石欣玥 尚驍堯 周玲芳 張鐵軍 晁躍輝

（北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京100083）

紫花苜蓿是一種優(yōu)良的多年生豆科植物，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，在我國(guó)種植范圍廣泛，紫花苜蓿因其自身的優(yōu)良品質(zhì)已成為首選牧草品種，其生長(zhǎng)品質(zhì)和產(chǎn)量決定了苜蓿飼料的價(jià)格，影響著畜牧業(yè)的發(fā)展，因此，培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的紫花苜蓿新品種是我國(guó)科研育種工作者一直以來追求的目標(biāo)。

AP2/ERF（APETALA2/ethylene responsive factor）是植物體中的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，通過調(diào)控與植物器官分化形成相關(guān)的基因表達(dá)而調(diào)控器官的發(fā)育，1994年，Jofuku等［1］首次從擬南芥中發(fā)現(xiàn)并分離出AP2/ERF基因，該基因參與調(diào)控?cái)M南芥花器官的生成和種子的形成。GmRAV是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族AP2亞族中RAV家族的同源轉(zhuǎn)錄因子基因，通過在煙草中過表達(dá)GmRAV，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)GmRAV煙草的生長(zhǎng)發(fā)育和器官形成明顯受到抑制作用，與野生型相比，植株矮化嚴(yán)重，葉片變小變薄更幼嫩，根的伸長(zhǎng)程度變短，根系變得更短和細(xì)弱，葉片中的葉綠素含量明顯降低，光合速率明顯下降。并且對(duì)轉(zhuǎn)GmRAV大豆植株根莖葉的生長(zhǎng)也均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用［2］。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與不同的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控植物激素的合成與運(yùn)輸。番茄SlAP2a能夠抑制乙烯合成，使果實(shí)延遲成熟，在SlAP2a缺失突變體中，乙烯含量增加，果實(shí)提前成熟，此外，該基因還參與調(diào)控番茄中胡蘿卜素的合成，使成熟果實(shí)顏色為橙色［3］。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子中的ERF基因參與乙烯的反饋調(diào)節(jié)，乙烯能夠誘導(dǎo)番茄LeERF2的表達(dá)，轉(zhuǎn)LeERF2番茄中乙烯含量增加，而轉(zhuǎn)入反義LeERF2番茄中的乙烯含量則顯著減少［4-5］。通過對(duì)9株不同ERF家族基因的轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行脫落酸處理，發(fā)現(xiàn)在處理后2-24 h時(shí)，這些植株的基因相對(duì)表達(dá)量均呈不同程度的上調(diào)趨勢(shì)，表明ERF基因家族在脫落酸的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起作用［6］。Aya等［7］研究發(fā)現(xiàn)外施生長(zhǎng)素后，水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控smos1表達(dá)，使水稻器官大小和形態(tài)發(fā)生改變，而smos1功能缺失突變體的器官均變小，表明AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在水稻中響應(yīng)生長(zhǎng)素信號(hào)，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)使器官發(fā)生相應(yīng)的改變。Rashotte等［8］研究表明擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員CBFs對(duì)植物葉片的發(fā)育起調(diào)控作用，并參與調(diào)控細(xì)胞分裂素中許多響應(yīng)基因的表達(dá)，認(rèn)為CBFs是細(xì)胞分裂素應(yīng)答因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素功能反應(yīng)。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，發(fā)揮重要作用，但在紫花苜蓿中對(duì)MsAP2的功能性研究鮮見報(bào)道。

本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆MsAP2，并將其轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，獲得轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行內(nèi)源激素的測(cè)定（脫落酸、細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素和赤霉素）和表型鑒定，初步分析MsAP2的功能，為后續(xù)深入探究MsAP2在紫花苜蓿中的功能和探究MsAP2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)提供理論指導(dǎo)和材料基礎(chǔ)，也為紫花苜蓿生物技術(shù)育種提供一定的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

紫花苜蓿為北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所保存的中苜1號(hào)，取單株長(zhǎng)勢(shì)良好的紫花苜蓿進(jìn)行扦插，以扦插后生長(zhǎng)4周的苜蓿為試驗(yàn)材料，排除不同紫花苜蓿植株基因組差異對(duì)試驗(yàn)造成的影響。農(nóng)桿菌菌株為EHA105、植物表達(dá)載體為3302-3flag均保存于北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 依據(jù)公布的同源物種蒺藜苜蓿的MsAP2序列（XM_013593972.3），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 所用引物的序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 MsAP2的克隆 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的紫花苜蓿葉片，利用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用引物MsAP2-f、MsAP2-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10 min ；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，純化回收，然后與克隆載體pMD19-T連接（16℃ 30 min），轉(zhuǎn)化。利用引物M13f、M13r進(jìn)行菌體PCR檢測(cè)，篩選陽性菌株送至睿博生物公司測(cè)序。

