王笑笑，季小詩(shī)，劉芳，趙月，郭紅蓮

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

番茄，又名西紅柿，其味道酸甜可口，富含維生素、番茄紅素以及多種微量元素，具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健作用，有“蔬菜中的水果”之稱[1]，2018年全球種植面積達(dá)到4.76×106hm2[2]。然而，番茄在貯運(yùn)期間由于機(jī)械損傷、植物組織衰老等處于易受各種真菌侵染的狀態(tài)[3]，經(jīng)常造成大量經(jīng)濟(jì)損失。其中，引發(fā)果實(shí)灰霉病的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是最具破壞性的真菌之一[4-5]，嚴(yán)重制約著番茄果實(shí)貯運(yùn)和保鮮業(yè)的發(fā)展。盡管化學(xué)合成殺菌劑是目前最有效、最常用的控制采后病害的方法，但毒性更小、更不易產(chǎn)生抗藥性的生物防治技術(shù)近年來(lái)更加受到人們的青睞，尤其是將酵母作為拮抗劑應(yīng)用到采后果蔬中[6-7]。

拮抗酵母菌能夠通過營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、分泌抑菌物質(zhì)和提高宿主的抗性等[8]作用方式對(duì)多種植物病原菌產(chǎn)生抑制作用，目前已被國(guó)內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注。Zhang等[9]分離篩選出了一株對(duì)梨青霉病具有很好防治的菌株，經(jīng)鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；Meng 等[10]發(fā)現(xiàn)在葡萄采前噴施羅倫隱球酵母（C.laurentii）并結(jié)合殼聚糖的使用，可有效防止葡萄腐爛變質(zhì)；Paiva等[11]發(fā)現(xiàn)酵母菌與氣調(diào)包裝聯(lián)合應(yīng)用對(duì)櫻桃果實(shí)采后青霉病具有一定的抑制效果。除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)畢赤酵母對(duì)蘋果采后青霉病及番茄采后根霉果腐病具有很好的抑制作用[12-14]，膜醭畢赤酵母和殼聚糖復(fù)合處理對(duì)柑橘果實(shí)炭疽病具有很好的抑制作用[15]。

本文通過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化以及內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）序列分析對(duì)菌株KD-16J進(jìn)行鑒定，并以該菌株為出發(fā)菌株，研究其在離體平板和番茄果實(shí)上對(duì)灰葡萄孢菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄：選取大小一致、色澤飽滿、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲害的番茄果實(shí)作為試驗(yàn)材料，清洗后用2%（體積分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉進(jìn)行消毒（浸泡2 min），自來(lái)水充分沖洗2 min，放置在通風(fēng)處晾干備用。

灰葡萄孢菌：按組織分離法[16]從具有灰霉病的番茄上分離純化和保存。

生防菌KD-16J：天津科技大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品物流保鮮與加工研究室提供，經(jīng)ICR小鼠毒性經(jīng)口試驗(yàn)無(wú)急性毒性。

瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、蔗糖、尿素、硫酸銨、硝酸銨、（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乳糖（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

立式圧力蒸氣滅菌鍋（YXQ-LS-500）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈操作臺(tái)（ZHJH-CII09B）：上海智城分析儀器制造有限公司；迷你雙垂直電泳儀（DZCZ-24DN）：鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；基因擴(kuò)增儀（BLD8-PCR-2）：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生防菌KD-16J的鑒定

1.3.1.1 生防菌KD-16J形態(tài)特征觀察

參照馬巖石等[17]的方法，觀察生防菌KD-16J在PDA液體和固體培養(yǎng)基中的形態(tài)特征。

1.3.1.2 生防菌KD-16J生理生化試驗(yàn)鑒定

參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[18]對(duì)菌株KD-16J進(jìn)行糖酵解、碳源同化、氮源同化以及生長(zhǎng)溫度等生理生化反應(yīng)鑒定。

