康曉樂(lè)，李東霓，李 晨，2，康紅艷，2，王妙姝，2，田洪濤，2，3*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定071001 3 國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定071001）

我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)量巨大，成熟蘋(píng)果味道酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種生物活性物質(zhì)，如多糖、粗纖維、蛋白質(zhì)、維生素B1、維生素B2、維生素C 等多種成分，具有降膽固醇，降血壓，潤(rùn)腸通便，促進(jìn)新陳代謝等功效[1]。然而，近些年我國(guó)蘋(píng)果出現(xiàn)嚴(yán)重滯銷現(xiàn)象，不僅有損果農(nóng)收益，給整個(gè)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展也造成了很大困擾，因此，增加蘋(píng)果的深加工力度，拓展蘋(píng)果產(chǎn)品種類具有重要意義。

酵素產(chǎn)品因其具有加速代謝、殺菌消炎等顯著的功效，而倍受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎。研究表明，酵素相關(guān)產(chǎn)品富含酚類、有機(jī)酸類、酶類、黃酮類等活性物質(zhì)，可以輔助清除體內(nèi)廢物，促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)，具有解酒護(hù)肝，消炎抗菌，潤(rùn)腸通便，美容抗衰等功效[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，食用酵素以自然發(fā)酵為主，多為混種共生發(fā)酵，發(fā)酵周期長(zhǎng)，發(fā)酵過(guò)程中參數(shù)變化復(fù)雜。目前，學(xué)者對(duì)食用酵素的研究多集中于其代謝產(chǎn)物、抗氧化性能、酶活力等方面。對(duì)酵素產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性分析的文獻(xiàn)較少，而且，對(duì)于微生物多樣性分析，大多數(shù)學(xué)者采用傳統(tǒng)分離純化鑒定方法、PCR-DGGE 技術(shù)等。如：蔣增良[3]采用傳統(tǒng)方法從葡萄酵素中分離鑒定出3 種酵母菌。吳偉杰等[4]利用傳統(tǒng)法分離菌株，采用分子生物學(xué)方法鑒定蘿卜泡菜中的乳酸菌，共分離鑒定出12 個(gè)菌種，包括：植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、乳酸腸球菌等。杜麗平等[5]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)變性、梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)分析木瓜酵素自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌和酵母的多樣性及變化規(guī)律，結(jié)果顯示：主要有植物乳桿菌、假腸膜明串珠菌、類腸膜魏斯氏菌、釀酒酵母假絲酵母、畢赤酵母等。楊芳等[6]利用PCR-DGGE技術(shù)，檢測(cè)6 種自然發(fā)酵酵素的優(yōu)勢(shì)菌，結(jié)果顯示：細(xì)菌分布于3 個(gè)屬5 個(gè)種，包括：乳桿菌屬、醋桿菌屬；優(yōu)勢(shì)酵母分布于3 個(gè)屬6 個(gè)種。以上結(jié)果表明，不同酵素中有相同的菌屬，也有其特有的菌屬，不同菌株在發(fā)酵中的作用有待深入研究。傳統(tǒng)分離鑒定法和PCR-DGGE 技術(shù)雖然可以在一定程度上反映樣本的物種組成和優(yōu)勢(shì)物種，但是不能全方位解析菌群組成和結(jié)構(gòu)。此外，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，培養(yǎng)的微生物種類有限，僅占環(huán)境樣品的1%～10%[7]，可能會(huì)遺漏一些種類的微生物，甚至是在酵素發(fā)酵過(guò)程中起關(guān)鍵作用的微生物，導(dǎo)致無(wú)法解析發(fā)酵過(guò)程中微生物的組成、豐度及其變化情況。

宏基因組（Metagenome）是指在一定環(huán)境中所有微生物的基因總和。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能培養(yǎng)出所有的微生物，而宏基因組學(xué)方法不依賴微生物培養(yǎng)而是直接提取樣品全部微生物的遺傳物質(zhì)[8]，更全面的包含了環(huán)境樣品的微生物遺傳信息。應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)的數(shù)據(jù)分析方法，分析不同樣品中微生物的群落組成、豐度、物種多樣性，分析微生物與環(huán)境之間的影響，有利于全面認(rèn)識(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學(xué)在很多行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。例如：基礎(chǔ)微生物學(xué)、海洋微生物學(xué)[9]、土壤學(xué)、醫(yī)學(xué)[10]、生態(tài)農(nóng)業(yè)、食品領(lǐng)域。

本研究以自然發(fā)酵蘋(píng)果酵素為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)和真菌ITS1 區(qū)分析的宏基因組學(xué)技術(shù)，探明蘋(píng)果酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的多樣性及其菌群動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為進(jìn)一步篩選蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵優(yōu)良的優(yōu)勢(shì)微生物菌種，研制高效直投式發(fā)酵劑，實(shí)現(xiàn)人工控制發(fā)酵蘋(píng)果酵素系列新產(chǎn)品，提高蘋(píng)果酵素產(chǎn)品生產(chǎn)效率與質(zhì)量，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新鮮成熟蘋(píng)果，河北丹鳳山農(nóng)業(yè)科技有限公司。白砂糖（食品級(jí)），百樂(lè)超市；娃哈哈純凈水；VC（分析純級(jí)），天津市鑫鉑特化工有限公司；5 L玻璃罐。