1.2.3 MsAP2植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將檢測(cè)合格的含有重組克隆載體pMD19-AP2的質(zhì)粒，用引物3302-AP2-f和3302-AP2-r進(jìn)行擴(kuò)增，與經(jīng)Nco I酶切的植物表達(dá)載體3302-3flag進(jìn)行連接（50℃ 15 min）、轉(zhuǎn)化。利用引物3302-f、Nos181-r進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取陽性菌株送至睿博生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 提取3302-3flag-AP2的質(zhì)粒，使用CaCl2凍融法將其轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，使之表達(dá)，并將菌液涂布在YEB固體培養(yǎng)基（含有50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平）上，28℃過夜培養(yǎng)，利用引物3302-f和Nos181-r對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽性菌株送去睿博生物技術(shù)公司進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

1.2.5 紫花苜蓿的轉(zhuǎn)化 選取扦插后長(zhǎng)勢(shì)一致的紫花苜蓿葉片進(jìn)行滅菌處理，并浸泡在無菌水中，后續(xù)侵染使用。將檢測(cè)合格的陽性農(nóng)桿菌菌株在YEB固體培養(yǎng)基（含有50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平）上劃線活化，28℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落放入100 mL YEB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，然后富集菌體，使用Ms-COLQ培養(yǎng)液對(duì)菌體進(jìn)行重懸浮至菌液的OD600=0.4-0.6。將處理好的葉片放入重懸后的菌液中，抽真空3 min后，100 r/min低速震蕩1 h，使葉片充分被菌液侵染。然后將已侵染完全的葉片放在Ms-CO固體培養(yǎng)基上，24℃避光培養(yǎng)3 d，將外植體轉(zhuǎn)移至Ms-YD培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的抗性篩選培養(yǎng)，避光培養(yǎng)5周后，再將其轉(zhuǎn)移至Ms-SY培養(yǎng)基，光照下（光照16 h/黑暗8 h，溫度24℃，光照強(qiáng)度60 lx）進(jìn)行生芽培養(yǎng)5-6周，將芽長(zhǎng)2 cm左右的外植體轉(zhuǎn)移至Ms-SG培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待根系生長(zhǎng)足夠發(fā)達(dá)后轉(zhuǎn)移至無菌土壤中使植株繼續(xù)生長(zhǎng)，紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化過程中所用到的培養(yǎng)基配方見表2。

表2 紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分Table 2 A variety of culture medium in the genetic transformation experiment of M. sativa

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè) 對(duì)再生紫花苜蓿植株進(jìn)行陽性檢測(cè)，分別從DAN，RNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行鑒定，檢測(cè)MsAP2基因是否成功插入紫花苜蓿基因組，并根據(jù)蛋白質(zhì)免疫印跡雜交結(jié)果初步分析MsAP2基因蛋白。

采用植物基因組總DNA提取試劑盒提取再生紫花苜蓿植株和野生型的基因組DNA，利用引物3302-f和Nos181-r進(jìn)行陽性檢測(cè)，對(duì)能夠擴(kuò)增出目的DNA的紫花苜蓿植株提取RNA，利用引物AP2-RT-f和AP2-RT-r進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，對(duì)能擴(kuò)增出目的條帶的紫花苜蓿植株標(biāo)記為轉(zhuǎn)基因植株。提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型的根系蛋白質(zhì)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡雜交試驗(yàn)［9-10］。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析 分別提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型葉片的RNA，以MsActin為內(nèi)參基因，利用引物 AP2-RT-f、AP2-RT-r、actin-f、actin-r進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。利用2-ΔΔCt法［11］分析數(shù)據(jù)。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)源激素測(cè)定 測(cè)定轉(zhuǎn)MsAP2紫花苜蓿植株和野生型植株的內(nèi)源激素脫落酸（ABA）、細(xì)胞分裂素（玉米素ZR）、生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA3）含量［12-13］。

1.2.9 轉(zhuǎn)基因植株的表型分析 對(duì)轉(zhuǎn)MsAP2紫花苜蓿和野生型植株進(jìn)行表型分析，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型的分枝數(shù)，記錄生長(zhǎng)情況、葉片形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在組織培養(yǎng)階段轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比生根情況就出現(xiàn)差異，針對(duì)轉(zhuǎn)MsAP2紫花苜蓿和野生型植株的生根能力做進(jìn)一步的試驗(yàn)，來探究MsAP2基因表達(dá)對(duì)植株生根能力的影響，所以對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型使用霍格蘭溶液進(jìn)行水培試驗(yàn)研究其生根能力的變化。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 利用Excel軟件作圖，運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD法多重比較。

