黃玉軍，周帆，于俊娟，李穎華，顧瑞霞

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225127）

大豆異黃酮是大豆在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，又稱(chēng)植物雌激素，可以抗抑郁[1]、預(yù)防心血管疾病[2]、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[3-4]、預(yù)防并改善乳腺癌、前列腺癌[5]、緩解更年期綜合癥、神經(jīng)保護(hù)作用[6]等。已發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮有12種，其中3種為游離型苷元結(jié)構(gòu)（2%～3%），能被小腸上皮直接吸收，生物活性較高，是人體可以利用的有效形式，如大豆苷元、染料木素、黃豆苷等，剩余為結(jié)合型糖苷結(jié)構(gòu)（97%～98%），不能被人體小腸有效吸收，生物利用度極低（＜5%），如大豆苷、染料木苷、黃豆苷元等[7]。大豆異黃酮的形態(tài)結(jié)構(gòu)是決定其生理活性和生物利用率的關(guān)鍵因素，因此，當(dāng)前研究熱點(diǎn)主要集中于將結(jié)合型糖苷轉(zhuǎn)化為游離型苷元。

水解大豆異黃酮的酶有β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡萄糖酸酶、生物乳糖酶等，前人研究較多的是β-葡萄糖苷酶，可將外源糖苷轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的苷元和葡萄糖[8]。酶水解大豆異黃酮反應(yīng)條件溫和，具有很強(qiáng)的專(zhuān)一性，但成本較高[9]。微生物繁殖周期不長(zhǎng)，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，降低高額酶成本[10]。自然界中已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的真菌有黑曲霉、紅酵母、米曲霉等，其中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶效率最高的是黑曲霉。然而，大部分霉菌如黑曲霉并不是食品安全級(jí)菌株，如果要將產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株應(yīng)用于食品中，乳酸菌更為合適。食品級(jí)的乳酸菌發(fā)酵能力和微生物轉(zhuǎn)化是功能性代謝產(chǎn)物富集的關(guān)鍵。乳酸菌中β-葡萄糖苷酶活性較高的有干酪乳桿菌、加式乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌等[11]。

傳統(tǒng)乳產(chǎn)品銷(xiāo)售正在逐年下降，而植物基飲料正在沖擊市場(chǎng)[12]，營(yíng)養(yǎng)與口感兼?zhèn)涞亩谷榛驅(qū)⒊蔀樗厥持髁x和乳糖不耐受人群的首選代乳產(chǎn)品。豆乳經(jīng)發(fā)酵后既能發(fā)揮大豆的營(yíng)養(yǎng)及功能特性，又能利用乳酸菌的益生作用產(chǎn)生許多大豆中原本沒(méi)有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，乳酸菌含有的β-葡萄糖苷酶還可以水解大豆異黃酮的糖苷結(jié)構(gòu)向生物活性更高的游離型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，大大提高了大豆異黃酮的生物利用率。

本研究旨在篩出高轉(zhuǎn)化大豆異黃酮的乳酸菌，并研究其在豆乳中的發(fā)酵特性，實(shí)現(xiàn)大豆異黃酮糖苷向苷元的轉(zhuǎn)化，以增加發(fā)酵豆乳中大豆異黃酮苷元含量，提高生物活性和利用度，為研制富含功能活性物質(zhì)的發(fā)酵豆乳提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

140株乳酸菌：江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大豆、白砂糖：揚(yáng)州市邗江區(qū)永輝超市；七葉苷、二甲亞砜：生工生物工程（上海）股份有限公司；染料木素、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸鐵、甲醇、磷酸（色譜純）、乙腈（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272型）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高壓均質(zhì)機(jī)（APV1000型）：美國(guó)SPX集團(tuán)；離心機(jī)（H1650-W型）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；超純水系統(tǒng)（milli-Q direct 8型）：法國(guó)Millipore公司；高效液相色譜儀（1260 Infinity型）：美國(guó)Agilent Technologies公司；酸度計(jì)（PHS-3E型）：上海雷磁儀器廠；凝膠圖像分析系統(tǒng)（3026型）：法國(guó)VILBER公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（Nexus+x2eco型）：德國(guó)艾本德公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的活化

