黃秋連 周 昕 王 健 張嘉賓 曹 陽(yáng)

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，大慶163319)

羊草(Leymuschinensis)為禾本科多年生冷季型牧草，廣泛生長(zhǎng)于亞洲北溫帶地區(qū)，是中國(guó)北方、蒙古高原、西伯利亞西部和東部的主要天然牧草[1]，具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、富含蛋白質(zhì)等特點(diǎn)。目前我國(guó)大部分地區(qū)通常將羊草加工成干草產(chǎn)品[2]。但是，在黑龍江絕大多數(shù)地區(qū)，在羊草的收獲季節(jié)，晾曬時(shí)正逢雨季，常常遭受雨淋，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失和發(fā)霉變質(zhì)[3]，調(diào)制干草較困難，因此青貯方式是貯藏羊草更有效的措施，能避免因雨淋導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)成分的流失[4]。但由于羊草的水溶性碳水化合物(WSC)含量較低，難以調(diào)制出優(yōu)質(zhì)青貯飼料，需要進(jìn)行添加劑青貯。

通常在乳酸菌數(shù)量至少達(dá)到105CFU/g FM時(shí)，才能保證牧草良好的發(fā)酵品質(zhì)并得以長(zhǎng)期保存[5]。然而大多數(shù)牧草附著的乳酸菌數(shù)量均低于105CFU/g FM，因此需要添加外源乳酸菌來(lái)獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料。20世紀(jì)70年代就已證明添加乳酸菌有益于青貯飼料的發(fā)酵，特別是同型發(fā)酵乳酸菌，可以確保牧草青貯以乳酸發(fā)酵為主導(dǎo)，從而提高牧草的發(fā)酵品質(zhì)[6-7]。Cai等[5,8-9]研究表明，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Chikuso-1是一種很有潛力的全株水稻青貯乳酸菌添加劑。Cao等[10-11]報(bào)道，與對(duì)照組相比，LactobacillusplantarumChikuso-1處理的青貯飼料pH降低，乳酸含量和干物質(zhì)消失率提高。李苗苗等[12]將乳酸菌添加到油莎草青貯中，可有效地改善油莎草青貯發(fā)酵品質(zhì)，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。糖蜜可為乳酸菌提供更多的發(fā)酵底物，使乳酸發(fā)酵迅速占據(jù)主導(dǎo)地位，已作為一種綠色、安全的發(fā)酵促進(jìn)劑被廣泛使用。Alli等[13]報(bào)道，銀合歡青貯過(guò)程中添加糖蜜可以降低pH，減少干物質(zhì)損失，增加乳酸和水溶性碳水化合物含量。靳思玉等[14]研究顯示，添加糖蜜可以提高油莎草的青貯發(fā)酵品質(zhì)和黃酮含量。在新鮮牧草青貯初期，由于pH較高，并有部分氧氣存在，植物表面附著的好氧性微生物活躍，消耗青貯原料中的養(yǎng)分[11]，因此如何迅速降低pH，抑制好氧性微生物的活性，減少養(yǎng)分損失，對(duì)于成功青貯至關(guān)重要。張志登等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加無(wú)機(jī)酸可提高黃貯玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)和體外干物質(zhì)消失率，減少甲烷生成量。靳思玉等[16]報(bào)道，苜蓿青貯時(shí)添加無(wú)機(jī)酸，可以抑制有害微生物的增殖，顯著提高苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。