1.3.1.3 生防菌KD-16J ITS序列分析

提取生防菌KD-16J的基因組DNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增該菌株的ITS序列區(qū)域[19]。將純化后的PCR產(chǎn)物交給上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用BLAST程序進(jìn)行相似序列搜索，下載同源性較高的序列，通過MEGA 7.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

1.3.2 生防菌KD-16J對(duì)灰霉病菌的離體抑制作用

1.3.2.1 不同濃度生防菌KD-16J對(duì)灰霉菌絲生長(zhǎng)的影響

參照余巧銀等[20]的方法進(jìn)行。將培養(yǎng)7 d的灰葡萄孢菌邊緣用打孔器接種到含不同濃度生防菌KD-16J的平板上，在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。每天從平板背面觀察，采用十字交叉法測(cè)量病原菌的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。每組處理重復(fù)3次。

1.3.2.2 不同濃度生防菌KD-16J對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的影響

參照Z(yǔ)hang等[9]的方法，將灰葡萄孢菌的孢子懸浮液分別加入含不同濃度生防菌KD-16J的液體PDA中，置于25℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔4 h在光學(xué)顯微鏡下測(cè)定孢子萌發(fā)率。試驗(yàn)重復(fù)3次。孢子萌發(fā)率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算（以孢子芽管長(zhǎng)度超過孢子長(zhǎng)徑視為萌發(fā)）。

1.3.2.3 生防菌KD-16J對(duì)灰霉菌抑制作用的顯微鏡觀察

將培養(yǎng)7 d的灰葡萄孢邊緣用打孔器接種到含1×108CFU/mL酵母細(xì)胞的PDA平板上，以含無(wú)菌水的PDA平板作為對(duì)照組，5 d后分別挑取灰霉菌絲進(jìn)行顯微觀察。

1.3.3 生防菌KD-16J對(duì)番茄灰霉病的生防效果

1.3.3.1 生防菌KD-16J對(duì)番茄采后病害自然侵染的防效

將1×108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸液噴灑在已經(jīng)經(jīng)過預(yù)處理的番茄果實(shí)上，以無(wú)菌水組作為對(duì)照組，25℃條件下貯藏12 d，計(jì)算果實(shí)發(fā)病率。每次試驗(yàn)處理10個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.2 生防菌KD-16J對(duì)有傷接種灰葡萄孢菌果實(shí)的防效

參照程雷等[21]的方法并修改，在經(jīng)過預(yù)處理的番茄果實(shí)上的腰部用無(wú)菌打孔器打兩個(gè)孔（長(zhǎng)5 mm，深約3 mm）。自然晾干后分別噴灑濃度為1×108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸液和無(wú)菌蒸餾水，然后向每孔中定量注入10 μL濃度為1×105個(gè)/mL的灰葡萄孢菌孢子懸液。待菌液吸收后，使用保鮮袋進(jìn)行單果包裝，外罩保鮮膜以保持90%～95%左右的相對(duì)濕度，于25℃室溫條件下貯藏。每隔24 h進(jìn)行果實(shí)發(fā)病率的觀察測(cè)定。每次試驗(yàn)處理10個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.3 生防菌KD-16J不同處理時(shí)間對(duì)番茄灰霉病害的防治效果

對(duì)經(jīng)過預(yù)處理的番茄果實(shí)進(jìn)行打孔處理，在接種灰霉菌孢子懸浮液之前的36、24、12、0 h以及接種孢子懸浮液之后的12、24、48 h，分別對(duì)果實(shí)進(jìn)行噴施濃度為1×108CFU/mL的酵母細(xì)胞懸液，以無(wú)菌水的處理作為對(duì)照，檢測(cè)果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。每組處理3個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 生防菌KD-16J在番茄果實(shí)傷口處生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的測(cè)定

