徐鵬偉，劉家寧，常森林，王曉東，常坦然，于朝暉，趙慶生*，趙兵*

（1.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190；2.中國科學院大學，北京 100049；3.云南漢盟制藥股份有限公司，云南 昆明 650000）

大麻（Cannabis sativa L.）廣泛種植于亞洲、歐洲及南美等地，由于大麻中的四氫大麻酚具有致幻成癮的特性，因此許多國家將其列為毒品而被禁止種植，但是不同大麻品種中的四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）含量差別很大，THC含量低于0.3%的品種被列為工業(yè)大麻[1]。工業(yè)大麻，又稱火麻，在我國大量種植?；鹇榈姆N子仁富含不飽和脂肪酸、微量元素和蛋白質，是一種營養(yǎng)價值極高的農作物[2-5]。

火麻仁蛋白（hemp seed protein isolate，HPI）因易于消化而聞名，體外模擬人體胃腸道消化表明，火麻仁蛋白易于被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化，其消化率高達88%～91%[6-8]。火麻仁蛋白由兩種蛋白（火麻仁球蛋白和麻仁白蛋白）組成[9]，包含所有人體所需氨基酸，且精氨酸含量豐富[10]，研究證明，火麻仁蛋白粉可以改善運動員的耐力和增強力量[11]?；鹇槿实鞍撞粌H營養(yǎng)價值很高，且沒有致敏因子[7]?；鹇槿实鞍鬃鳛橹参锏鞍椎膩碓矗哂泻芨叩拈_發(fā)潛力[12]。

常見的植物蛋白通常是通過堿提/酸沉法制備[13-15]。文獻報道，氯化鈉溶液可用于提取分離植物球蛋白[16-17]，對于火麻仁蛋白而言，球蛋白含量高于70%[18]，是主要的儲藏蛋白，與人體免疫功能有關，因此利用氯化鈉溶液提取分離火麻仁蛋白也是開發(fā)利用火麻仁蛋白的一個重要途徑。Hadnadev等[16]報道，通過氯化鈉溶液溶解火麻仁蛋白，然后通過透析袋脫鹽，將蛋白質沉淀下來，試驗的局限性在于提取量小且試驗操作復雜，因此，仍需要在此基礎上，深入研究氯化鈉溶液的提取溫度對火麻仁蛋白溶解性的影響。

本研究旨在確定兩種分離方法對于制備得到的火麻仁蛋白理化性質、功能特性以及微觀結構的影響，從多方面評價分離方法，為火麻仁蛋白產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁：云南漢盟制藥股份有限公司。

氫氧化鈉、鹽酸、亞硫酸鈉：北京化工廠；石油醚、三（羥甲基）氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、甘氨酸（glycine，Gly）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、尿素（urea）：國藥集團化學試劑有限公司；5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、異硫氰酸苯酯、二硫蘇糖醇（dithio threitol，DTT）：阿拉丁試劑公司；氯化鈉、結晶乙酸鈉：天津市福晨化學試劑廠；蛋白質凝膠電脈（sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KDN-520凱氏定氮儀：徐州華納精密儀器有限公司；WF2UV-2802H分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；F-4600熒光分光光度計：日立高新技術公司；LC-20AT液相色譜：島津公司。

1.3 溶液配制

緩沖溶液A：0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.004 mol/L EDTA（Tris-Gly，pH 8.0）、8 mol/L 尿素。

緩沖溶液B：0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.004 mol/L EDTA、8 mol/L尿素和0.1 mol/L Na2SO3（pH 9.5）。

2-硝基-5-硫代磺基苯甲酸酯（2-nitro-5-thiosulfobenzoate，NTSB）儲備溶液：將 0.1 g DTNB 溶解于10 mL 1 mol/L Na2SO3中，pH值調至7.5。將氧氣連續(xù)引入離心管中，水浴條件下維持溫度37℃，直到溶液顏色從紅色變?yōu)闇\黃色為止，證明了NTSB的生成。

