蔣彤，呂新林，凌華山，陳斌，田潘婷，朱晶晶*，王智民*，劉志高，劉繼延

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，中藥質(zhì)量控制技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；3.江西齊云山食品有限公司，江西 贛州 341000）

南酸棗 [Choerospondias axillaris（Roxb.）Burtt et Hill]，屬無患子目漆樹科南酸棗屬植物。主要分布在我國的暖溫帶省區(qū)，日本、印度等國家也有分布。南酸棗具有悠久的藥用和食用傳統(tǒng)，屬藥食兩用植物[1]。南酸棗以干燥成熟果實(shí)入藥，是藏藥和蒙藥醫(yī)治心病的常用藥材之一[1]。2015年版《中國藥典》記載南酸棗能行氣活血，養(yǎng)心安神，常用于氣滯血瘀，胸痹作痛，心悸氣短，心神不安[2]。近年來中藥產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，推動了南酸棗在食品領(lǐng)域的廣泛開發(fā)利用，南酸棗果肉被開發(fā)為南酸棗糕，對食欲不振、厭食和食滯腹痛有良好的輔助作用，日益受到消費(fèi)者的青睞[3]。但在南酸棗糕產(chǎn)品加工過程中，產(chǎn)生了占加工總量30%的南酸棗皮副產(chǎn)物，造成巨大資源浪費(fèi)的同時也帶來了環(huán)境污染問題。研究表明，南酸棗皮富含豐富的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，如原花青素、黃酮、酚酸、多種維生素、有機(jī)酸、多糖、膳食纖維和礦物元素[1]。南酸棗皮原花青素具有抗氧化、抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、降血糖等生物活性[1，4-5]。南酸棗總黃酮可以防治心腦血管疾病，保護(hù)大鼠心肌缺血，對實(shí)驗(yàn)大鼠心率失常有拮抗作用[1，6]。將南酸棗皮添加到壓縮食品中，在增加壓縮食品營養(yǎng)成分的同時，還能促進(jìn)淀粉的消化[7]。

隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平提高，果酒已深受消費(fèi)者青睞。以南酸棗皮為原料經(jīng)發(fā)酵加工而成的純天然南酸棗皮果酒，不但風(fēng)味獨(dú)特，酯香醇厚，還具有一定的保健功能。本研究在明確南酸棗皮果酒化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究，以期充分利用南酸棗皮副產(chǎn)物開發(fā)高值化附加產(chǎn)品，為南酸棗果皮綜合利用和南酸棗皮果酒等相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮南酸棗由江西齊云山食品有限公司提供；釀酒酵母WLP775：美國White Labs公司；白砂糖：市售；蒸餾水：廣州屈臣氏公司；乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；甲酸（質(zhì)譜級）：美國Sigma-Aldrich公司；十二水合磷酸氫二鈉、無水碳酸鈉、鹽酸、香草醛、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二水合磷酸二氫鈉、甲醇（分析純）：北京化工廠；檸檬酸（批號171130-03）：成都普思生物科技有限公司；原花青素B2（批號CHB170225）、兒茶素（批號CHB170313）、維生素 C（批號 CHB171011）、綠原酸（批號CHB160418）：成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均＞98%；槲皮苷（純度≥98%，批號 111538-200403）、沒食子酸（C7H6O5含量為90.1%，批號110831-200803）：中國食品藥品檢定研究院；DPPH：北京Coolaber科技有限公司；果膠酶（酶活500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（液體，酶活≥70萬U/mL）、對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖、蘆丁（批號Y06J8S37439，純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；SO2氣體：天津環(huán)達(dá)亞氣體公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYUPLC超高效液相色譜儀、XevoG2-SQTof質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱：美國 Waters公司；XSE 105DU 分析天平：梅特勒-托利多；THZ-98A恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Multiscan FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 南酸棗皮果酒的釀造

1.3.1.1 釀造工藝流程

南酸棗皮果酒制備工藝流程：南酸棗清洗→南酸棗漂燙滅菌→瀝干→剝皮→破碎→滅菌→果膠酶和50 mg/LSO2處理→接種加料→主發(fā)酵→過濾去渣→后發(fā)酵→過濾→陳釀→過濾→滅菌裝罐[8-9]。