本試驗(yàn)采用小規(guī)模發(fā)酵法，以羊草為原料，研究乳酸菌、糖蜜、無(wú)機(jī)酸作為青貯添加劑對(duì)羊草青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分含量、發(fā)酵品質(zhì)及體外瘤胃干物質(zhì)消失率的影響，為優(yōu)質(zhì)羊草青貯飼料的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用羊草的供給地為黑龍江省大慶市天然草場(chǎng)，羊草鍘短至1～2 cm，水分含量調(diào)整為60%；青貯添加劑：乳酸菌制劑(LactobacillusplantarumChikuso-1)，由日本某研究所提供，活菌數(shù)約為105CFU/g；糖蜜：由成都某商貿(mào)有限公司提供，總糖(蔗糖+還原糖)含量≥40%，波美度(°Bé)≥33.333；無(wú)機(jī)酸：由1 mol/L H2SO4和2 mol/L HCl以體積比4∶1混合而成的混合酸。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，在羊草青貯時(shí)設(shè)置5個(gè)處理：1)無(wú)添加(C組，作為對(duì)照組)；2)添加0.000 25%乳酸菌(LAB組)；3)添加4%糖蜜(M組)；4)添加4%無(wú)機(jī)酸(IA組)；5)添加0.000 25%乳酸菌+4%糖蜜(LAB+M組)。青貯添加劑的添加量均為鮮重基礎(chǔ)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將羊草與青貯添加劑混勻后裝入16 cm×25 cm聚乙烯袋(每袋約200 g)，抽真空密封，室溫下保存120 d后開封取樣分析。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 感官品質(zhì)

開封后鑒定羊草青貯飼料的顏色、氣味、質(zhì)地、霉變等感官品質(zhì)，判定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[17]。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)

1.3.3 微生物培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

稱取10 g羊草青貯飼料，與90 mL蒸餾水混勻過(guò)濾，在無(wú)菌操作環(huán)境中，用蒸餾水將浸出液從10-1連續(xù)梯度稀釋到10-5備用。乳酸菌采用MRS肉湯培養(yǎng)基(30 ℃厭氧，48 h)，梭菌孢子采用Clostridia Count Agar培養(yǎng)基(30 ℃厭氧，48 h)，霉菌和酵母菌采用Potato Dextrose Agar培養(yǎng)基(30 ℃，48 h)，好氧性細(xì)菌和芽孢桿菌采用Nutrient Agar培養(yǎng)基(30 ℃，48 h)，大腸桿菌采用Blue Light Broth培養(yǎng)基(30 ℃，48 h)培養(yǎng)后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算各菌落總數(shù)，用每克新鮮樣品中菌落形成單位的對(duì)數(shù)表示[lg(CFU/g FM)][20]。所用培養(yǎng)基均由青島海博生物有限公司提供。

1.3.4 體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)

用2個(gè)裝瘤胃瘺管的成年羯羊(平均初始體重32.0 kg)作為瘤胃液供體。飼料供應(yīng)參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)，每天06:00和18:00分別飼喂1次，自由飲水[12]。飼喂后2 h經(jīng)瘤胃瘺管取瘤胃液，4層紗布過(guò)濾后，以相同的體積混合轉(zhuǎn)入塑料瓶。將混合后的濾液通入CO2氣體，以1∶4的體積比與McDougal緩沖液(pH 6.8)混合形成瘤胃緩沖液，然后將50 mL瘤胃緩沖液轉(zhuǎn)移到128 mL的含0.5 g羊草青貯飼料樣品的血清瓶中，通入CO2氣體排出空氣。用丁基橡膠塞和鋁蓋將血清瓶密封后于恒溫培養(yǎng)振蕩搖床(39 ℃，100 r/min)培養(yǎng)48 h后，測(cè)定pH、產(chǎn)氣量、干物質(zhì)消失率[10]。所用儀器及設(shè)備均由黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3.5 營(yíng)養(yǎng)成分含量

將剩余的羊草青貯飼料于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(65 ℃，48 h)烘至恒重后，粉碎并過(guò)2 mm篩后分析營(yíng)養(yǎng)成分。采用AOAC(1990)[19]的934.01、976.05、920.39和942.05方法，分析干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(Ash)含量。參照Van Soest等[21]的方法，分析中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010計(jì)算與整理后，使用SAS 9.4進(jìn)行方差分析，并用Tukey法進(jìn)行多重比較，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草青貯飼料的感官品質(zhì)

由表1可知，對(duì)照組的羊草青貯飼料以黃褐色為主，各添加劑組均為黃綠色；各添加劑組的羊草青貯飼料比對(duì)照組的酸味更濃；各組羊草青貯飼料總體為質(zhì)地柔軟、濕潤(rùn)不黏手、無(wú)霉變。

