張寧，趙志琴，范志華，2*，郝建祥，劉珊娜，2，孫溪，2

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）是所有天然物質(zhì)中毒性最強(qiáng)，且是目前世界范圍內(nèi)公認(rèn)的致癌性最強(qiáng)的真菌類毒素[1]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織的分析估計(jì)，每年在全世界的谷物中，至少有四分之一受到了AF污染。目前鑒定出的AF有10多種，受污染的食品中主要檢測(cè)的項(xiàng)目以黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最為常見(jiàn)，動(dòng)物體攝入AFB1后，經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）、黃曲霉毒素M2（aflatoxin M2，AFM2）這兩種代謝產(chǎn)物，會(huì)存在于乳液、蛋類、血液、肝臟、肌肉等可食用組織中[2]。其中以乳制品殘留情況最為突出。隨著世界各國(guó)對(duì)黃曲霉毒素檢測(cè)限量標(biāo)準(zhǔn)要求的不斷提高，迫切需要研發(fā)適合我國(guó)快速篩查、精確測(cè)定的檢測(cè)手段。目前市面上快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法存在靈敏度較低、變異較大、添加回收不穩(wěn)定、假陽(yáng)性等問(wèn)題，檢測(cè)的方法步驟還有待優(yōu)化。本試驗(yàn)通過(guò)飼料、豆粕、玉米面、調(diào)料制品、食用油、調(diào)制乳、豬肉、牛肉、火腿腸等為檢測(cè)樣品，研究改進(jìn)后的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)黃曲霉毒素的方法是否具有可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

康寧96孔酶標(biāo)板（8孔/條×12條）、蓋板膜、辣根過(guò)氧化物酶試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；AFB1高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)二抗、抗原（antigen，Ag）、抗體（antibody，Ab）：維德維康生物技術(shù)有限公司；底物A、B液、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、乙酸乙酯、四甲基聯(lián)苯胺、二甲基亞楓（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)有限公司。各類待檢樣本、脫脂奶粉：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

TTL-DC氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；Multiskan-FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾儀器有限公司；Thermo-Fisher落地式高速冷凍離心機(jī)：Thermo Electron公司；LPD2500多管漩渦混合儀：萊普特科學(xué)儀器有限公司；SH-2（A）SH微孔板脫水儀：北京雙和盛源科技發(fā)展中心；KF-806L有機(jī)相去除器：上海共濟(jì)科華實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃曲霉毒素抗原、抗體的制備

抗原的制備過(guò)程：小分子物質(zhì)AFB1本身無(wú)活性基團(tuán)，沒(méi)有免疫原性，需要通過(guò)引入羧基，采用活性酯法，與蛋白質(zhì)的氨基偶聯(lián)成完全抗原AFB1。

抗體制備過(guò)程：用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將冷凍干燥后的抗原（AFB1）以液料比 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）分別溶解，充分乳化注射免疫小鼠，10 d后從眼眶取血，樣本進(jìn)行靜置、凝固、離心等操作后取上層血清。選擇陰性血清吸光度OD值接近0，經(jīng)過(guò)檢測(cè)效價(jià)可以達(dá)到較高的水平?？贵w的效價(jià)越高則表明質(zhì)量越好[4]。

1.3.2 抗原的包被與封閉

采取方陣法，使用96孔康寧酶標(biāo)版，根據(jù)測(cè)定的OD值選擇出抗原的飽和濃度。根據(jù)OD值在1.0左右時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù)，作為最佳的稀釋倍數(shù)[5]。

在包被液中加入最佳抗原濃度包被酶標(biāo)板，稀釋5×103倍，磁力攪拌 1 h，靜置 30 min，濕度 30%，溫度25℃，在每個(gè)酶標(biāo)板孔中加入120 μL含有抗原的包被液，蓋上蓋板膜，4℃的環(huán)境下放置20 h，甩去包被液，洗滌兩次，30 s/次，放入脫水儀中甩干。采用與包被時(shí)相同的加液方式，每孔加入240 μL含有牛血清蛋白的封閉液，輕輕振蕩10 s，蓋上蓋板膜，放置在37℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中，溫育1.5 h，甩出封閉液，洗滌1次，振蕩10 s，靜置1 min，在脫水儀中甩干，37℃干燥4 h，真空密封酶標(biāo)板。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

