的變化如圖5所示。

圖5 不同條件培養(yǎng)菌株3A00493發(fā)酵液的pH值變化曲線（n=3）Fig. 5 pH variation of fermentation broth of strain 3A00493 under different cultivation conditions（n=3）

通過對發(fā)酵液最終pH的測量，發(fā)現(xiàn)其最終pH大多在2.80上下波動，且初始pH越大，pH變化量越大。由此可見菌株3A00493在生長過程中還會產(chǎn)生酸類物質(zhì)，使發(fā)酵液呈偏酸性以營造適合自己生長繁殖的環(huán)境，這與出芽短梗霉的其他種類是相同特點。

2.5 抑菌活性測定

為了探究出發(fā)菌株的代謝產(chǎn)物是否具有抑菌活性，選擇3種革蘭氏陽性菌、2種革蘭氏陰性菌和一種真菌5種常見菌為指示菌，濾紙片法測定了出發(fā)菌株代謝產(chǎn)物的抑菌活性。

如表1所示，經(jīng)過24-48 h的拮抗培養(yǎng)實驗，出發(fā)菌株3A00493對5種指示菌中的大腸桿菌（E. coil ATCC8091）、金黃葡萄球菌（S. aureus ATCC6538）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis ATCC6051）具有明顯抑菌活性，對銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）和白色念珠菌（M.albican ATCC10231）沒有抑菌作用。生長受到抑制的4種指示菌中包括1種革蘭氏陰性（G-）細菌和3種革蘭氏陽性（G+）細菌，抑菌圈直徑均大于10 mm且與50 μg/mL濃度的卡那霉素相當，略優(yōu)于同等濃度的氨芐青霉素，表明了3A00493菌株的代謝產(chǎn)物對一些微生物的生長有抑制作用，且呈現(xiàn)一定的廣譜性和抑菌較強的特點。

表1 菌株 3A00493發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of fermentation products of strain 3A00493

2.6 多糖結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)1.2.8的提取過程得到醇沉后的粗多糖（crude polysaccharide）。粗多糖呈乳白色，說明黑色素副產(chǎn)物很少，且溶于水而不溶于無水乙醇，溶液無色無味。經(jīng)烘干后結(jié)成固體硬塊，含有少許淡黃色雜質(zhì)。經(jīng)提純后得到純白色的純化多糖，烘干后呈純白色固體，內(nèi)有中空氣泡，在管壁呈現(xiàn)透明糖膜，有良好的成膜性，其無色無味，與文獻報道普魯蘭多糖性質(zhì)相符合［10，18］

2.6.1 多糖薄層層析分析 普魯蘭酶（pullulanase）是特異性淀粉脫支酶，專性水解α-1，6糖苷鍵。普魯蘭多糖普魯蘭酶的作用下，可以水解為麥芽三糖（maltotriose）。如圖6-A所示，層析板下緣4個黑色點為樣品點，其中1道和2道分別為標準品普魯蘭多糖和出發(fā)菌株3A00493產(chǎn)多糖樣品；3道和4道則分別為經(jīng)過普魯蘭酶水解酶解后的普魯蘭多糖標準品和純化多糖樣品。沒有經(jīng)過水解的普魯蘭多糖無法溶解于乙腈-水展開劑，不能再層析板上遷移如圖6-A中的樣品點1和2。而經(jīng)過普魯蘭酶解完全的普魯蘭多糖則生成其組成單位麥芽三糖（maltotriose），可溶解于展開劑中，可以在層析板上遷移，如圖6-A中的樣品點3和4箭頭。因此，由圖6-A中4個層析樣品點可知，普魯蘭多糖標準品和樣品被普魯蘭酶水解后，都有麥芽三糖產(chǎn)生，而未經(jīng)水解的標準品和樣品普魯蘭多糖都沒有產(chǎn)生遷移。說明出發(fā)菌株產(chǎn)生的胞外多糖與標準樣品普魯蘭多糖的結(jié)構(gòu)一致。