2 結(jié)果

2.1 MsAP2的克隆

以紫花苜蓿cDNA為模板，MsAP2-f、MsAP2-r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得條帶清晰、符合目的基因片段大小的條帶（圖1），初步判斷MsAP2克隆成功。經(jīng)測(cè)序，表明MsAP2克隆成功。

圖1 MsAP2的克隆Fig.1 Cloning of MsAP2

2.2 MsAP2植物表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將經(jīng)NocⅠ酶切后的MsAP2克隆載體和3302-3flag載體連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽性菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，有3個(gè)單菌落在800 bp左右為單一且清晰條帶（圖2），符合預(yù)期大小，經(jīng)生物公司測(cè)序，結(jié)果比對(duì)正確，表明植物表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其命名為3302-3flag-AP2載體。

圖2 3302-3flag-AP2轉(zhuǎn)大腸桿菌Fig. 2 3302-3flag-AP2 transferred to E. coli

將3302-3flag-AP2載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗生素篩序后，進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得符合目的基因大小的條帶（圖3），表明3302-3flag-AP2植物表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中。

圖3 3302-3flag-AP2轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌Fig.3 3302-3flag-AP2 transferred to Agrobacterium

2.3 紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化

將經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的外植體在Ms-CO培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d（圖4-A），然后經(jīng)頭孢水溶液和無菌水洗去多余的農(nóng)桿菌，放在Ms-YD篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行外植體的脫分化，生長(zhǎng)5周后，經(jīng)過抗性篩選后得到具有抗性的淺黃綠色愈傷組織（圖4-B），將愈傷組織轉(zhuǎn)移至Ms-SY生芽培養(yǎng)基中，經(jīng)過3周的生芽培養(yǎng)后，愈傷組織上生長(zhǎng)出綠色的嫩芽（圖4-C），將嫩芽及時(shí)拔下使其與愈傷組織分離，將綠芽繼續(xù)放在Ms-SY 生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)3周左右后（圖4-D），將嫩芽長(zhǎng)2 cm左右，根長(zhǎng)1 cm左右的愈傷轉(zhuǎn)移至Ms-SG生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)（圖4-E），培養(yǎng)4周后將根系發(fā)達(dá)的幼苗移栽至無菌土壤中繼續(xù)培養(yǎng)，6周后獲得完整再生植株（圖4-F）。

圖4 MsAP2對(duì)紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化過程Fig.4 MsAP2 genetic transformation to M. sativa

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化體系共得到7株再生植株，提取再生植株紫花苜蓿葉片的總DNA，以DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖5）表明，在5株再生苜蓿中擴(kuò)增出符合目的基因大小的條帶，初步判斷目的基因MsAP2已經(jīng)插入到這5株紫花苜蓿的基因組DNA中。對(duì)DNA檢測(cè)呈陽性的植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖6）顯示，有4株能夠擴(kuò)增出目的基因大小條帶，表明MsAP2已經(jīng)在紫花苜蓿植株中成功轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖5 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿DNA檢測(cè)Fig. 5 DNA detection of transgenic M. sativa

圖6 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的RT-PCR檢測(cè)Fig.6 RT-PCR detection of transgenic M. sativa

通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行蛋白免疫印跡雜交試驗(yàn)，獲得一條清晰且單一的蛋白質(zhì)條帶，大小約為35 kD，而野生型植株則沒有條帶（圖7），表明MsAP2在紫花苜蓿中能夠成功翻譯出蛋白質(zhì)，并且蛋白質(zhì)分子量約為35 kD。

圖7 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的蛋白質(zhì)檢測(cè)Fig.7 Protein detection of transgenic M. sativa

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)分析

對(duì)轉(zhuǎn)MsAP2紫花苜蓿和野生型植株進(jìn)行MsAP2表達(dá)量的分析。結(jié)果（圖8）表明，轉(zhuǎn)基因植株AP2-2、AP2-3和AP2-4的MsAP2相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型（P＜0.05）。AP2-1的基因表達(dá)量最低，且顯著低于野生型，說明轉(zhuǎn)入的外源MsAP2抑制了AP2-1內(nèi)源MsAP2的表達(dá)且轉(zhuǎn)入的外源MsAP2的表達(dá)量也很低，所以AP2-1顯著低于野生型（P＜0.05），而轉(zhuǎn)入外源MsAP2對(duì)AP2-2、AP2-3和AP2-4植株的內(nèi)源MsAP2表達(dá)未見抑制作用，同時(shí)外源基因表達(dá)量增加，所以顯著高于野生型（P＜0.05），其中轉(zhuǎn)基因植株AP2-3的基因表達(dá)量為最高水平。