NTSB 測試溶液：用緩沖溶液 B 25℃（100∶1，體積比）稀釋NTSB儲備溶液，制備NTSB測試溶液。

1.4 試驗方法

1.4.1 脫脂火麻仁粉（defatted hemp seed meal，HPM）的制備

通過機械壓榨（脫殼）火麻仁以脫除油脂，然后將脫除油脂的火麻仁粉和正己烷[（1∶20（g/mL）]混合，25℃下充分攪拌脫除剩余油脂，得到脫脂火麻仁粉（HPM）。

1.4.2 堿提/酸沉法制備火麻仁堿提蛋白（hemp seed protein isolate-alkaline extraction，HPI-AE）

將HPM分散在去離子水[料液比1∶20（g/mL）]中，pH值調至9.5，50℃下充分攪拌，離心收集上清液。將上清液pH值調至5.0，使蛋白質充分沉淀，離心獲得沉淀物。將沉淀物分散在去離子水中，將pH值調至7.0，然后冷凍干燥獲得HPI-AE。

1.4.3 鹽溶/鹽析法制備火麻仁鹽提蛋白 （hemp seed protein isolate-salt extraction，HPI-SE）

將HPM分散在5%NaCl溶液 [料液比1∶15（g/mL）]中，50℃條件下充分攪拌2 h。趁熱離心獲得上清液。將上清液在4℃下保存24 h，然后離心獲得沉淀物。將沉淀物分散在去離子水中，洗滌后經(jīng)離心以便脫除氯化鈉。然后將沉淀物冷凍干燥獲得HPI-SE。

1.4.4 理化性質

1.4.4.1 蛋白含量的測定及蛋白回收率計算

采用凱氏定氮法確定樣品蛋白含量。將蛋白樣品與濃硫酸和催化劑硫酸鉀一同置于消化爐加熱消化，使蛋白質分解，分解后的氨和硫酸結合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離出來，用硼酸吸收后再以鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)鹽酸的消耗量乘以換算系數(shù)，換算成蛋白質含量。

蛋白含量計算公式如下。

式中：X為蛋白含量，%；ΔV為試樣消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；C為鹽酸濃度，mol/L；0.014為1.0 mL鹽酸（1.0 mol/L）標準滴定液相當于氮元素的質量，g；M為試樣質量，g；F為換算系數(shù)，本研究選擇系數(shù)F=5.9。

回收率計算公式如下。

式中：R為蛋白回收率，%；MHPI為提取分離獲得的 HPI的質量，g；XHPI為 HPI中蛋白含量，%；MHPM為用于提取分離蛋白的HPM的質量，g；XHPM為HPM中蛋白含量，%。

1.4.4.2 外觀色澤

HPI的顏色測量通過將蛋白質溶解于1 mol/L氫氧化鈉溶液中，配制成20 mg/mL的蛋白質溶液，在420、520、620 nm條件下測吸光值。經(jīng)過公式計算確定了參數(shù) L*（亮度），a*（紅-綠色）和 b*（黃-藍色）的值。計算公式如下。

式中：A 為吸光值；τ 為透光率；X0為 97.285；Y0為100；Z0為 116.145。

1.4.4.3 巰基（SH）和二硫鍵（S-S）含量

巰基可分為總巰基（SHT）、游離巰基（SHF）。

SHT的測定方法：將火麻仁蛋白溶解于緩沖溶液A中（5 mg/mL），充分混合后離心10 min，收集上清液，梯度稀釋獲得不同濃度的火麻仁蛋白溶液；將80 μL Ellman試劑（4 mg/mL DNTB）添加到火麻仁蛋白溶液（2 mL）中，充分混合5 min后，在412 nm處測量吸光度。