表1 羊草青貯飼料的感官品質(zhì)

2.2 青貯前羊草及其經(jīng)不同處理青貯后的營(yíng)養(yǎng)成分含量

由表2可知，試驗(yàn)所用羊草青貯前DM、CP、EE、NDF、ADF、Ash含量分別為34.10%、7.90%、2.23%、66.16%、29.95%和6.99%。添加不同青貯添加劑進(jìn)行青貯后，M組和LAB+M組的DM含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；IA組的CP含量顯著高于其他各組(P<0.05)；LAB+M組的NDF含量顯著低于其他各組(P<0.05)；各添加劑組的ADF含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；各組間EE和Ash含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 青貯前羊草及其經(jīng)不同處理青貯后的營(yíng)養(yǎng)成分含量

2.3 羊草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)

由表3可知，各添加劑組pH均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中IA組pH最低，為4.41；LAB+M組的乳酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，所有添加劑組的氨態(tài)氮/總氮都有不同程度的下降，其中M組和IA組的氨態(tài)氮/總氮顯著低于其他各組(P<0.05)；各組均未檢出丁酸。

表3 羊草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)

2.4 羊草青貯飼料的微生物數(shù)量

由表4可知，各添加劑組的乳酸菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中LAB+M組的乳酸菌數(shù)量最高；LAB組的芽孢桿菌數(shù)量顯著低于其他各組(P<0.05)；M組的酵母菌數(shù)量最高，且顯著高于對(duì)照組和LAB組(P<0.05)；各組間好氧性細(xì)菌數(shù)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，且均未檢出大腸桿菌、梭菌和霉菌。

表4 羊草青貯飼料的微生物數(shù)量

2.5 羊草青貯飼料的體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表5可知，各組pH無(wú)顯著差異(P>0.05)；除M組外，其他添加劑組與對(duì)照組相比產(chǎn)氣量均出現(xiàn)不同程度的增加，其中LAB+M組的產(chǎn)氣量最高；LAB+M組的體外干物質(zhì)消失率顯著高于對(duì)照組和LAB組(P<0.05)。

表5 羊草青貯飼料的體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)

3 討 論

本試驗(yàn)中，各組羊草青貯飼料均表現(xiàn)為質(zhì)地柔軟、水分適宜、有濃厚酸味，相較于羊草原料本身，其質(zhì)地和適口性得到明顯改善。其中，對(duì)照組為黃褐色，各添加劑組均為黃綠色，且各添加劑組的酸香味也比對(duì)照組更濃厚，符合優(yōu)質(zhì)青貯飼料的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[22]。

乳酸菌在青貯發(fā)酵中起著重要作用，乳酸菌數(shù)量已成為預(yù)測(cè)青貯飼料發(fā)酵的充分性和決定青貯飼料是否添加外源乳酸菌的重要因素。本試驗(yàn)所用的乳酸菌菌株為L(zhǎng)actobacillusplantarumChikuso-1，該菌株能促進(jìn)乳酸發(fā)酵，在低pH環(huán)境下生長(zhǎng)良好[11]。因此，用該菌株制備青貯飼料可以促進(jìn)乳酸菌的增殖，降低pH，抑制梭菌和其他微生物的生長(zhǎng)，使青貯飼料的品質(zhì)得以提高[5]。在本試驗(yàn)中，添加乳酸菌組與對(duì)照組相比，乳酸含量增加，pH顯著降低，氨態(tài)氮/總氮降低，未檢測(cè)出大腸桿菌、梭菌和霉菌，這是因?yàn)樘砑尤樗峋黾恿饲噘A發(fā)酵初期的乳酸菌數(shù)量，彌補(bǔ)了原料中乳酸菌數(shù)量的不足，很快進(jìn)入乳酸發(fā)酵階段，pH迅速下降，有害微生物的活性被抑制[23]。