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

南酸棗以成熟無腐爛變質(zhì)的果實(shí)為佳，洗凈后在95℃左右的熱水中漂燙2 min～3 min，既利于皮肉分離和破碎加工，又可以抑制果實(shí)中的多酚氧化酶活性，抑制氧化；將南酸棗皮破碎，過濾得到果汁；果汁進(jìn)行高溫瞬時滅菌，120℃條件下加熱15 s后迅速冷卻，以免果汁的營養(yǎng)成分被高溫破壞，添加0.5%果膠酶，40℃酶解2 h，提高出汁率，裝罐前用SO2熏罐，并加入50 mg/L的SO2；酵母使用前要進(jìn)行復(fù)水活化，將干酵母加入38℃含糖量5%的糖水，攪拌溶解，15 min～30 min后冷卻至28℃～30℃與處理好的南酸棗皮汁混合均勻，酵母接種質(zhì)量為原汁質(zhì)量的0.03%～0.05%，發(fā)酵罐在25℃～28℃條件下密閉發(fā)酵4 d～5 d，用經(jīng)巴氏滅菌的紗布過濾得汁液；將果酒液裝入不銹鋼罐中，用蓋密封，放置在17℃～19℃下，后發(fā)酵1個月；后發(fā)酵的酒液用多層滅菌紗布再次過濾于不銹鋼罐中，最后在低溫12℃～15℃，濕度70%，沒有強(qiáng)光照射的清潔環(huán)境下陳釀2個月；采用有機(jī)陶瓷膜設(shè)備過濾，滅菌、裝罐。

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) （liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）檢測

1.3.2.1 對照品溶液制備

分別精密稱取沒食子酸、原花青素B2、兒茶素、檸檬酸、綠原酸、槲皮苷對照品5 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

取南酸棗皮果酒樣品，12 000 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.3.2.3 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序：0～8.34 min，2%～12%A；8.34 min～13.55 min，12% ～19%A；13.55 min～20.84 min，19% ～70%A；20.84 min～25.01 min，70%～100%A；25.01 min～26 min，100%A；柱溫 35 ℃，體積流量 0.4 mL/min，進(jìn)樣量 2 μL，檢測波長 200 nm～700 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正負(fù)離子模式掃描，離子源溫度120℃，霧化氣為N2，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～2000，累積時間0.2s，錐孔電壓40V，毛細(xì)管電壓2kV，碎片離子碰撞能量20 eV～50 eV，母離子碰撞能量6 eV，脫溶劑氣流速600 L/h，錐孔氣體流量50 L/h，脫溶劑氣溫度400℃，數(shù)據(jù)的采集和處理軟件為Mass Lynx 4.1質(zhì)譜工作站。

1.3.3 南酸棗皮果酒中總黃酮、總原花青素和總酚的含量測定

1.3.3.1 南酸棗皮果酒中總黃酮的含量測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[10]進(jìn)行南酸棗皮果酒中總黃酮的含量測定。取100 μL南酸棗皮果酒置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置 6 min，加 NaOH 溶液 10 mL，再加70%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min。以未加標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白，在500 nm的波長處測定吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=11.023x-0.029 9，R2=0.999，總黃酮含量以每毫升南酸棗皮果酒所含蘆丁質(zhì)量表示。

1.3.3.2 南酸棗皮果酒中總原花青素的含量測定

采用香草醛-鹽酸法[11]測定南酸棗皮果酒中總原花青素的含量。分別吸取50 μL南酸棗皮果酒至10 mL試管中，用甲醇稀釋至1 mL，再向其中加入6 mL濃度為0.04 g/mL的香草醛甲醇溶液和3 mL濃鹽酸，定容，混勻，在25℃下避光反應(yīng)30 min后，用甲醇代替標(biāo)準(zhǔn)品作空白對照，于500 nm處測定吸光度。以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.085 4x+0.052 1，R2=0.999，總原花青素含量以每毫升南酸棗皮果酒所含兒茶素質(zhì)量表示。