SHF的測定方法：將火麻仁蛋白溶解到緩沖溶液B（5 mg/mL）中，充分混合10 min后離心，收集上清液。用NTSB測試溶液線性稀釋火麻仁蛋白溶液以獲得不同濃度的蛋白質溶液，412 nm處測量吸光度。

巰基含量計算公式如下。

二硫鍵含量計算公式如下。

式中：CSH為 SH 含量，μmol/g；CS-S為 S-S含量，μmol/g；A412為412 nm處的吸光度；C為樣品濃度，mg/mL；D為稀釋系數(shù)；73.53為106（/1.36×104），其中1.36×104為摩爾吸收率，106為轉化因子。

1.4.4.4 SDS-PAGE

非還原狀態(tài)下的蛋白質電泳分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。方法如下，將樣品（2 mg/mL）分散于不含二硫蘇糖醇非還原性緩沖液中，95℃條件下加熱15 min后冷卻，電泳時蛋白上樣10 μL。

還原狀態(tài)下的蛋白質電泳分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。方法如下，將樣品（2 mg/mL）分散于含DTT的還原性緩沖液中，95℃條件下加熱15 min后冷卻，電泳時蛋白上樣10 μL。

凝膠采用考馬斯亮藍染色，最后用脫色液脫色至背景無色。

1.4.4.5 氨基酸組成

氨基酸通過柱前衍生-高效液相色譜法測定[19]。適量樣品置于密封管中，用16 mL 6 mol/L鹽酸預處理，110℃條件下消化24 h，蛋白質完全水解，獲得氨基酸溶液。使用異硫氰酸苯酯對氨基酸衍生化，液相檢測。

酸性條件下水解蛋白質會導致色氨酸被破壞，因此蛋白質需要在堿性條件下水解[20]。110℃下堿性環(huán)境水解24 h，獲得色氨酸溶液，無需柱前衍生，直接液相檢測。氨基酸含量計算公式如下。

式中：C為氨基酸含量，%；M為單一氨基酸質量，mg；M總為所有氨基酸質量之和，mg。

1.4.5 火麻仁蛋白功能性

1.4.5.1 溶解性

依據(jù)文獻[21]報道，不同pH值條件下，火麻仁蛋白的溶解性（protein solubility，PS）測定方法如下：將蛋白樣品（0.1 g）溶解在10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，測定的蛋白含量作為樣品蛋白的總含量 （對照）；將10 mg/mL火麻仁蛋白樣品pH值分別調節(jié)為3.0～11.0，充分攪拌1 h，8 000 g條件下離心30 min得上清液。使用Bradford方法分析上清液中的蛋白含量。蛋白質溶解度計算公式如下。

式中：PS為蛋白質溶解度，%；M上清為上清液中蛋白的質量，g；M總為總的蛋白質質量，g。

1.4.5.2 起泡性/泡沫穩(wěn)定性

火麻仁蛋白在不同pH值條件下的起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S）測定方法如下，將10 mg/mL蛋白樣品pH值分別調為3.0～11.0。高速乳化機快速剪切攪拌10 min，使蛋白溶液充分起泡，記錄溶液體積和初始泡沫體積。FC計

算公式如下。

式中：FC為蛋白質起泡性，%；V初為泡沫的初始體積，mL；V液為溶液體積，mL。

泡沫靜置30 min，記錄穩(wěn)定泡沫體積。泡沫穩(wěn)定性計算公式如下。

式中：FS為泡沫穩(wěn)定性，%；V穩(wěn)為穩(wěn)定泡沫體積，mL；V初為初始泡沫體積，mL。

1.4.6 熒光光譜

蛋白質分子中含有的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）3種芳香族氨基酸殘基，在紫外光的照射下會發(fā)射熒光。在固定激發(fā)波長的照射下，熒光光譜利用蛋白質中芳香族氨基酸的熒光波長隨外界環(huán)境變化而改變的特點，用于研究蛋白質的構象變化。在0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）中制備蛋白質儲備溶液（10 mg/mL），然后將pH值調節(jié)至3.0、5.0、7.0、9.0和11.0。用緩沖液將儲備溶液稀釋至0.01%，在熒光分光光度計上記錄熒光光譜。激發(fā)波長：275 nm；發(fā)射波長：290nm～450nm。