將甘油保存的供試菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，活化傳代2次，以保證使用前菌株的活力充分恢復(fù)。

1.3.2 產(chǎn)酶菌株篩選

配制七葉苷和檸檬酸鐵的特殊瓊脂培養(yǎng)基，在MRS液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的七葉苷和0.05%的檸檬酸鐵，再加1.8%的瓊脂，滅菌后在60℃左右趁熱加注250 μL到96孔板的每個(gè)孔里。等平板凝固后取培養(yǎng)24 h的乳酸菌液10 μL按編號(hào)次序加到96孔板中。倒置48 h培養(yǎng)后孔洞變成黑色的則為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株[13]。

1.3.3 豆乳發(fā)酵工藝

除雜→清洗→浸泡[干豆∶水=1∶3（g/mL），4 ℃，14 h]→熱燙（0.5% NaHCO3溶液，6 min）→磨漿[濕豆∶水=1∶7（g/mL）]→過(guò)濾（120目）→煮沸→均質(zhì)（20 MPa）→滅菌（105℃，15 min）→冷卻→接種（1.0×107CFU/mL）→發(fā)酵（37℃發(fā)酵至pH 4.50）→冷藏（4℃，24 h）

1.3.4 豆乳發(fā)酵特性

1.3.4.1 基本理化指標(biāo)

豆乳pH值：使用pH計(jì)測(cè)定；豆乳酸度：參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》[14]；豆乳乳酸菌總數(shù)：參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[15]；

1.3.4.2 持水力測(cè)定

空白離心管質(zhì)量記為W0，稱(chēng)取質(zhì)量W1的發(fā)酵豆乳樣品于離心管，4000r/min，離心10min，靜置10min棄上清后質(zhì)量記為W2，采用如下公式計(jì)算樣品持水力[16]。

式中：W0為離心管質(zhì)量，g；W1為離心前樣品和離心管總質(zhì)量，g；W2為離心后樣品和離心管總質(zhì)量，g。

1.3.4.3 大豆異黃酮測(cè)定

1）樣品處理

取發(fā)酵豆乳5 mL于50 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液至接近刻度。超聲波萃取20 min，用80%甲醇定容，搖勻取樣品溶液置于離心管中，8 000 r/min離心15 min。取上清過(guò)0.45 μm濾膜，收集濾液進(jìn)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)測(cè)定[17]。

2）色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈；磷酸水溶液（pH 3.0）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

1.3.5 乳酸菌的鑒定

將乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，試劑盒提取乳酸菌的DNA。采用細(xì)菌鑒定的通用引物進(jìn)行16S rDNA基因片段擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到目的條帶后，擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序鑒定。將菌株測(cè)序結(jié)果登錄美國(guó)生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行序列比對(duì)，并用MEGA-X軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

1.4 數(shù)據(jù)分析

同一樣品平行測(cè)定3次，試驗(yàn)結(jié)果為3次測(cè)定結(jié)果的平均值，采用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用ANOVA進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株篩選結(jié)果

在β-葡萄糖苷酶作用下，七葉苷水解成葡萄糖和七葉素，七葉素可與Fe3+反應(yīng)呈現(xiàn)棕黑色[18]。將實(shí)驗(yàn)室保存的140株供試菌株接種于添加七葉苷和檸檬酸鐵的特殊固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后變?yōu)樽睾谏目?，即為產(chǎn)酶目標(biāo)菌株，根據(jù)顏色深淺初步判斷酶活高低，結(jié)果表明產(chǎn)酶目標(biāo)菌株一共有12株，菌株編號(hào)分別為11、39、54、58、117、128、m64、m91、m113、Y-5、A28 1-2、90-2-2。

2.2 高轉(zhuǎn)化菌株復(fù)篩結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵豆乳大豆異黃酮變化

分別將12株乳酸菌按1.0×107CFU/mL接種量接入豆乳，測(cè)定原豆乳和不同菌株發(fā)酵豆乳后大豆苷元、染料木素的含量。原豆乳、發(fā)酵豆乳高效液相色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 原豆乳高效液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of HPLC of soybean milk

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)大豆異黃酮苷元的能力以發(fā)酵后豆乳中大豆苷元和染料木素的總量來(lái)表示，不同菌株發(fā)酵豆乳大豆異黃酮苷元總量如圖3所示。