用AFB1標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液稀釋濃度為10 μg/mL的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品基準(zhǔn)溶液[6]，配制濃度分別為0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液，在酶標(biāo)板中滴加反應(yīng)，以空白對(duì)照，測(cè)定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液為每孔50 μL，以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出抑制率（y）與濃度（x）的線性方程為y=-18.059lnx+16.355，相關(guān)系數(shù) R2=0.991 26，拐點(diǎn)數(shù)為2，最低檢測(cè)濃度為0.03 μg/L，線性系數(shù)范圍0.03 μg/L～2.43 μg/L，IC50為 0.084 μg/L。

1.3.4 抗體與酶標(biāo)二抗的準(zhǔn)備

將抗體用專用稀釋液稀釋2×105倍，振蕩5 min，25℃靜置1 h后放置4℃保存。在酶標(biāo)二抗的棕色玻璃瓶中依次加入1.2 mL超純水和0.8 mL丙三醇溶劑。將酶標(biāo)二抗專用酶稀釋液稀釋850倍，配制成酶標(biāo)二抗工作液，4℃放置保存。檢測(cè)時(shí)酶標(biāo)二抗和抗體的添加量均為 50 μL。

1.3.5 樣品前處理

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)飼料、豆粕、玉米面、調(diào)料制品、食用油、調(diào)制乳、豬肉、牛肉、火腿腸等樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同稀釋倍數(shù)，稱取一定量均質(zhì)后的樣品于離心管中，添加高標(biāo)作陰性、陽(yáng)性對(duì)照，加入樣本提取液，進(jìn)行渦動(dòng)和離心（2 500 r/min轉(zhuǎn)速下渦動(dòng)60 s、4 700 r/min離心5 min）后具體操作步驟如下[7-8]。

飼料、豆粕、玉米面：樣品稀釋30倍。準(zhǔn)確稱取1 g均質(zhì)后的樣本于50 mL離心管中，每個(gè)管加入5 mL樣本提取液，進(jìn)行渦動(dòng)和離心，取出分層的試樣，吸取上層清液100 μL，加入到新的2 mL離心管中，然后用移液槍將每個(gè)小管加入400 μL超純水，2 000 r/min渦動(dòng)40 s，取 50 μL 進(jìn)行點(diǎn)板檢測(cè)。

食用油類：樣品稀釋30倍。取0.1mL食用油樣品置入4 mL離心管里，每個(gè)管中加入1 mL正己烷和1 mL的樣品稀釋液，渦動(dòng)和離心后去除分層試劑，用有機(jī)相去除器吸掉分層后的上層正己烷以及中間的雜質(zhì)，取50 μL進(jìn)行項(xiàng)目檢測(cè)。

調(diào)料制品：樣品稀釋30倍。稱取1 g的樣品置入離心管中，加入5 mL乙腈后渦動(dòng)離心，分層后取出100 μL上層清液，加入到新的2 mL離心管中，加正己烷1 mL，再加入400 μL的超純水，之后進(jìn)行同樣的渦動(dòng)操作和離心。分層液用去除器吸掉分層后的上層和中間層雜質(zhì)，取50 μL進(jìn)行項(xiàng)目檢測(cè)。

調(diào)制乳：樣品稀釋2倍。每管取2 mL樣品，加入相應(yīng)的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品作添加回收，按照順序加入0.4 mL的ZnSO4溶液與6 mL乙酸乙酯與二氯甲烷的混合液，渦動(dòng)和離心后取上層液1.5 mL到新的4 mL離心管中（使用氮吹儀在60℃水浴中吹干離心管），之后加2 mL正己烷和1 mL樣品稀釋液，充分高速渦動(dòng)40 s，同樣離心5 min。除去中間層以上的物質(zhì)，移液槍吸取50 μL 點(diǎn)板檢測(cè)。