圖8 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的MsAP2相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of MsAP2 gene of transgenic M.sativa

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的激素含量

通過對(duì)轉(zhuǎn)MsAP2植株和野生型植株利用酶聯(lián)免疫法測(cè)量植物內(nèi)源激素含量，結(jié)果表明，除AP2-1外，其他轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)素含量均顯著高于野生型，AP2-3轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)素含量最高，為211.62 ng/g·fw，AP2-1轉(zhuǎn)基因植株含量最低，為93.61 ng/g·fw；轉(zhuǎn)基因植株的玉米素含量整體呈下降趨勢(shì)，且顯著低于野生型，AP2-3轉(zhuǎn)基因植株較野生型無顯著差異（P＜0.05）；轉(zhuǎn)基因植株的脫落酸含量呈上升趨勢(shì)，顯著高于野生型植株（P＜0.05）；除AP2-3外，其他轉(zhuǎn)基因植株的赤霉素含量均呈下降趨勢(shì)，顯著低于野生型（圖9）。

圖9 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿激素含量Fig.9 Plant hormone contents of transgenic M. sativa

2.7 轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

通過比較轉(zhuǎn)基因植株與野生型表型，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株AP2-1的分枝數(shù)顯著增多，而轉(zhuǎn)基因植株AP2-3的分枝數(shù)明顯減少（圖10），結(jié)合MsAP2相對(duì)表達(dá)量，可知轉(zhuǎn)基因植株AP2-1的MsAP2表達(dá)量最低，轉(zhuǎn)基因植株AP2-3的MsAP2表達(dá)量最高，推測(cè)MsAP2的表達(dá)可能抑制了紫花苜蓿分枝相關(guān)基因的表達(dá)，從而使分枝數(shù)減少，MsAP2對(duì)紫花苜蓿分枝數(shù)起到了負(fù)調(diào)控的作用從而間接影響了植株生物量的變化。

圖10 轉(zhuǎn)基因植株與野生型對(duì)比Fig.10 Comparison of transgenic and wild-type plants

同野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株普遍呈現(xiàn)早衰現(xiàn)象（圖11），轉(zhuǎn)基因植株的葉片大小和形狀也發(fā)生改變，野生型葉片為正常的長(zhǎng)卵形且先端銳尖或鈍圓，而轉(zhuǎn)基因植株葉片為卵圓形且葉片先端向內(nèi)凹陷（圖 12）。

圖11 轉(zhuǎn)MsAP2植株與野生型植株Fig.11 MsAP2 transgenic plants and wild-type plants

圖12 轉(zhuǎn)基因植株與野生型葉片對(duì)比Fig.12 Comparison of transgenic and wild-type leaves

轉(zhuǎn)基因植株從組織培養(yǎng)階段就表現(xiàn)出生根緩慢的現(xiàn)象，通過進(jìn)一步的霍格蘭水培試驗(yàn)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株較野生型相比根系的再生速度變慢，生根能力受到抑制，其中轉(zhuǎn)基因植株AP2-1受抑制作用明顯，且根系的生長(zhǎng)發(fā)育存在缺陷，抑制主根生長(zhǎng)主根變短且更細(xì)弱無側(cè)根生長(zhǎng)（圖13）。結(jié)合轉(zhuǎn)MsAP2植株的激素含量來看，轉(zhuǎn)基因植株的脫落酸含量整體呈上升趨勢(shì)會(huì)抑制細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)所以導(dǎo)致植株整體生根緩慢，轉(zhuǎn)基因植株AP2-1的生長(zhǎng)素含量顯著低于其他轉(zhuǎn)基因植株，綜合脫落酸和生長(zhǎng)素的含量變化，轉(zhuǎn)基因植株生根受到抑制作用，且轉(zhuǎn)基因植株AP2-1受抑制作用明顯。