2.6.2 多糖紅外光譜測定 紅外光譜（FT-IR）測定如圖6-B。圖中紅色曲線為普魯蘭多糖標準品的紅外色譜，標準品多糖分子的特征峰為2 500-1 500 cm-1處的 vC= O峰和 1 000-800 cm-1處的D-吡喃葡萄糖環(huán)振動峰［19-20］，而黑色曲線為樣品的紅外光譜特征峰，與標準品的吻合。說明出發(fā)菌株產(chǎn)生的胞外多糖與標準樣品普魯蘭多糖的結(jié)構(gòu)一致。

圖6 多糖薄層層析Fig. 6 Polysaccharide TLC

3 討論

海洋存在著大量的微生物，獨特的環(huán)境條件又賦予微生物特殊的代謝特征，是資源微生物的重要來源之一。菌株3A00493是來源于太平洋深海的一株產(chǎn)胞外多糖的海洋微生物。PDA 培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3A00493 12 h，菌體呈現(xiàn)菌絲體和酵母樣細胞并存的狀態(tài)，菌絲體從菌落中心放射性地散開。平板置于4℃冰箱保存10 d后，菌落狀態(tài)會變成暗黑色，說明有黑色色素產(chǎn)生。這些特征與《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）關(guān)于出芽短梗霉菌屬（Aureobasidium sp.）的典型特征描述特征一致［5，21］。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) D1/D2 區(qū)序列及 18S rDNA 序列測序與數(shù)據(jù)庫比對分析的結(jié)果，其與出芽短梗霉菌屬的同源性超過98%，綜合菌落特征與進化樹分析結(jié)果，確定菌株3A00493是隸屬于短梗霉屬的一株海洋來源新菌株，命名為 A. pullulans 3A00493。

薄層層析（TLC）和紅外光譜分析（FT-IR）3A00493的胞外多糖，與普魯蘭多糖（pullulan）標準品的結(jié)果一致，確定菌株3A00493代謝產(chǎn)生的胞外多糖為普魯蘭多糖（pullulan）［10］。本研究還測定了3A00493的生長特性和產(chǎn)糖曲線，在菌株培養(yǎng)的初期階段，菌株的生物量增殖和多糖產(chǎn)生的量并不是同步的，當菌株生長進入穩(wěn)定期，菌株多糖的產(chǎn)量開始上升。當菌株生長進入穩(wěn)定期后，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及細胞增多，培養(yǎng)環(huán)境壓力增大，脅迫作用增強，菌株開始傾向于產(chǎn)生更多的多糖。因此菌株在培養(yǎng)的第144 小時時擁有最大的粗多糖產(chǎn)量，達到24.58 g/L，隨后發(fā)酵液內(nèi)多糖含量則趨于下降。

通過將菌株在不同條件下培養(yǎng)，獲得了菌株最佳生長和發(fā)酵條件。菌株3A00493產(chǎn)糖量對培養(yǎng)基pH要求較高，培養(yǎng)基pH在6.5左右輕微的變化即會對最終的多糖產(chǎn)量造成較大影響。較低的pH適合菌體的生長繁殖，較高的pH則會同時降低菌體的生長與產(chǎn)糖發(fā)酵能力。初始培養(yǎng)基pH越高，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液pH的變化量就越大，說明菌株在生長繁殖的同時還會產(chǎn)生酸性物質(zhì)降低培養(yǎng)基pH。26℃同時適合菌株的生長與發(fā)酵。菌株最適生長裝液量為10%，最適產(chǎn)糖裝液量為30%。隨著培養(yǎng)基裝液量的提升，菌株生物量呈下降趨勢，說明較低的裝液量適合菌體的生長，而中等體積的裝液量適合菌株產(chǎn)糖發(fā)酵。180 r/min轉(zhuǎn)速最適宜菌株的生長繁殖，而220 r/min的轉(zhuǎn)速最適合菌株的產(chǎn)糖發(fā)酵。隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的提升，菌體生物量大致呈下降趨勢，說明較低的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速有利于菌體的生長繁殖，而較高的轉(zhuǎn)速則適宜菌株的產(chǎn)糖發(fā)酵。