1.3.6 洗板與顯色終止

待標(biāo)準(zhǔn)品或樣本反應(yīng)30 min后將酶標(biāo)板中的反應(yīng)液甩掉，每孔添加量為260 μL洗滌液，靜置20 s洗滌3次。洗滌完成后甩干酶標(biāo)板，每孔添加量為100 μL底物A、B液和氧化劑的混合液，顯色10 min～15 min呈現(xiàn)出藍(lán)色后加入50 μL終止液迅速變黃色，立刻在雙波長(zhǎng)為450 nm和630 nm的酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原不同包被時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

在 4 ℃溫度下分別包被抗原 10、15、20、25、30 h，添加配制好的標(biāo)準(zhǔn)品、抗體工作液、酶標(biāo)二抗各50 μL，反應(yīng)時(shí)間為30 min，底物顯色15 min。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1所示。

表1 抗原不同包被時(shí)間檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection datas under different packet time

圖1 包被不同時(shí)間對(duì)抑制率及線性系數(shù)的影響Fig.1 Effect of coating time on inhibition rate and linear coefficient

由表1和圖1可以得出，抗原4℃下包被的最佳包被時(shí)間為20 h，此時(shí)，抑制率達(dá)到82.7%，線性系數(shù)為 0.996 1，IC50濃度達(dá)到 0.108 μg/L，OD 值達(dá)到2.189。

2.2 不同反應(yīng)溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

待酶標(biāo)板恢復(fù)至室溫（25℃）后添加樣本、抗體工作液、酶標(biāo)二抗各 50 μL，分別在 16、20、24、28、32 ℃下進(jìn)行反應(yīng)30 min，顯色15 min之后添加終止液，在酶標(biāo)儀上采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)分析，結(jié)果如表2和圖2所示。

表2 不同反應(yīng)溫度的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection datas under different reaction temperatures

圖2 不同反應(yīng)溫度對(duì)抑制率及線性系數(shù)的影響Fig.2 Effect of different reaction temperature on inhibition rate and linear coefficient

由表2、圖2看出，隨著溫度升高，曲線OD值先升高后下降，但I(xiàn)C50較為穩(wěn)定，抑制率會(huì)有10%以內(nèi)的浮動(dòng)，變異值均在5.0%以內(nèi)。最佳反應(yīng)溫度為24℃，此時(shí)抑制率為76.4%，OD值1.120，線性系數(shù)為0.992 7，IC50為 0.072 μg/L。

2.3 酶標(biāo)二抗作用時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

在酶標(biāo)板中添加樣本、抗體工作液、酶標(biāo)二抗各50 μL，設(shè)置不同酶標(biāo)抗體作用時(shí)間 15、20、25、30、35、40 min，之后加入底物顯色，室溫（25℃）下分別檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。

表3 酶標(biāo)二抗不同作用時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果Table 3 The results of enzyme mark II anti-action in different time

圖3 酶標(biāo)二抗不同作用時(shí)間對(duì)抑制率及線性系數(shù)的影響Fig.3 Effect of different time on inhibition rate and linear coefficient of enzyme-labeled double-antibody

如表3和圖3所示，隨著酶標(biāo)二抗作用時(shí)間變化，IC50有一定的浮動(dòng)，在酶標(biāo)二抗反應(yīng)30 min時(shí)，經(jīng)過(guò)顯色，在雙波長(zhǎng)下檢測(cè)分析得出的曲線OD值最好，抑制率基本穩(wěn)定，線性系數(shù)達(dá)最大值0.995 5。

2.4 不同顯色時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

在已包被抗原的酶標(biāo)板中添加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本、抗體工作液、酶標(biāo)二抗各50 μL，反應(yīng)30 min，加入底物和氧化劑 1 ∶1（體積比）混合液 100 μL，分別顯色 6、9、12、15、18、21 min，室溫（25 ℃）條件下采用雙波長(zhǎng)測(cè)定不同顯色時(shí)間的OD值，各指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表4和圖4。

