李 皓,盛希群,劉 靜,鐘 星
(湖北大學(xué)知行學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,武漢 430011)
熊果苷最初是從熊果葉子中提取出來的一種糖苷類化合物[1],其學(xué)名為4-羥基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷[2]。隨著研究的深入,在多種植物中均發(fā)現(xiàn)有熊果苷的存在。
起初作為藥用價(jià)值時(shí),發(fā)現(xiàn)其具有止咳[3]和平喘的功效[4]。隨著現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)其還具有抗氧化作用[5]和美白效果。
熊果苷能夠在不具備黑素細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)抑制黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶,阻斷多巴以及多巴醌的合成,從而抑制黑色素的生成,達(dá)到增白皮膚的效果[6]。它通過將自身與酪氨酸酶直接結(jié)合來競爭多巴的結(jié)合位點(diǎn),并加速皮膚下黑色素的分解和排出,從而在一定程度上能減少皮膚中色素的沉積[7]。而α-熊果苷的美白作用優(yōu)于β-熊果苷十幾倍,并且不會抑制人體內(nèi)的細(xì)胞生長,無副作用。同時(shí)α-熊果苷與β-熊果苷相比也更加穩(wěn)定,具有更高的耐熱性[8]。熊果苷的生產(chǎn)方法已經(jīng)發(fā)展出多種方式,熊果苷也成為美白產(chǎn)品中必不可少的添加物[9,10]。
試劑購自國藥集團(tuán)和生工生物工程(上海)股份有限公司,菌株和載體為湖北大學(xué)知行學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。
在工業(yè)菌株誘導(dǎo)后,產(chǎn)生的轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶能將對苯二酚和麥芽糖按照2∶1 的摩爾比反應(yīng)生成單一產(chǎn)物α-熊果苷,化學(xué)反應(yīng)式如圖1 所示。
圖1 對苯二酚與麥芽糖經(jīng)轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶合成α-熊果苷
①稱取一定量海草酸鈉加熱攪拌溶解于去離子水中;②稱取一定量氯化鈣溶解于冰置去離子水中;③將冷卻后的海藻酸鈉膠體與一定量酶液用磁力攪拌器均勻混合,獲取一定濃度的膠體;④利用恒流泵維持一個(gè)適當(dāng)?shù)牧魉?,并將出液口綁定在一個(gè)合適的高度;⑤利用海藻酸鈉膠體滴定冰置后的氯化鈣溶液,獲得固定化珠;⑥待固定化珠凝固,取出并用去離子水沖洗;⑦將沖洗后的固定化珠放置于濾紙上,冷藏于-20 ℃冰箱進(jìn)行鈣化處理;⑧鈣化操作結(jié)束后,將固定化珠放入戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)處理;⑨用去離子水沖洗,置于培養(yǎng)皿內(nèi),低溫保藏。
進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)劑處理,當(dāng)搖床培養(yǎng)完成后,檢測其OD,檢測結(jié)果為0.583,符合IPTG 添加標(biāo)準(zhǔn)。保留5 mL 原始菌液,其余10 mL 菌液按照1‰比例加入10 μL IPTG 誘導(dǎo)劑混合均勻,置于搖床以37 ℃恒溫和 225 r∕min 振蕩培養(yǎng) 6 h。
取出誘導(dǎo)完成的菌液,進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎處理,設(shè)定功率為80 W,占空比為50%,破碎時(shí)間3 min。后期大批量處理時(shí)使用大號離心管,每次破碎8 mL,功率為100 W,占空比50%,破碎8 min。經(jīng)檢測,重組酶已成功表達(dá)。
以3.0%海藻酸鈉滴定300 g∕L 氯化鈣溶液所制成的固定化珠為例,選取其某批次固定化珠中滴定效果較好的15 顆固定化珠,放置成一排??傞L度約為5.3 cm,其單個(gè)固定化珠的平均直徑約為3.53 mm。再將這些珠子用電子天平稱重,得到0.376 7 g的總重量,以此得出單顆固定化珠的重量約為0.025 1 g。并進(jìn)行多批次滴定固定化珠,將各組固定化珠數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總,至少以3 組以上的平行數(shù)據(jù)為依據(jù),進(jìn)行固定化珠大小及重量的統(tǒng)計(jì)。
經(jīng)過初期試驗(yàn),海藻酸鈉的溶解上限約為4.25%,因此設(shè)定多個(gè)海藻酸鈉膠體濃度梯度(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%),將海藻酸鈉膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱冰置,利用恒流泵滴定400 g∕L 氯化鈣溶液,固定化反應(yīng)30 min 后將固定化珠置于-20 ℃下進(jìn)行1 h 鈣化操作,并且不交聯(lián)。記錄各組固定化珠的數(shù)據(jù),并統(tǒng)計(jì)其制作消耗。由表1 可知,每毫升膠體固定化后的重量約為0.332 g,并以此為標(biāo)準(zhǔn),稱取0.332 g 固定化珠作為1 mL 酶液參與酶活檢測試驗(yàn),之后用1 mL 去離子水洗滌固定化珠加入體系。