1.3.3.3 南酸棗皮果酒中總酚的含量測定

采用福林酚法[12]測定南酸棗皮果酒中總酚含量。精密量取50 μL南酸棗皮果酒置于25 mL棕色量瓶中，加入福林酚試液1 mL，再加水11.95 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在760 nm的波長處測定吸光度，以沒食子酸為對照品得到回歸方程為y=107.55x+0.063 7，R2=0.999 9?？偡淤|(zhì)量濃度以每毫升南酸棗皮果酒所含沒食子酸質(zhì)量表示。

1.4 南酸棗皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性

α-葡萄糖苷酶可使淀粉水解為葡萄糖，其抑制劑與小腸中的α-葡萄糖苷酶競爭性結(jié)合，使淀粉水解的速度減緩，降低血糖[13]。α-葡萄糖苷酶可使對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）產(chǎn)生對硝基苯酚，于堿性溶液中呈鮮黃色。將南酸棗皮果酒凍干得到南酸棗皮果酒粉末，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）配成不同濃度的溶液。用紫外分光光度計測定生成的對硝基苯酚的含量可以計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率[14]。于96孔板中加入50 μL不同濃度的樣品溶液或/和50 μL 280 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，在37℃恒溫振蕩器中孵育10 min后，加入50 μL 4 mmol/L的pNPG溶液開始反應(yīng)，于405 nm波長下測定吸光度值記為A樣品；用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液，于405 nm波長下測定吸光度值記為A陰性對照，陰性對照顯示鮮黃色，提示反應(yīng)終點(diǎn)。加入50 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。本試驗(yàn)以阿卡波糖為陽性藥，平行3個復(fù)孔，按公式（1）計算抑制率。

1.5 南酸棗皮果酒DPPH自由基清除能力

參考文獻(xiàn)[15-17]中DPPH法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。將南酸棗皮果酒凍干得到南酸棗皮果酒粉末，用乙醇配制成不同濃度的樣品溶液。用無水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液。在比色管中加入2 mL DPPH溶液和1 mL樣品溶液，避光反應(yīng)30 min，在515 nm波長下測定吸光度，記為Ai；2 mL DPPH和1 mL無水乙醇的吸光度值記為Ac；2 mL無水乙醇和1 mL樣品溶液的吸光度值記為Aj；3 mL無水乙醇作為空白對照；維生素C作為陽性對照，試驗(yàn)重復(fù)3次。按公式（2）計算DPPH自由基清除率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜分析采用Mass Lynx 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析；抗氧化和降血糖活性的測定采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理軟件計算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 南酸棗皮果酒的化學(xué)成分研究

2.1.1 南酸棗皮果酒的色譜峰指認(rèn)

通過與對照品的LC-MS/MS數(shù)據(jù)比對，并結(jié)合文獻(xiàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，總結(jié)質(zhì)譜指認(rèn)結(jié)果，從南酸棗皮果酒中共指認(rèn)了34個化合物，其中黃酮類化合物18個，有機(jī)酸類化合物11個，酯類化合物5個，此外還有3個未知化合物，結(jié)果見圖1和表1。

2.1.2 南酸棗皮果酒中總黃酮、總原花青素和總酚的含量測定結(jié)果

根據(jù)質(zhì)譜定性分析結(jié)果，南酸棗皮果酒含有豐富的生物活性成分，進(jìn)一步采用紫外分光光度法對南酸棗皮果酒中的總黃酮、總原花青素和總酚進(jìn)行定量分析的結(jié)果見表2。

如表2所示，南酸棗皮果酒富含豐富的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，如原花青素、黃酮和多酚。其中總黃酮含量最高，可達(dá)到15.239mg/mL；總酚含量為7.595mg/mL；總原花青素含量為4.015 mg/mL。有研究表明，南酸棗皮中的生物活性成分具有良好的抗氧化、抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、降血糖活性[28]。這為南酸棗皮果酒良好的保健功能和開發(fā)前景提供了數(shù)據(jù)支撐。

2.2 南酸棗皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果

南酸棗皮果酒可通過抑制α-葡萄糖苷酶活性，使淀粉水解速度減緩，達(dá)到降血糖的功效，結(jié)果見圖2。

圖1 負(fù)離子模式下的南酸棗皮果酒總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram in negative ion mode of Choerospondias axillaris fruit peel wine

表1 南酸棗皮果酒色譜峰質(zhì)譜指認(rèn)Table 1 Identification of chemical components of Choerospondias axillaris fruit peel wine