2 結果和分析

2.1 理化性質

2.1.1 理化參數(shù)

HPI的理化參數(shù)如表1所示。

從表1中可以看出蛋白質是HPM的主要成分；HPI-SE的蛋白含量（94.8%）高于HPI-AE的蛋白含量（85.9%）。氯化鈉溶液常用于提取植物球蛋白，并且火麻仁蛋白中球蛋白含量較高[16]，通過氯化鈉提取火麻仁蛋白具有廣闊前景；鹽溶/鹽析過程中，溶液溫度的改變對于火麻仁球蛋白的溶解性影響較大，其它物質的溶解性沒有明顯變化，因而鹽溶/鹽析法更利于提取火麻仁球蛋白，因此HPI-SE的蛋白含量更高。HPIAE的蛋白回收率為83.43%，高于HPI-SE蛋白回收率59.06%。對于堿提/酸沉法而言，堿提蛋白時，蛋白質分子攜帶大量的同種電荷阻礙了蛋白質分子的聚集沉淀，從而提高了蛋白質的溶解性；等電點沉淀蛋白質時，蛋白質分子之間靜電斥力消失，蛋白質分子聚集沉淀。等電點沉淀過程中，大部分蛋白沉淀下來的同時，也有部分其它物質沉淀下來，從而導致HPIAE中蛋白回收率較高，蛋白含量較HPI-SE低。

表1 理化參數(shù)Table 1 Physicochemical properties

由表1可知，HPI-SE具有高的L*值、較低的a*值和b*值；說明了HPI-SE的外觀色澤比HPI-AE的外觀色澤更亮白。堿提/酸沉法提取火麻仁過程中，羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（蛋白質）間的美拉德反應生成棕色的大分子類物質，等電點沉淀過程中，這些物質也沉淀下來，從而導致HPI-AE外觀呈現(xiàn)淺黃色。

游離巰基、總巰基和二硫鍵含量測試結果顯示，HPI-SE中游離巰基、總巰基和二硫鍵的含量分別為26.49、59.10、16.33 μmol/g；含量均略高于 HPI-AE，后者游離巰基、總巰基和二硫鍵的含量分別為22.44、50.77、14.17 μmol/g。巰基和二硫鍵是蛋白質構象中的重要官能團，二硫鍵可以保持折疊構象的穩(wěn)定性并降低構象熵，從而提高熱穩(wěn)定性[22]；分子間二硫鍵的形成，會導致蛋白質分子更易聚集沉淀?；鹇槿实鞍字杏坞x巰基的含量高于木瓜種子蛋白中游離巰基的含量9.73 μmol/g[23]，也高于三葉木通蛋白中游離巰基的含量10.82 μmol/g[24]，因此巰基含量高可能是導致火麻仁蛋白溶解性差的原因之一。

2.1.2 蛋白質電泳

HPM和HPI在非還原狀態(tài)和還原狀態(tài)條件下的蛋白質電泳見圖1。

圖1 HPI-AE、HPI-SE和HPM在非還原狀態(tài)和還原狀態(tài)條件下的蛋白質電泳Fig.1 SDS-PAGE of HPI-AE，HPI-SE and HPM under non-reducing and reducing conditions

如圖1所示，非還原狀態(tài)下HPM和HPI的主要肽鏈分子量均為55 kDa；還原狀態(tài)下HPM和HPI主要肽鏈分子量均為34、19、18 kDa。結果發(fā)現(xiàn)HPM和HPI具有相同的蛋白組成，成分均是火麻仁球蛋白。本研究中，火麻仁球蛋白由6個分子量為55 kDa的亞基組成，每個亞基由一個酸性基團和一個堿性基團通過二硫鍵連接組成；還原狀態(tài)下，亞基的二硫鍵被打開，形成一個分子量為34 kDa的酸性基團和分子量為19 kDa或18 kDa堿性基團。其中酸性基團由單一肽鏈構成，分子量為34 kDa；堿性基團有兩種肽鏈形式，分子量分別為 19、18 kDa。