圖2 發(fā)酵豆乳高效液相色譜圖Fig.2 The chromatogram of HPLC of fermented soybean milk

圖3 不同菌株發(fā)酵豆乳大豆異黃酮苷元總量Fig.3 Content of isoflavone aglycone in soybean milk fermented by different bacteria

原豆乳中大豆異黃酮苷元總量為7.15 mg/L，豆乳經(jīng)產(chǎn)酶目標(biāo)菌株發(fā)酵后大豆異黃酮苷元總量均有顯著提高（P＜0.05）。翟清燕等[19]將不同菌株用于發(fā)酵豆乳，得到一株大豆異黃酮苷元產(chǎn)量最高的乳酸菌，約為原豆乳的8倍。本研究中，有7株乳酸菌發(fā)酵后大豆異黃酮苷元總量在55 mg/L以上，其中產(chǎn)大豆異黃酮苷元能力最強(qiáng)的是菌株58，顯著高于除菌株m91外的10株菌。菌株58發(fā)酵后大豆異黃酮苷元總量達(dá)59.64 mg/L，約為原豆乳的8.25倍，菌株m91次之，總量達(dá)58.06 mg/L，約為原豆乳的8.12倍。菌株128、m113發(fā)酵產(chǎn)大豆異黃酮苷元能力最弱，發(fā)酵后大豆異黃酮苷元總量不到45.00 mg/L。

2.2.2 發(fā)酵豆乳基本特性

2.2.2.1 發(fā)酵豆乳pH值變化

以pH值降至4.50為發(fā)酵終點(diǎn)，12株乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中pH值變化見(jiàn)圖4。

如圖4所示，菌株128、A28 1-2、m113和58發(fā)酵豆乳樣品pH值下降趨勢(shì)明顯，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)（pH 4.50）用時(shí)較短，均小于12 h，菌株11、54和39發(fā)酵豆乳樣品到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)用時(shí)次之。菌株m64、117和m91發(fā)酵豆乳樣品pH值下降速率緩慢，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)均在18 h以后。乳酸菌營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，自身蛋白水解能力較弱，因此單獨(dú)發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)是一種較普遍的現(xiàn)象[20-21]。

圖4 不同菌株發(fā)酵豆乳pH值變化Fig.4 pH change of soybean milk fermented by different strains

2.2.2.2 發(fā)酵豆乳酸度變化

以pH值降至4.50為發(fā)酵終點(diǎn)，12株乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中酸度變化見(jiàn)圖5。

圖5 不同菌株發(fā)酵豆乳酸度變化Fig.5 Acidity change of soybean milk fermented by different strains

可滴定酸度反應(yīng)了包括肽段和游離氨基酸殘基在內(nèi)的所有酸性基團(tuán)的總和[22]。如圖5所示，除菌株54發(fā)酵豆乳樣品外，另外11株乳酸菌的發(fā)酵豆乳樣品酸度均為30.00°T以上，所有乳酸菌發(fā)酵豆乳樣品的酸度在3 h后上升趨勢(shì)明顯。菌株58到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)的酸度最高，為35.01°T，菌株90-2-2、m91發(fā)酵豆乳樣品的酸度稍低于菌株 58，分別為 34.38 °T，34.01 °T。菌株54發(fā)酵豆乳樣品的酸度最低，為29.89°T。豆乳中糖類(lèi)主要是水蘇糖、棉子糖和蔗糖，缺少乳酸菌生長(zhǎng)所需的乳糖，乳酸菌不能大量生長(zhǎng)繁殖而產(chǎn)生足夠乳酸，因此發(fā)酵豆乳酸度偏低[23]。

2.2.2.3 發(fā)酵豆乳活菌數(shù)

以pH值降至4.50為發(fā)酵終點(diǎn)，12株乳酸菌發(fā)酵前后豆乳活菌數(shù)變化見(jiàn)圖6。

圖6 不同菌株發(fā)酵豆乳活菌數(shù)變化Fig.6 Viable count of soybean milk fermented by different strains