表1 各濃度海藻酸鈉膠體固定化珠數(shù)據(jù)
對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測,并將吸收峰面積換算為生成物濃度。由圖1 可知,用3.0%濃度的海藻酸鈉膠體滴定400 g∕L氯化鈣溶液,固定化效果最好,因此選取3.0%的海藻酸鈉膠體進(jìn)行進(jìn)一步研究。
圖2 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響
已知氯化鈣溶液濃度決定固定化效率,且氯化鈣的溶解上限約為600 g∕L,但氯化鈣溶液過高會使固定化反應(yīng)過于劇烈。以3.0%海藻酸鈉膠體滴定不同濃度(600、500、400、300、200 g∕L)的氯化鈣溶液,將海藻酸鈉膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱,固定化反應(yīng)30 min 后將固定化珠置于-20 ℃進(jìn)行1 h鈣化操作,且不交聯(lián)。記錄各組固定化珠的數(shù)據(jù),并統(tǒng)計(jì)其制作消耗。由表2 可知,隨著氯化鈣濃度的增加,得到的固定化珠平均質(zhì)量和直徑也逐漸增加。
對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測,并將吸收峰面積換算為生成物濃度,檢測結(jié)果見圖3。由圖3 可知,在海藻酸鈉膠體濃度為3.0%、氯化鈣溶液濃度為300 g∕L時(shí),固定化效果最佳。
表2 各濃度氯化鈣溶液固定化珠數(shù)據(jù)
圖3 氯化鈣濃度對固定化酶活性的影響
在此基礎(chǔ)上,添加明膠作為輔助成分。經(jīng)初期測定,明膠的溶解上限約為25%,但當(dāng)明膠濃度超過5%時(shí),混合膠體無法成功固定化,因此設(shè)定明膠梯度為0、1.0%、2.0%、3.0%、4.0% 和5.0%,將海藻酸鈉-明膠混合膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱冰置,固定化反應(yīng)30 min 后將固定化珠置于-20 ℃條件下進(jìn)行1 h 鈣化操作,且不交聯(lián)。記錄各組固定化珠的數(shù)據(jù),并統(tǒng)計(jì)其制作消耗,滴定效果見表3。由表3可知,隨著明膠濃度的增加,得到的固定化珠的平均質(zhì)量和直徑也逐漸增加。
表3 各濃度明膠膠體固定化珠數(shù)據(jù)
對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測,并將吸收峰面積換算為生成物濃度,檢測結(jié)果見圖4。由圖4 可知,在3.0%海藻酸鈉膠體和300 g∕L 氯化鈣溶液的基礎(chǔ)上,輔助加入低含量的明膠可提升固定化效果。其中,明膠濃度為3%時(shí)的固定化效果最佳。
圖4 明膠濃度對固定化酶活性的影響
在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 濃度冰置氯化鈣溶液的基礎(chǔ)上,設(shè)定固定化時(shí)間梯度為10、20、30、40、50、60 min,在室溫條件下進(jìn)行固定化時(shí)間探究試驗(yàn)。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測,并將吸收峰面積換算為酶活力值,檢測結(jié)果見圖5。由圖5 可知,在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下制成的固定化珠,其固定化反應(yīng)的最佳時(shí)長為20 min。
圖5 固定化時(shí)間對固定化酶活性的影響
在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 濃度冰置氯化鈣溶液的基礎(chǔ)上,設(shè)定鈣化時(shí)間梯度為 10、20、30、40、50、60 min,在-20 ℃條件下進(jìn)行鈣化試驗(yàn)。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件和抗性條件下的雙重檢測,并將吸光度換算為酶活力,檢測結(jié)果見圖6。由圖6 可知,在由3.0%濃度海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠,其鈣化操作時(shí)間的最佳時(shí)長為50 min。
圖6 鈣化時(shí)間對固定化酶活性的影響