糖蜜所含的WSC可以被乳酸菌直接利用，添加到青貯中可以促進(jìn)青貯早期乳酸菌的繁殖，快速達(dá)到穩(wěn)定的青貯發(fā)酵階段，抑制其他雜菌對(duì)發(fā)酵底物的消耗和蛋白質(zhì)的水解。吳金彩等[24]添加不同水平糖蜜青貯全株“張雜谷”，結(jié)果表明4%糖蜜組的各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)較好。孫肖慧等[25]報(bào)道，紫花苜蓿和燕麥以3∶7混合后添加4%糖蜜青貯，可使丁酸含量和氨態(tài)氮/總氮顯著降低。本研究結(jié)果顯示，添加4%糖蜜制備的羊草青貯飼料的pH、ADF含量和氨態(tài)氮/總氮降低，CP含量增加，與吳金彩等[24]和孫肖慧等[25]研究結(jié)果一致；同時(shí)，添加糖蜜組的酵母菌數(shù)量不同程度高于其他各組，這是由于添加糖蜜后，殘留的WSC和乳酸含量相對(duì)較高，而這2種物質(zhì)被用作酵母菌的底物[26]。與對(duì)照組相比，添加糖蜜組的乳酸含量沒(méi)有顯著增加，而添加乳酸菌+糖蜜組乳酸含量顯著增加，與Cao等[10]的報(bào)道一致，這可能是因?yàn)榧词共惶砑犹敲?，羊草青貯中也有足夠的可發(fā)酵糖，乳酸菌可能已經(jīng)將更多的可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乳酸。

酸處理可使飼料pH迅速下降，達(dá)到適于乳酸菌生長(zhǎng)繁殖的條件，同時(shí)抑制有害菌的繁殖。張志登等[15]添加4%無(wú)機(jī)酸黃貯玉米秸稈，靳思玉等[16]添加8%無(wú)機(jī)酸青貯紫花苜蓿，結(jié)果表明4%和8%無(wú)機(jī)酸的添加均可使pH顯著下降，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。本試驗(yàn)研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，同時(shí)本試驗(yàn)中添加無(wú)機(jī)酸組的氨態(tài)氮/總氮顯著低于對(duì)照組，CP含量顯著高于其他組，這是由于pH的迅速降低有效地抑制了植物酶和微生物水解蛋白酶的活性，進(jìn)而使蛋白質(zhì)的降解和后期游離氨基酸的分解減少。

添加乳酸菌+糖蜜組的DM和乳酸含量顯著高于其他組，這可能是由于兩者的加入不僅補(bǔ)充了發(fā)酵底物，也增加了乳酸菌數(shù)量，促進(jìn)了青貯早期乳酸菌的增殖，從而使乳酸菌能夠生產(chǎn)更多的乳酸，使pH迅速下降，抑制有害微生物增殖，減少了營(yíng)養(yǎng)成分的損失[27]。

瘤胃液pH可以反映瘤胃內(nèi)部環(huán)境與發(fā)酵程度，微生物的活動(dòng)和繁殖要求環(huán)境保持一定的pH，其正常變化范圍為5.5～7.5[28]。本研究中，體外培養(yǎng)液的pH均處于此范圍內(nèi)，為6.78～7.21，不會(huì)影響微生物的活力。飼料體外發(fā)酵產(chǎn)氣的底物主要是碳水化合物，產(chǎn)氣量可以反映瘤胃微生物利用底物的程度，也可以體現(xiàn)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低[29]。程鵬輝等[30]研究表明，產(chǎn)氣量越大，牧草發(fā)酵品質(zhì)越好。體外干物質(zhì)消失率反映發(fā)酵體系中微生物降解飼料的程度[12]。本試驗(yàn)中，羊草青貯飼料的體外產(chǎn)氣量和干物質(zhì)消失率最大的均為添加乳酸菌+糖蜜組，可見(jiàn)同時(shí)添加乳酸菌和糖蜜時(shí)羊草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最好。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)所使用的青貯添加劑均能在不同程度上改善羊草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和體外干物質(zhì)消失率，綜合考慮，以同時(shí)添加乳酸菌和糖蜜的效果最好。