發(fā)酵豆乳中乳酸菌活菌數(shù)在出廠期須達(dá)106CFU/mL以上[24]，如圖6所示，發(fā)酵初12株乳酸菌發(fā)酵豆乳樣品活菌數(shù)無(wú)顯著性差異，而發(fā)酵末活菌數(shù)都顯著提高（P＜0.05）。其中，菌株A28 1-2發(fā)酵豆乳樣品活菌數(shù)變化值最大，發(fā)酵末活菌數(shù)最高，達(dá)8.84 lg（CFU/mL），菌株58發(fā)酵末活菌數(shù)為8.78 lg（CFU/mL），顯著高于菌株 m91，菌株m91為8.55 lg（CFU/mL）。菌株m64發(fā)酵豆乳樣品活菌數(shù)變化值最小，發(fā)酵末活菌數(shù)最低，僅8.39 lg（CFU/mL）。

2.2.2.4 發(fā)酵豆乳持水力

以pH值降至4.50為發(fā)酵終點(diǎn)，12株乳酸菌發(fā)酵豆乳持水力見(jiàn)圖7。

圖7 不同菌株發(fā)酵豆乳持水力Fig.7 Water holding capacity of soybean milk fermented by different strains

如圖7所示，除菌株11、54、m64，另外9株菌的發(fā)酵豆乳樣品持水力都達(dá)30.00%以上。其中，菌株58發(fā)酵豆乳樣品的持水力顯著高于除菌株A28 1-2的另外10株菌，持水力為35.10%，菌株A28 1-2次之，持水力為34.70%。菌株11發(fā)酵豆乳樣品持水力最低，僅為29.17%。發(fā)酵豆乳持水力是由蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠狀態(tài)形成的，蛋白質(zhì)是將流動(dòng)性較好的豆乳轉(zhuǎn)化為半固態(tài)發(fā)酵豆乳的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)[25]。持水力低可導(dǎo)致乳清析出，影響產(chǎn)品感官及風(fēng)味殘留。

2.3 優(yōu)選乳酸菌鑒定結(jié)果

根據(jù)菌株發(fā)酵豆乳后大豆異黃酮苷元含量高低，并結(jié)合其發(fā)酵特性分析，故選用菌株58為高轉(zhuǎn)化大豆異黃酮優(yōu)選乳酸菌。將純度符合要求的優(yōu)選乳酸菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度。檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，菌株在1 500 bp左右出現(xiàn)非常清晰的條帶，無(wú)特異性擴(kuò)增，且亮帶無(wú)彌散、拖尾現(xiàn)象。

圖8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.8 Gel electrophoresis for PCR

將菌株58的16S rDNA基因序列與GenBank種的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與乳桿菌屬成員具有較高的序列相似性，用Neighbor Joining方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖9所示。表明菌株58與植物乳桿菌種親緣關(guān)系密切，序列相似性達(dá)100%，因此，根據(jù)16S rDNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株58初步鑒定為植物乳桿菌。

圖9 菌株58和相關(guān)細(xì)菌16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.9 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain 58 and related strains

3 結(jié)論

本研究在140株人源乳酸菌中篩出12株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株，利用12株產(chǎn)酶目標(biāo)菌株發(fā)酵豆乳，比較不同菌株發(fā)酵豆乳產(chǎn)大豆異黃酮苷元的能力，得出2株高轉(zhuǎn)化大豆異黃酮菌株58和m91，發(fā)酵后大豆異黃酮苷元含量均是原豆乳的8倍以上，分別為59.64、58.06 mg/L。對(duì)乳酸菌在豆乳中發(fā)酵特性的分析發(fā)現(xiàn)，菌株58無(wú)論是從產(chǎn)酸速率，發(fā)酵末活菌數(shù)[8.78 lg（CFU/mL）]和持水力（35.10%）方面均顯著優(yōu)于其余菌株。經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定，優(yōu)選菌株58為植物乳桿菌。高轉(zhuǎn)化大豆異黃酮乳酸菌的篩選及其應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵豆乳中大豆異黃酮糖苷向高生物活性和利用度大豆異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化，對(duì)提高發(fā)酵豆乳功能營(yíng)養(yǎng)特性具有重要的指導(dǎo)意義，其發(fā)酵轉(zhuǎn)化大豆異黃酮最佳條件值得進(jìn)一步探究并完善。