以固定化成分3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 冰置氯化鈣溶液,固定化20 min,并鈣化50 min,在此基礎(chǔ)上,設(shè)定戊二醛交聯(lián)濃度梯度為1%、2%、3%、4%、5%,在室溫下進(jìn)行戊二醛交聯(lián)試驗(yàn),將固定化珠浸泡于相應(yīng)濃度的戊二醛溶液中,暫定交聯(lián)時(shí)間為1 h。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測,并將吸收峰面積換算為生成物濃度,檢測結(jié)果見圖7。由圖7 可以看出,在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠鈣化50 min 后,在多個(gè)濃度梯度的戊二醛交聯(lián)劑中,保持最佳固定化效果的濃度為1%。
圖7 交聯(lián)濃度對固定化酶活性的影響
在1%戊二醛交聯(lián)劑濃度的基礎(chǔ)上,設(shè)定交聯(lián)時(shí)間梯度為0、20、30、40、50、60 min,在室溫下進(jìn)行戊二醛交聯(lián)試驗(yàn)。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測,并將吸收峰面積換算為生成物濃度(圖8)。隨著交聯(lián)時(shí)間的增加,固定化珠的強(qiáng)度逐漸增加,但是固定化酶的酶活性和耐受性逐漸下降,綜合考慮,交聯(lián)時(shí)間固定為20 min。
圖8 交聯(lián)時(shí)間對固定化酶活性的影響
以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定冰置300 g∕L 氯化鈣溶液,固定化20 min,并鈣化50 min,在此基礎(chǔ)上,設(shè)定磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-檸檬酸和磷酸二氫鉀-氫氧化鈉等多個(gè)pH 為7.0 的緩沖液類型組,替換膠體溶解溶液,制作各組緩沖液類型的固定化珠。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測,并將吸收峰面積換算為生成物濃度,檢測結(jié)果見圖9。由圖9 可以看出,在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠效果較好,在此基礎(chǔ)上,將膠體溶解液由去離子水改為pH 為7 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液后,固定化效果得到提升。
圖9 緩沖溶液類型對固定化酶活性的影響
在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定冰置的300 g∕L 氯化鈣溶液,固定化20 min,并鈣化50 min,在此基礎(chǔ)上,選取磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為對象,將海藻酸鈉和明膠顆粒溶解其中,設(shè)定緩沖液pH 梯度為6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0,在室溫條件下進(jìn)行緩沖液pH 試驗(yàn)。滴定效果見表4。由表4 可以看出,在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠溶于磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下,在多個(gè)pH 梯度試驗(yàn)中,僅在pH 為7 時(shí)固定化成功。
表4 pH 對固定化珠滴定效果的影響
在確定了最佳固定化條件以及其最佳保存條件的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)對固定化酶實(shí)際效果的探究試驗(yàn),通過對-20 ℃凍存粗提酶液以及固定化珠,再用40 ℃解凍,并進(jìn)行酶活檢測,在-20 ℃凍存酶液和固定化珠,以30 min 作為每次再凍存的時(shí)間標(biāo)準(zhǔn),在最適條件下反復(fù)檢測其酶活,觀察酶活損失情況,以探究固定化珠的實(shí)際運(yùn)用效果。將吸收峰面積換算為酶活存活率,檢測結(jié)果見圖10。由圖10 可以看出,反應(yīng)6次時(shí),游離態(tài)酶已完全失活,而固定化酶仍保留有較高活性,表明在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠溶解于pH 為7 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液所制成的混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 并鈣化操作50 min 所制成的固定化珠與未固定化的酶液相比,具有明顯的保護(hù)作用。
圖10 固定化酶與游離態(tài)酶活性的對比
在本研究中,將轉(zhuǎn)化至Escherichia coliBL21 Gold(DE3)中的aglA基因的質(zhì)粒表達(dá)葡萄糖苷酶用以催化生產(chǎn)α-熊果苷。再利用超聲波破碎技術(shù)和鎳離子層析柱提取并純化轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶,并將其采用海藻酸鈉-明膠混合固定,使其可重復(fù)使用。該方法有很好的應(yīng)用前景,為工業(yè)化制備奠定了良好的基礎(chǔ)。