李 皓，盛希群，劉 靜，鐘 星

（湖北大學(xué)知行學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，武漢 430011）

熊果苷最初是從熊果葉子中提取出來的一種糖苷類化合物［1］，其學(xué)名為4-羥基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷［2］。隨著研究的深入，在多種植物中均發(fā)現(xiàn)有熊果苷的存在。

起初作為藥用價(jià)值時(shí)，發(fā)現(xiàn)其具有止咳［3］和平喘的功效［4］。隨著現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)其還具有抗氧化作用［5］和美白效果。

熊果苷能夠在不具備黑素細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)抑制黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶，阻斷多巴以及多巴醌的合成，從而抑制黑色素的生成，達(dá)到增白皮膚的效果［6］。它通過將自身與酪氨酸酶直接結(jié)合來競爭多巴的結(jié)合位點(diǎn)，并加速皮膚下黑色素的分解和排出，從而在一定程度上能減少皮膚中色素的沉積［7］。而α-熊果苷的美白作用優(yōu)于β-熊果苷十幾倍，并且不會抑制人體內(nèi)的細(xì)胞生長，無副作用。同時(shí)α-熊果苷與β-熊果苷相比也更加穩(wěn)定，具有更高的耐熱性［8］。熊果苷的生產(chǎn)方法已經(jīng)發(fā)展出多種方式，熊果苷也成為美白產(chǎn)品中必不可少的添加物［9，10］。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑購自國藥集團(tuán)和生工生物工程（上海）股份有限公司，菌株和載體為湖北大學(xué)知行學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 熊果苷酶法生成

在工業(yè)菌株誘導(dǎo)后，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶能將對苯二酚和麥芽糖按照2∶1 的摩爾比反應(yīng)生成單一產(chǎn)物α-熊果苷，化學(xué)反應(yīng)式如圖1 所示。

圖1 對苯二酚與麥芽糖經(jīng)轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶合成α-熊果苷

1.2 海藻酸鈉固定化

①稱取一定量海草酸鈉加熱攪拌溶解于去離子水中；②稱取一定量氯化鈣溶解于冰置去離子水中；③將冷卻后的海藻酸鈉膠體與一定量酶液用磁力攪拌器均勻混合，獲取一定濃度的膠體；④利用恒流泵維持一個(gè)適當(dāng)?shù)牧魉?，并將出液口綁定在一個(gè)合適的高度；⑤利用海藻酸鈉膠體滴定冰置后的氯化鈣溶液，獲得固定化珠；⑥待固定化珠凝固，取出并用去離子水沖洗；⑦將沖洗后的固定化珠放置于濾紙上，冷藏于-20 ℃冰箱進(jìn)行鈣化處理；⑧鈣化操作結(jié)束后，將固定化珠放入戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)處理；⑨用去離子水沖洗，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，低溫保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)及提取

進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)劑處理，當(dāng)搖床培養(yǎng)完成后，檢測其OD，檢測結(jié)果為0.583，符合IPTG 添加標(biāo)準(zhǔn)。保留5 mL 原始菌液，其余10 mL 菌液按照1‰比例加入10 μL IPTG 誘導(dǎo)劑混合均勻，置于搖床以37 ℃恒溫和 225 r∕min 振蕩培養(yǎng) 6 h。

取出誘導(dǎo)完成的菌液，進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎處理，設(shè)定功率為80 W，占空比為50%，破碎時(shí)間3 min。后期大批量處理時(shí)使用大號離心管，每次破碎8 mL，功率為100 W，占空比50%，破碎8 min。經(jīng)檢測，重組酶已成功表達(dá)。

2.2 固定化試驗(yàn)結(jié)果

以3.0%海藻酸鈉滴定300 g∕L 氯化鈣溶液所制成的固定化珠為例，選取其某批次固定化珠中滴定效果較好的15 顆固定化珠，放置成一排?？傞L度約為5.3 cm，其單個(gè)固定化珠的平均直徑約為3.53 mm。再將這些珠子用電子天平稱重，得到0.376 7 g的總重量，以此得出單顆固定化珠的重量約為0.025 1 g。并進(jìn)行多批次滴定固定化珠，將各組固定化珠數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，至少以3 組以上的平行數(shù)據(jù)為依據(jù)，進(jìn)行固定化珠大小及重量的統(tǒng)計(jì)。