參照1.3.3.2的實(shí)驗(yàn)組的方法處理番茄果實(shí)，以接種l h后測(cè)定的生防菌KD-16J數(shù)目為起始值，每24 h取樣測(cè)定1次果實(shí)傷口處的酵母數(shù)。參照趙妍[22]的方法，用打孔器挖下傷口，放入盛有無(wú)菌磷酸鹽緩沖液的研缽之中，研磨成勻漿。用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，采用涂布平板法涂布于PDA平板上，培養(yǎng)48 h后測(cè)定拮抗酵母的數(shù)目。每組處理3個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯氏多重比較法在P=0.05的水平下進(jìn)行檢驗(yàn)，Excel 2016分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌KD-16J的鑒定

2.1.1 菌株KD-16J形態(tài)觀察

菌株KD-16J形態(tài)觀察如圖1所示。

圖1 菌株KD-16J平板培養(yǎng)的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of the strain KD-16J on potato dextrose agar

菌株KD-16J菌落在PDA平板上呈乳白色奶酪狀，表面平滑濕潤(rùn)有光澤，質(zhì)地黏稠，具有芳香味，前期菌落邊緣較整齊飽滿，后期菌落邊緣成發(fā)散性樹狀分枝。在液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生一層質(zhì)地濕潤(rùn)平滑的醭膜。

2.1.2 菌株KD-16J生理生化鑒定

對(duì)生防菌進(jìn)行生理生化鑒定，其結(jié)果如表1所示。

KD-16J菌株在厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，但不發(fā)酵乳糖和可溶性淀粉。在有氧條件下可以同化葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉以及硝酸銨、硫酸銨、尿素。在低溫4℃下不生長(zhǎng)，50℃時(shí)出現(xiàn)弱生長(zhǎng)現(xiàn)象，高溫達(dá)到70℃也不再生長(zhǎng)。

2.1.3 ITS結(jié)果分析與發(fā)育樹的構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果通過BLAST分析，選取相似度較高的序列進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建，如圖2所示。

由圖2可知，該株拮抗菌與膜醭畢赤酵母菌（Pichia membranifaciens）的親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)和生理生化鑒定可確定生防菌KD-16J是膜醭畢赤酵母菌。

2.2 生防菌KD-16J對(duì)灰霉病菌的離體抑制作用

2.2.1 生防菌KD-16J對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將灰葡萄孢菌接種到含不同濃度生防菌KD-16J的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況見圖3。

圖3（a）可以明顯看出，不含生防菌KD-16J的對(duì)照組的灰霉菌落長(zhǎng)得非常迅速，試驗(yàn)組的病原菌得到了明顯的抑制。圖3（b）表明生防菌KD-16J濃度越高，對(duì)灰葡萄孢菌的抑制率越大。1×107CFU/mL和1×108CFU/mL的生防菌KD-16J處理下的灰霉菌落抑制率高達(dá)77.89%和85.53%，抑制作用顯著（P＜0.05）。

2.2.2 生防菌KD-16J對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的影響

生防菌KD-16J對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的影響見圖4。

如圖4所示，濃度為1×105CFU/mL的生防菌KD-16J處理的灰霉孢子的萌發(fā)率在初始階段要低于對(duì)照組，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其萌發(fā)率會(huì)逐漸增大。當(dāng)生防菌的濃度為1×107CFU/mL時(shí)，萌發(fā)率顯著降低，最大值僅為22.5%，當(dāng)用濃度為1×108CFU/mL的生防菌KD-16J溶液處理時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率基本達(dá)到了100%，即使在培養(yǎng)36 h甚至48 h之后，仍沒有明顯的孢子萌發(fā)現(xiàn)象。因此，生防菌KD-16J的最佳抑菌濃度為 1×108CFU/mL。

圖2 生防菌KD-16J系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of biocontrol strain KD-16J

圖3 不同濃度生防菌KD-16J懸液對(duì)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Inhibiting effects of various cell suspension concentration of strain KD-16J on colony diameter of B.cinerea