圖13 轉(zhuǎn)基因植株與野生型根系對(duì)比Fig.13 Comparison of transgenic and wild-type roots

3 討論

在紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，及時(shí)調(diào)整組織培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素配比使之更適合不同階段的生長(zhǎng)需要，有研究表明在一定濃度范圍內(nèi)，隨著2，4-D和6-BA的濃度增加，出愈率和誘導(dǎo)率呈增加的趨勢(shì)，2，4-D的誘導(dǎo)發(fā)芽率明顯優(yōu)于6-BA［14］，本研究也加入了2，4-D和6-BA，通過對(duì)激素濃度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，在1 L MS培養(yǎng)基中加入4 mg的2，4-D和1 mg的6-BA時(shí)最適合紫花苜蓿的愈傷組織培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)腒T和2，4-D能夠促進(jìn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、使愈傷組織出現(xiàn)的時(shí)間提前［15］，本試驗(yàn)在遺傳轉(zhuǎn)化過程中經(jīng)過多次探索試驗(yàn)，在加入1 mg的KT時(shí)，不僅胚性愈傷組織誘導(dǎo)率增加，愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)芽率也得到了提高，這為后面的植株生長(zhǎng)提供了良好的材料基礎(chǔ)，最終順利得到轉(zhuǎn)MsAP2植株。

轉(zhuǎn)GmRAV基因煙草植株的生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重抑制作用，與野生型相比植株矮化嚴(yán)重，葉片變小變薄更幼嫩，根的伸長(zhǎng)程度變短，根系變得更短和細(xì)弱，葉片中的葉綠素含量明顯降低，光合速率明顯下降［2］，葉片是植物光合作用的主要場(chǎng)所，是植物合成有機(jī)物的場(chǎng)所，植物的光合作用減弱會(huì)顯著降低植物對(duì)有機(jī)物的積累從而影響植物的生命活動(dòng)及生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，如器官的發(fā)育，從而導(dǎo)致葉片的發(fā)育存在缺陷，對(duì)于MsAP2表達(dá)對(duì)紫花苜蓿葉綠素含量變化以及對(duì)光合速率的影響還需對(duì)轉(zhuǎn)MsAP2紫花苜蓿做進(jìn)一步的試驗(yàn)來探究。

轉(zhuǎn)基因植株普遍早衰，根系再生能力減弱，生長(zhǎng)受抑制且轉(zhuǎn)基因植株AP2-1的根系生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)素和脫落酸含量上升，其中1號(hào)植株的生長(zhǎng)素含量低于其他轉(zhuǎn)基因植株。生長(zhǎng)素是植物體中的一類天然內(nèi)源激素，能夠參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育如器官的發(fā)育、種子萌發(fā)、維管束發(fā)育、根系生長(zhǎng)，抑制側(cè)芽生長(zhǎng)等，有研究表明高濃度的生長(zhǎng)素有利于根原基的形成，促進(jìn)根系的生長(zhǎng)［16-18］。脫落酸可以使植物葉片變黃并加速其衰老脫落，誘導(dǎo)衰老基因表達(dá)［19-20］。轉(zhuǎn)MsAP2植株的脫落酸含量普遍升高，植株整體呈現(xiàn)早衰趨勢(shì)，而生長(zhǎng)素含量過高也會(huì)加速植株的衰老進(jìn)程。轉(zhuǎn)基因植株AP2-3的赤霉素和生長(zhǎng)素含量顯著高于轉(zhuǎn)基因植株AP2-1，赤霉素是植物體內(nèi)的一種重要植物激素，促進(jìn)細(xì)胞分裂與伸長(zhǎng)，尤其對(duì)莖等營(yíng)養(yǎng)器官的縱向生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，而生長(zhǎng)素也可以促進(jìn)植物莖節(jié)間的伸長(zhǎng)［21-22］。

本試驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)克隆出MsAP2，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入本體紫花苜蓿中，通過遺傳轉(zhuǎn)化體系組織培養(yǎng)技術(shù)得到轉(zhuǎn)基因植株，初步探究紫花苜蓿中MsAP2的功能，目前還不清楚MsAP2是如何參與調(diào)控作用于紫花苜蓿的，且植物單一性狀變化可能是由于植物體內(nèi)多種基因共同調(diào)節(jié)起作用的結(jié)果，所以準(zhǔn)確鑒定MsAP2在紫花苜蓿中的功能還需要對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行下一步的試驗(yàn)來分析和驗(yàn)證。本試驗(yàn)為后續(xù)MsAP2在紫花苜蓿中的研究提供了理論指導(dǎo)和材料基礎(chǔ)，也為利用分子育種技術(shù)改良苜蓿性狀提供了參考價(jià)值。

4 結(jié)論

成功獲得了轉(zhuǎn)MsAP2紫花苜蓿植株，在對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，MsAP2能夠加快轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的生長(zhǎng)進(jìn)程使植株早衰，改變?nèi)~片的大小和形態(tài)，抑制根系再生，是紫花苜蓿分枝數(shù)的負(fù)作用因子，對(duì)生長(zhǎng)素和脫落酸的合成與運(yùn)輸起到促進(jìn)作用，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的赤霉素和玉米素核苷的含量變化。