在非還原狀態(tài)下，有少量分子量為35、19、18 kDa的肽鏈，表明在非還原狀態(tài)下，依然有少量亞基的二硫鍵被打開。非還原狀態(tài)下，HPI中出現(xiàn)了少量分子量大于100 kDa的條帶，但未在HPM中出現(xiàn)。表明了在提取分離蛋白過程，由于溫度等一些外在因素導致了部分蛋白質變性，從而交聯(lián)形成了聚合物。

2.1.3 氨基酸組成

HPM和HPI的氨基酸組成見表2。

由表2所示，HPI和HPM的氨基酸組成相近，意味著兩種分離過程只是富集了火麻仁蛋白質，未引起蛋白質組成太大變化。和其它植物蛋白相比[10]，火麻仁蛋白中含有豐富的精氨酸，尤其HPI-SE精氨酸含量高達15.09%；已有研究表明，飲食中精氨酸/賴氨酸的比值越高，降低膽固醇的作用越明顯，有利于心血管健康[25]，HPI-SE的精氨酸/賴氨酸的值高達5.72，與HPIAE相比，HPI-SE可能對改善心血管健康有更好的積極作用。支鏈氨基酸能夠直接為肌肉提供能量，在運動過程中被直接消耗供能，減少肌肉的過度分解，起到保護肌肉的作用[9]，火麻仁蛋白的必需氨基酸（EAA）含量均高于30%，支鏈氨基酸含量均高于16%，以上結果表明，火麻仁蛋白是一種優(yōu)質的植物蛋白。

表2 HPM和HPI的氨基酸組成Table 2 The amino acid composition of HPM and HPI

2.2 火麻仁蛋白功能性

2.2.1 蛋白質溶解

不同pH值條件下HPI的溶解性見圖2。

圖2 不同pH值條件下火麻仁蛋白的溶解性Fig.2 Protein solubility of HPI at different pH

蛋白溶解性是蛋白其它功能特性的基礎，影響蛋白在食品領域的應用，因此探究火麻仁蛋白的溶解曲線是進一步研究蛋白其它功能特性的基礎。由圖2可知，在pH3.0～11.0的范圍內，HPI的溶解性呈現(xiàn)出相同的趨勢，均呈U型。但是HPI具有相異的等電點；HPI-AE在pH 6.0時溶解度最小，為1.34%；而HPISE在pH 7.0時溶解度最小，為0.65%。當pH值接近等電點時，靜電斥力的喪失有助于蛋白質聚集體的形成，從而導致火麻仁蛋白的溶解性降低[26]；當pH值遠離等電點時，火麻仁蛋白攜帶相同電荷，由于靜電斥力的作用，導致蛋白質聚集程度下降，從而蛋白質的溶解性提高。與HPI-AE相比，HPI-SE在pH＜5的條件下溶解度更高，相反地，當pH＞9.0時，HPI-AE的溶解度略高于HPI-SE。

2.2.2 起泡性/泡沫穩(wěn)定性

不同pH值條件下HPI的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性見圖3。

圖3 HPI在不同pH值條件下的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性Fig.3 Foaming capacity and foaming stability of HPI at different pH