經(jīng)過初期試驗(yàn)，海藻酸鈉的溶解上限約為4.25%，因此設(shè)定多個(gè)海藻酸鈉膠體濃度梯度（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%），將海藻酸鈉膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱冰置，利用恒流泵滴定400 g∕L 氯化鈣溶液，固定化反應(yīng)30 min 后將固定化珠置于-20 ℃下進(jìn)行1 h 鈣化操作，并且不交聯(lián)。記錄各組固定化珠的數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計(jì)其制作消耗。由表1 可知，每毫升膠體固定化后的重量約為0.332 g，并以此為標(biāo)準(zhǔn)，稱取0.332 g 固定化珠作為1 mL 酶液參與酶活檢測試驗(yàn)，之后用1 mL 去離子水洗滌固定化珠加入體系。

表1 各濃度海藻酸鈉膠體固定化珠數(shù)據(jù)

對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度。由圖1 可知，用3.0%濃度的海藻酸鈉膠體滴定400 g∕L氯化鈣溶液，固定化效果最好，因此選取3.0%的海藻酸鈉膠體進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響

已知氯化鈣溶液濃度決定固定化效率，且氯化鈣的溶解上限約為600 g∕L，但氯化鈣溶液過高會使固定化反應(yīng)過于劇烈。以3.0%海藻酸鈉膠體滴定不同濃度（600、500、400、300、200 g∕L）的氯化鈣溶液，將海藻酸鈉膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱，固定化反應(yīng)30 min 后將固定化珠置于-20 ℃進(jìn)行1 h鈣化操作，且不交聯(lián)。記錄各組固定化珠的數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計(jì)其制作消耗。由表2 可知，隨著氯化鈣濃度的增加，得到的固定化珠平均質(zhì)量和直徑也逐漸增加。

對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度，檢測結(jié)果見圖3。由圖3 可知，在海藻酸鈉膠體濃度為3.0%、氯化鈣溶液濃度為300 g∕L時(shí)，固定化效果最佳。

表2 各濃度氯化鈣溶液固定化珠數(shù)據(jù)

圖3 氯化鈣濃度對固定化酶活性的影響

在此基礎(chǔ)上，添加明膠作為輔助成分。經(jīng)初期測定，明膠的溶解上限約為25%，但當(dāng)明膠濃度超過5%時(shí)，混合膠體無法成功固定化，因此設(shè)定明膠梯度為0、1.0%、2.0%、3.0%、4.0% 和5.0%，將海藻酸鈉-明膠混合膠體和氯化鈣溶液置于4 ℃冰箱冰置，固定化反應(yīng)30 min 后將固定化珠置于-20 ℃條件下進(jìn)行1 h 鈣化操作，且不交聯(lián)。記錄各組固定化珠的數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計(jì)其制作消耗，滴定效果見表3。由表3可知，隨著明膠濃度的增加，得到的固定化珠的平均質(zhì)量和直徑也逐漸增加。

表3 各濃度明膠膠體固定化珠數(shù)據(jù)

對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度，檢測結(jié)果見圖4。由圖4 可知，在3.0%海藻酸鈉膠體和300 g∕L 氯化鈣溶液的基礎(chǔ)上，輔助加入低含量的明膠可提升固定化效果。其中，明膠濃度為3%時(shí)的固定化效果最佳。

2.3 固定化時(shí)間

圖4 明膠濃度對固定化酶活性的影響

在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 濃度冰置氯化鈣溶液的基礎(chǔ)上，設(shè)定固定化時(shí)間梯度為10、20、30、40、50、60 min，在室溫條件下進(jìn)行固定化時(shí)間探究試驗(yàn)。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為酶活力值，檢測結(jié)果見圖5。由圖5 可知，在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下制成的固定化珠，其固定化反應(yīng)的最佳時(shí)長為20 min。

圖5 固定化時(shí)間對固定化酶活性的影響

2.4 固定化鈣化時(shí)間

在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 濃度冰置氯化鈣溶液的基礎(chǔ)上，設(shè)定鈣化時(shí)間梯度為 10、20、30、40、50、60 min，在-20 ℃條件下進(jìn)行鈣化試驗(yàn)。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件和抗性條件下的雙重檢測，并將吸光度換算為酶活力，檢測結(jié)果見圖6。由圖6 可知，在由3.0%濃度海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠，其鈣化操作時(shí)間的最佳時(shí)長為50 min。