出發(fā)菌株3A00493最適生長條件：pH 4、培養(yǎng)溫度26℃、培養(yǎng)基裝液量10%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min；菌株最適產(chǎn)糖條件：pH 6.5、培養(yǎng)溫度26℃、培養(yǎng)基裝液量30%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速220 r/min；出芽短梗霉是FDA（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認證的安全菌株，其代謝產(chǎn)物具有生防功能。本研究表明，菌株3A00493對5株指示菌的4株具有不同的抑菌活性，為進一步利用其生防活性的應用奠定了基礎。以往有關(guān)出芽短梗霉的抑菌研究都是以植物病原菌為指示菌［21-23］，并顯示很好的抑菌能力。本實驗以常見5種細菌和一株真菌為指示菌，對其中4種菌表現(xiàn)出與氨芐青霉素（50 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）相近的抑菌效果，說明出發(fā)菌株3A00493具有極大可能產(chǎn)生不同于其他短梗霉的抑菌產(chǎn)物，并且是具有潛在的應用價值的代謝產(chǎn)物。

利用薄層層析法，并利用普魯蘭酶特異性地水解麥芽三糖間的α-1，6糖苷鍵的特性對出發(fā)菌株產(chǎn)生的胞外多糖進行鑒定。由于經(jīng)過水解的多糖更易于溶解于層析液中，因此普魯蘭酶水解點3和4上方會分別產(chǎn)生一條遷移帶。層析板樣品點3和4上方還可見顏色稍淺的遷移路徑，說明經(jīng)雖然過普魯蘭酶的水解，但普魯蘭多糖并非完全轉(zhuǎn)化為麥芽三糖，一部分經(jīng)過不完全水解后成為可遷移的糖類組分，但遷移率卻小于麥芽三糖，因此就被依次按照遷移率留在了遷移路徑上，形成顏色較淺的條帶。而未經(jīng)水解或水解后不足以在展開劑中遷移的多糖則留在樣品點3和4，形成黑色的碳化點。

利用紅外光譜法對純化多糖結(jié)構(gòu)進行鑒定，結(jié)果表明純化樣品多糖紅外光譜與商業(yè)標準普魯蘭多糖紅外光譜基本吻合，光譜中2 500-1 500 cm-1處顯示了糖結(jié)構(gòu)中的醛基（vC= O）峰和 1 000-800 cm-1處的D-吡喃葡萄糖環(huán)振動峰［23-24］。薄層層析和紅外光譜法結(jié)果表明出發(fā)菌株A. pullulans 3A00493產(chǎn)生的多糖是由麥芽三糖通過α-1，6糖苷鍵連接而成的普魯蘭多糖，且經(jīng)過純化后沒有產(chǎn)生明顯雜質(zhì)，與文獻中報道的普魯蘭多糖化學鍵組成一致。

海洋存在大量的微生物，是尋找和開發(fā)資源微生物、天然生物活性多糖及天然藥物的重要來源。本研究是對深海菌株3A00493產(chǎn)普魯蘭多糖的探索性研究，為進一步尋找和開發(fā)產(chǎn)普魯蘭多糖的海洋微生物、海洋微生物資源提供了新的菌種和借鑒。

4 結(jié)論

菌株3A00493是一株來自太平洋深海海床沉積物的真菌，其生活史具有獨特的酵母樣細胞和菌絲體細胞結(jié)構(gòu)，并在生長繁殖的過程中可產(chǎn)生胞外多糖；菌株特征和分子鑒定表明菌株3A00493是隸屬于短梗霉屬新菌株；3A00493在pH 4、培養(yǎng)溫度26℃、培養(yǎng)基裝液量10%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min條件下獲得最佳生長繁殖能力；在pH 6.5、培養(yǎng)溫度26℃、培養(yǎng)基裝液量30%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速220 r/min條件下獲得最佳產(chǎn)糖發(fā)酵能力；3A00493的代謝產(chǎn)物具有一定拮抗作用，抑制指示菌生長活性，其抑制細菌能力與50 μg/mL濃度的卡那霉素相當；3A00493產(chǎn)生的胞外多糖，經(jīng)薄層層析鑒定和紅外光譜分析，與普魯蘭多糖標準品抑制，確定為普魯蘭多糖（pullulan）。因此，3A00493是一株可產(chǎn)普魯蘭多糖的海洋源出芽短梗霉新菌株，是一株具有開發(fā)價值的海洋源資源微生物。