蛋白的起泡性在蛋白質某些產(chǎn)品開發(fā)過程中極為關鍵，例如蛋糕制作過程中，蛋白的起泡性能直接決定產(chǎn)品的成敗，因而有必要研究火麻仁蛋白的起泡性。比較圖3和圖2得知在不同的pH值條件下，蛋白質的起泡性/泡沫穩(wěn)定性和蛋白質溶解性呈正相關。其中HPI-AE和HPI-SE均在溶液pH 1.0時起泡能力最強，分別為113.33%和103.35%；在等電點附近，HPI的起泡能力和穩(wěn)定均最差。當pH值遠離等電點時，蛋白質的起泡性/泡沫穩(wěn)定性迅速增加，說明蛋白良好的溶解性是獲得較好起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的前提。蛋白質的起泡過程意味著蛋白質被吸附在空氣-水界面上，并通過分子間相互作用重新排列形成彈性薄膜[27]；火麻仁蛋白是生物大分子，具有天然的疏水性；溶解性改善后的火麻仁蛋白親水性增強；此時蛋白質分子更易吸附在空氣-水界面上，這有助于泡沫的形成，并使泡沫穩(wěn)定性增強。

2.3 熒光光譜

不同pH值條件下HPI的熒光光譜見圖4。

溶液的pH值決定著HPI的溶解性和起泡性，但是在不同pH值條件下，蛋白質的微觀結構是否因此而改變值得探討。在不同pH值條件下，熒光光譜通過探究芳香族氨基酸殘基的微觀環(huán)境是否改變，可以部分解釋溶液pH值對于火麻仁蛋白結構的影響。由圖4可知，試驗過程未觀察到300 nm～310 nm處的酪氨酸的發(fā)射光譜，這可能是由于強烈的蛋白質-蛋白質相互作用導致酪氨酸-色氨酸能量轉移增加，進而導致酪氨酸的發(fā)射光譜被色氨酸的發(fā)射光譜覆蓋[17，28]。HPI的最大發(fā)射波長（λmax）均小于335 nm，這表明在不同pH值條件下，色氨酸殘基均位于疏水性較強的內部，蛋白質保持一個較為致密的結構?；鹇槿实鞍椎淖畲蟀l(fā)射波長（λmax）隨著溶液酸性/堿性增強而略有紅移，意味著部分色氨酸殘基從疏水性強的內部向親水性強的表面轉移，蛋白質結構逐漸變得松散，原因是當pH值逐漸遠離等電點時，靜電斥力的加強導致蛋白質的聚集程度降低，部分色氨酸暴露在蛋白質分子表面。

圖4 不同pH值條件下HPI-AE和HPI-SE的熒光光譜Fig.4 Fluorescence emission spectrum of HPI-AE and HPI-SE at different pH values

在pH值逐漸接近等電點的過程中，熒光強度加強預示著色氨酸-色氨酸相互作用加強，表明了蛋白質聚集程度加強；當pH值接近等電點時，蛋白質的聚集程度達到最大，火麻仁蛋白的溶解度最低，進而導致熒光強度降低。在相同pH值條件下，HPI-SE的熒光強度高于HPI-AE的熒光強度，說明HPI-SE的色氨酸-色氨酸相互作用較HPI-AE更強，預示著它的蛋白質聚集程度較大。

3 結論

兩種分離方法對火麻仁蛋白的氨基酸組成影響較小，二者氨基酸組成相似且均含有豐富的精氨酸；SDS-PAGE表明二者蛋白質組成均主要為火麻仁球蛋白。堿提/酸沉法得到的HPI-AE蛋白回收率高，但蛋白含量低，外觀呈淡黃色；相反，鹽溶/鹽析法得到的HPI-SE蛋白回收率低，但蛋白含量高，外觀呈亮白色。因而HPI-SE更適合摻入到高蛋白含量的食物中。研究證明蛋白質分離過程會影響火麻仁蛋白的功能性，二者雖具有相似的溶解性曲線，但是在相同pH值條件下，二者的溶解性存在較大的差異。試驗發(fā)現(xiàn)蛋白質的起泡性/泡沫穩(wěn)定性和蛋白質溶解性呈正相關，證實了良好的溶解性是蛋白質增強起泡性的前提。