圖6 鈣化時(shí)間對固定化酶活性的影響

2.5 固定化交聯(lián)效果

以固定化成分3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定300 g∕L 冰置氯化鈣溶液，固定化20 min，并鈣化50 min，在此基礎(chǔ)上，設(shè)定戊二醛交聯(lián)濃度梯度為1%、2%、3%、4%、5%，在室溫下進(jìn)行戊二醛交聯(lián)試驗(yàn)，將固定化珠浸泡于相應(yīng)濃度的戊二醛溶液中，暫定交聯(lián)時(shí)間為1 h。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度，檢測結(jié)果見圖7。由圖7 可以看出，在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠鈣化50 min 后，在多個(gè)濃度梯度的戊二醛交聯(lián)劑中，保持最佳固定化效果的濃度為1%。

圖7 交聯(lián)濃度對固定化酶活性的影響

在1%戊二醛交聯(lián)劑濃度的基礎(chǔ)上，設(shè)定交聯(lián)時(shí)間梯度為0、20、30、40、50、60 min，在室溫下進(jìn)行戊二醛交聯(lián)試驗(yàn)。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度（圖8）。隨著交聯(lián)時(shí)間的增加，固定化珠的強(qiáng)度逐漸增加，但是固定化酶的酶活性和耐受性逐漸下降，綜合考慮，交聯(lián)時(shí)間固定為20 min。

圖8 交聯(lián)時(shí)間對固定化酶活性的影響

2.6 固定化緩沖液探究

以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定冰置300 g∕L 氯化鈣溶液，固定化20 min，并鈣化50 min，在此基礎(chǔ)上，設(shè)定磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-檸檬酸和磷酸二氫鉀-氫氧化鈉等多個(gè)pH 為7.0 的緩沖液類型組，替換膠體溶解溶液，制作各組緩沖液類型的固定化珠。對各組固定化珠進(jìn)行最適條件與耐性條件下的雙重檢測，并將吸收峰面積換算為生成物濃度，檢測結(jié)果見圖9。由圖9 可以看出，在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 制成的固定化珠效果較好，在此基礎(chǔ)上，將膠體溶解液由去離子水改為pH 為7 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液后，固定化效果得到提升。

圖9 緩沖溶液類型對固定化酶活性的影響

2.7 固定化緩沖液pH 探究

在以固定化成分為3.0%海藻酸鈉與3.0%明膠冰置混合膠體滴定冰置的300 g∕L 氯化鈣溶液，固定化20 min，并鈣化50 min，在此基礎(chǔ)上，選取磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為對象，將海藻酸鈉和明膠顆粒溶解其中，設(shè)定緩沖液pH 梯度為6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，在室溫條件下進(jìn)行緩沖液pH 試驗(yàn)。滴定效果見表4。由表4 可以看出，在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠溶于磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下，在多個(gè)pH 梯度試驗(yàn)中，僅在pH 為7 時(shí)固定化成功。

表4 pH 對固定化珠滴定效果的影響

2.8 固定化酶與游離態(tài)酶活性對比

在確定了最佳固定化條件以及其最佳保存條件的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)對固定化酶實(shí)際效果的探究試驗(yàn)，通過對-20 ℃凍存粗提酶液以及固定化珠，再用40 ℃解凍，并進(jìn)行酶活檢測，在-20 ℃凍存酶液和固定化珠，以30 min 作為每次再凍存的時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)，在最適條件下反復(fù)檢測其酶活，觀察酶活損失情況，以探究固定化珠的實(shí)際運(yùn)用效果。將吸收峰面積換算為酶活存活率，檢測結(jié)果見圖10。由圖10 可以看出，反應(yīng)6次時(shí)，游離態(tài)酶已完全失活，而固定化酶仍保留有較高活性，表明在由3.0%海藻酸鈉和3.0%明膠溶解于pH 為7 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液所制成的混合膠體滴定300 g∕L 氯化鈣溶液的條件下固定化20 min 并鈣化操作50 min 所制成的固定化珠與未固定化的酶液相比，具有明顯的保護(hù)作用。

圖10 固定化酶與游離態(tài)酶活性的對比

3 小結(jié)與討論

在本研究中，將轉(zhuǎn)化至Escherichia coliBL21 Gold（DE3）中的aglA基因的質(zhì)粒表達(dá)葡萄糖苷酶用以催化生產(chǎn)α-熊果苷。再利用超聲波破碎技術(shù)和鎳離子層析柱提取并純化轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶，并將其采用海藻酸鈉-明膠混合固定，使其可重復(fù)使用。該方法有很好的應(yīng)用前景，為工業(yè)化制備奠定了良好的基礎(chǔ)。