圖4 不同濃度生防菌KD-16J懸液處理對(duì)灰霉菌孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of various cell suspension concentration of the strain KD-16J on spore germination of B.cinerea

2.2.3 生防菌KD-16J對(duì)灰葡萄孢菌抑制作用的顯微鏡觀察

生防菌KD-16J對(duì)灰葡萄孢菌抑制作用的顯微鏡觀察結(jié)果見圖5。

圖5 生防菌KD-16J與灰葡萄孢菌在40倍顯微鏡下的相互作用觀察Fig.5 The interactions observed of the strain KD-16J and Botrytis cinerea with forty times electron microscope

如圖5（a）所示，對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)相對(duì)規(guī)則粗壯、表面光滑，菌絲致密、簇?fù)沓蓤F(tuán)，菌絲隔清晰易辨，菌絲細(xì)胞內(nèi)容物飽滿且分布均勻；而試驗(yàn)組菌絲周圍緊密附著生防菌，且菌絲分枝處密度相對(duì)較高，菌絲生長(zhǎng)粗細(xì)不均，雜亂無(wú)序，菌絲鈍化現(xiàn)象明顯，菌絲出現(xiàn)內(nèi)容物逐漸凝聚、空泡化，甚至出現(xiàn)滲漏等現(xiàn)象。

2.3 生防菌KD-16J對(duì)番茄灰霉病的生防效果

2.3.1 生防菌KD-16J對(duì)番茄采后病害自然侵染的防效

生防菌KD-16J對(duì)番茄采后病害自然侵染的防效如圖6所示。

圖6 生防菌KD-16J對(duì)番茄果實(shí)自然病害發(fā)病率的防治效果Fig.6 The control effects of the strain KD-16J on the disease incidence of naturally infection of tomato fruit

在番茄果實(shí)貯藏前，對(duì)其噴施1×108CFU/mL的生防菌KD-16J懸液，自然病害的發(fā)生機(jī)率較之對(duì)照組可以得到顯著降低（P＜0.05）。

貯藏第6天，和對(duì)照組的5.14%相比，拮抗酵母處理仍可以完全防治自然病害的發(fā)生。直至貯藏的第12天，與對(duì)照組的發(fā)病率為49.97%相比，噴施拮抗酵母處理的番茄果實(shí)自然病害發(fā)生率僅為16.67%，防治效果明顯。

2.3.2 生防菌KD-16J對(duì)番茄灰霉病有傷接種侵染的防效

生防菌KD-16J懸液噴灑處理對(duì)番茄灰霉病的抑制效果見圖7。

圖7 生防菌KD-16J懸液噴灑處理對(duì)番茄灰霉病的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of strain KD-16J suspension spraying on tomato gray mold

如圖7所示，提前噴灑生防菌KD-16J懸液的采后番茄灰霉病害發(fā)病率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。貯藏初期，對(duì)照組果實(shí)發(fā)病率快速增加，至貯藏第5天，所有對(duì)照組的果實(shí)已經(jīng)完全發(fā)病，而噴灑處理的拮抗酵母由于在番茄果實(shí)表面快速繁殖生長(zhǎng)，起到很好的防治效果，因而貯藏初期試驗(yàn)組果實(shí)的發(fā)病率較低，至貯藏第5天拮抗酵母處理組發(fā)病率僅為57.12%，到貯藏結(jié)束仍沒有達(dá)到完全發(fā)病。

2.3.3 生防菌KD-16J的不同噴灑時(shí)間對(duì)番茄灰霉病害的防治效果

生防菌KD-16J的不同噴灑時(shí)間對(duì)番茄灰霉病害的防治效果見圖8。

圖8 生防菌KD-16J的不同噴灑時(shí)間對(duì)番茄灰霉病害的防治效果Fig.8 The inhibiting effects of application times of the strain KD-16J on tomato gray mold disease