從表4、圖4中可以看出，隨著顯色時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值在一定范圍內(nèi)呈線性趨勢(shì)升高，但是拐點(diǎn)和線性會(huì)有變化。IC50在0.08 μg/L左右時(shí)抑制率有所升高，綜合各因素考量得出最佳的顯色時(shí)間為15 min。

2.5 優(yōu)化條件后樣本檢測(cè)驗(yàn)證

通過(guò)各變量之間的取舍，酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)黃曲霉毒素的優(yōu)化流程為：將包被黃曲霉毒素抗原的酶標(biāo)板進(jìn)行點(diǎn)板，25℃下加入樣品及標(biāo)準(zhǔn)品、抗體液、酶標(biāo)二抗各50 μL，反應(yīng)30 min后加入260 μL洗滌液洗板3次，每次30 s，脫水儀甩干后立刻加入底物A、B混合溶液100 μL，顯色15 min后加入50 μL終止液。在雙波長(zhǎng)450 nm和630 nm酶標(biāo)儀檢測(cè)分析。采用該流程對(duì)豆粕、玉米面、調(diào)料制品、食用油、調(diào)制乳、豬肉、牛肉、火腿腸等11種樣本檢測(cè)驗(yàn)證，數(shù)據(jù)如表5所示。對(duì)檢測(cè)樣本的抑制率、回收率及OD值進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5所示。

表4 不同顯色時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Test results of different color developing time

圖4 不同顯色時(shí)間對(duì)抑制率及線性系數(shù)的影響Fig.4 Comparison of the parameters in different time of the second anti-action of enzyme mark

表5 各類樣本檢測(cè)結(jié)果Table 5 Test results of different types of samples

續(xù)表5 各類樣本檢測(cè)結(jié)果Continue table 5 Test results of different types of samples

圖5 檢測(cè)比較各類樣本抑制率、回收率及OD值的結(jié)果Fig.5 Comparison with various samples of inhibition rate，recovery rate and OD value

由表5、圖5可知，檢測(cè)各類樣本的抑制率在20.9%～67.3%之間，添加回收率在67%～116%之間。其中，調(diào)制乳的OD值和抑制率最高，但回收率偏低；飼料和牛肉的OD值不高，但是回收率超過(guò)100%；其它樣本的回收率在67.0%～90.4%。綜合來(lái)看，添加回收效果表現(xiàn)良好。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)黃曲霉毒素抗原和抗體的制備提純，利用方陣棋盤法確定抗原的最適包被稀釋倍數(shù)為5×103，抗體的稀釋倍數(shù)為2×105。而抗原包被時(shí)間、反應(yīng)溫度、酶標(biāo)二抗作用時(shí)間、底物顯色時(shí)間等是造成OD值變化的主要因素。采用ELISA的間接競(jìng)爭(zhēng)方法確定最佳抗原包被時(shí)間為20 h、反應(yīng)溫度為24℃左右、酶標(biāo)二抗作用時(shí)間為30 min、底物顯色時(shí)間為15 min。

通過(guò)對(duì)飼料等11種樣品的檢測(cè)，在方法經(jīng)過(guò)改進(jìn)優(yōu)化后計(jì)算得出：添加回收率在67%～116%之間，操作的變異系數(shù)在0.3%～6.4%之間，線性系數(shù)基本在0.99以上，IC50基本在0.1μg/L以下，板內(nèi)變異在5%以內(nèi)，板間變異在10%以內(nèi)，各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)符合要求，表明改進(jìn)后的ELISA檢測(cè)黃曲霉毒素的試驗(yàn)方法具有可行性。

本試驗(yàn)方法可在50 min～100 min完成檢測(cè)，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，結(jié)合其性能穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、操作便捷、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)?？梢宰鳛闄z測(cè)大批量樣本中黃曲霉毒素的一種可行性的方法。