表2 南酸棗皮果酒中總黃酮、總原花青素和總酚的含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of total flavonoids，total proanthocyanidins and total phenols in Choerospondias axillaris fruit peel wine mg/mL

圖2 南酸棗皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果Fig.2 The inhibition activity on α-glucosidase of Choerospondias axillaris fruit peel wine

如圖2所示，α-葡萄糖苷酶抑制率隨樣品和阿卡波糖濃度增加而升高，當(dāng)南酸棗皮果酒的濃度達(dá)到50 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率可達(dá)到75%。用SPSS 21.0軟件計算IC50值，南酸棗皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值為10.996 mg/mL，阿卡波糖為0.0915 mg/mL。南酸棗皮果酒的α-葡萄糖苷酶抑制活性與其含有豐富的總黃酮、總原花青素和總酚等化學(xué)成分有關(guān)。

2.3 南酸棗皮果酒的體外抗氧化活性

南酸棗皮果酒體外抗氧化活性結(jié)果見圖3。

圖3 南酸棗皮果酒體外抗氧化活性結(jié)果Fig.3 The antioxidant activity in vitro of Choerospondias axillaris fruit peel wine

由圖3可知，南酸棗皮果酒具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。DPPH自由基清除率隨樣品和維生素C濃度增加而升高，當(dāng)南酸棗皮果酒的濃度達(dá)到40 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達(dá)到99.95%。用SPSS 21.0軟件計算IC50值，南酸棗皮果酒清除DPPH自由基的IC50值為2.656 mg/mL，維生素C為16.35 μg/mL。由于南酸棗皮果酒中富含種類更為豐富的黃酮和多酚等抗氧化活性成分，所以南酸棗皮果酒具有一定的DPPH自由基清除能力和體外抗氧化活性。

3 討論與結(jié)論

南酸棗在食品領(lǐng)域開發(fā)利用的過程中，產(chǎn)生了大量棗皮副產(chǎn)物未得到充分利用，不但造成了資源的浪費(fèi)，還帶來了環(huán)境污染問題。在開展南酸棗皮副產(chǎn)物化學(xué)成分和生物活性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了南酸棗皮果酒等高值化產(chǎn)品研發(fā)。南酸棗皮果酒酒精度低，口感好，適用人群廣泛，操作簡單，生產(chǎn)方便有利于南酸棗皮的綜合利用，提升其附加價值，拓展南酸棗產(chǎn)業(yè)鏈，為類似廢棄物的綜合利用提供思路[30]。

現(xiàn)有文獻(xiàn)研究表明南酸棗果皮含有豐富的原花青素、有機(jī)酸、黃酮和酚類化合物[1，18-20]。本試驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)用和紫外分析檢測技術(shù)，對南酸棗皮果酒進(jìn)行化學(xué)成分定性定量分析，并評價南酸棗皮果酒的抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性。通過對照品比對和參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，從南酸棗皮果酒中發(fā)現(xiàn)34個化合物，南酸棗皮果酒的化學(xué)組成比南酸棗果皮更為豐富，南酸棗皮果酒在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了種類更為豐富的酯類、有機(jī)酸類和黃酮類化合物。南酸棗皮果酒中新產(chǎn)生的酯類成分如阿魏酸酒石酸酯、原兒茶酸己糖酯，可以使南酸棗皮果酒呈現(xiàn)發(fā)酵的濃郁果香。果酒發(fā)酵過程中新產(chǎn)生的有機(jī)酸類成分如丁香酸、花生酸、花生油酸和對香豆?？崴幔坏梢允鼓纤釛椘す瞥尸F(xiàn)獨(dú)特的風(fēng)味，還能起到改善食欲，促進(jìn)消化吸收，調(diào)節(jié)人體酸堿平衡的作用。南酸棗皮果酒中新產(chǎn)生的黃酮類化合物有槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、牡荊素和EPSILON-白藜蘆醇脫氫二聚體。體外活性試驗(yàn)表明，南酸棗皮果酒展現(xiàn)出一定的抗氧化能力和體外降血糖活性。此研究結(jié)果為南酸棗皮果酒等高值化產(chǎn)品開發(fā)和南酸棗果皮廢棄物的綜合利用提供數(shù)據(jù)支撐。