如圖8（a）所示，通過測(cè)量計(jì)算番茄傷口處的發(fā)病率和病斑直徑，發(fā)現(xiàn)生防菌噴灑時(shí)間對(duì)番茄果實(shí)的灰霉病斑直徑影響顯著。如圖8（b）所示，至貯藏期結(jié)束，生防菌KD-16J先于灰霉菌36 h處理時(shí)，其發(fā)病率僅為29.12%，病斑直徑平均僅為6 mm，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著生防菌KD-16J噴灑時(shí)間的延遲，番茄果實(shí)發(fā)病率會(huì)逐漸增加，生防菌噴灑時(shí)間晚于灰霉菌48 h的番茄果實(shí)至貯藏期結(jié)束則已完全發(fā)病，番茄果實(shí)的病斑直徑也隨之增大。根據(jù)Filonow等[23]的研究表明，拮抗酵母菌能夠從果汁或糖溶液中快速消耗糖，利用糖類物質(zhì)比灰葡萄孢菌更具優(yōu)勢(shì)，所以將生防菌KD-16J和灰霉菌同時(shí)接種到番茄果實(shí)上，酵母菌利用糖類的速度比病原菌快，可以在短時(shí)間內(nèi)利用果實(shí)傷口處的營(yíng)養(yǎng)迅速繁殖，搶占生存空間，成為主導(dǎo)菌，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)。

2.4 生防菌KD-16J在番茄果實(shí)傷口處生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的測(cè)定

生防菌KD-16J在番茄果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)見圖9。

圖9 生防菌KD-16J在番茄果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)Fig.9 Population dynamics of the strain KD-16J in wounds of tomato fruit

圖9結(jié)果表明，拮抗酵母KD-16J可以較好地適應(yīng)番茄果實(shí)傷口處的環(huán)境，培養(yǎng)初期生防菌KD-16J數(shù)量增殖較快，至第48小時(shí)生防菌KD-16J繁殖量達(dá)到最大值。此后，生防菌KD-16J數(shù)量基本維持在較高的濃度范圍內(nèi)，并始終高于初始測(cè)定值。

3 結(jié)論與討論

酵母菌是人類應(yīng)用最早的微生物，也是目前人們研究最為透徹的微生物[24]。酵母菌之所以能夠成為化學(xué)殺菌劑的潛在替代品，除了其對(duì)多種植物病原菌如灰霉菌、青霉菌等具有拮抗作用外，它還具有定殖能力強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，干燥環(huán)境下也能存活，以及不會(huì)產(chǎn)生致敏性孢子和霉菌毒素等特點(diǎn)[25]。本試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室分離篩選的一株生防菌KD-16J，通過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)以及ITS序列分析，鑒定為P.membranifaciens的一株。通過離體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生防菌KD-16J對(duì)灰葡萄孢菌菌落擴(kuò)展、孢子萌發(fā)均存在明顯的抑制作用，且隨著酵母細(xì)胞濃度的增大，抑制效果也逐漸增強(qiáng)。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與生防菌KD-16J共培養(yǎng)的灰葡萄孢菌菌絲粗細(xì)不均，鈍化現(xiàn)象明顯，會(huì)出現(xiàn)內(nèi)容物逐漸凝聚、空泡化現(xiàn)象?；铙w試驗(yàn)（番茄）表明生防菌KD-16J具有抑制番茄灰霉病、降低番茄發(fā)病率的作用，同時(shí)，噴灑生防菌KD-16J的時(shí)間越早，抑菌效果越好。番茄果實(shí)傷口處生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)發(fā)現(xiàn)KD-16J能夠很快在番茄表面定殖，這進(jìn)一步表明和病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)與生存空間是該株酵母重要的拮抗機(jī)理。本試驗(yàn)不僅為P.membranifaciens防治番茄灰霉病提供一定的理論參考，也為生物防治技術(shù)應(yīng)用于果蔬保鮮提供了依據(jù)。