FLC-3 超凈臺(tái)，哈爾濱市東聯(lián)公司；YXQSG46-280S 型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、FA1004A 電子天平、ABI GeneAmpR9700 型PCR 儀，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 用無(wú)菌水將蘋(píng)果洗凈，于無(wú)菌操作臺(tái)中晾干，去核，去除果蒂，切片。白砂糖和蒸餾水用紫外線殺菌30 min，按質(zhì)量比將白砂糖∶蘋(píng)果∶水=1∶8∶10 加入到已滅菌的玻璃罐中[11]，添加0.006%的VC[12]，置于30 ℃培養(yǎng)箱，靜置發(fā)酵40 d[13]。

1.2.2 樣品采集 在超凈工作臺(tái)中取蘋(píng)果酵素發(fā)酵第10，20，35 天的樣品45 mL 加入滅菌的離心管中，-80 ℃冰箱保存，用于宏基因組研究。

1.2.3 宏基因組測(cè)序流程

1） 樣品處理 分別取在-20 ℃保存的3 個(gè)時(shí)期的酵素樣品，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，取沉淀用于DNA 抽提。

2） DNA 抽提 根據(jù)E.Z.N.A.Rsoil 試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.） 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA 抽提，DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 檢測(cè)，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量。

3） PCR 擴(kuò)增采用引物1737F（GGAAG T AAAAGTCGTAACAAGG） 和2043R（GCTGCGTT CTTCATCGATGC）對(duì)真菌ITS1 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。采用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。

4） Illumina Miseq 測(cè)序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA） 進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進(jìn)行熒光檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300 的文庫(kù)。

Illumina MiSeq 平臺(tái)文庫(kù)構(gòu)建[14]：①連接“Y”字形接頭；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；④氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA 片段。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中。

Illumina MiSeq 平臺(tái)測(cè)序原理[15]（此部分操作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成）：①DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；②另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋（bridge）”；③PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA 簇；④DNA 擴(kuò)增子線性化成為單鏈。⑤加入改造的DNA 聚合酶和帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成1 個(gè)堿基；⑥用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上的核苷酸種類；⑦將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3' 端粘性，聚合第2 個(gè)核苷酸；⑧統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA 片段的序列。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接。

1.2.4 生物信息分析流程 樣品數(shù)據(jù)分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。MiSeq 測(cè)序得到的PE reads 首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后選出與OTU 代表序列相似性在97%以上的序列進(jìn)行OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU 聚類分析結(jié)果，進(jìn)行多種多樣性指數(shù)（Chao，Ace，Shannon，Simpson）分析、Alpha 多樣性分析[16]；基于分類學(xué)信息，在屬分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)。根據(jù)以上結(jié)果分析蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵不同時(shí)期的細(xì)菌和真菌的組成、多樣性、相對(duì)豐度以及動(dòng)態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵不同階段樣本PCR 擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)離心收集菌體，提取樣品中總DNA，然后對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)和真菌ITS1 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1表明，細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)擴(kuò)增后凝膠電泳檢測(cè)條帶長(zhǎng)度在500 bp 左右。真菌ITS1區(qū)擴(kuò)增后凝膠電泳檢測(cè)條帶長(zhǎng)度約為300 bp。說(shuō)明PCR 產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina，SanDiego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300 的文庫(kù)。

2.2 蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵不同時(shí)期樣本稀釋曲線及高通量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)序列采用隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們對(duì)應(yīng)的物種數(shù)目或多樣性指數(shù)，構(gòu)成稀釋曲線[17]。用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的多樣性、均一性或豐富度，也可用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以較完整的反映樣本的物種信息。結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

圖1 不同時(shí)期樣本微生物DNA 片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of sample microbial DNA fragments in different periods

圖2 3 個(gè)樣本中細(xì)菌的測(cè)序稀釋曲線Fig.2 The rarefaction curve of bacteria in 3 samples

圖3 3 個(gè)樣本中真菌的測(cè)序稀釋曲線Fig.3 The rarefaction curve of fungi in 3 samples

圖2和圖3顯示，在97%相似度水平上，起初曲線直線上升是由于3 個(gè)樣品中分別對(duì)細(xì)菌和真菌的測(cè)序量少，不足以覆蓋樣品中物種數(shù)，隨測(cè)序量增加，物種數(shù)急速增加；之后曲線趨于平緩，說(shuō)明隨測(cè)序量增大，物種數(shù)不再增加，測(cè)序量足夠大，能夠較完整的反映蘋(píng)果酵素樣本中絕大部分的微生物信息。

為保證分析結(jié)果的可靠性，既要有充足的測(cè)序數(shù)據(jù)量，也要保證序列的質(zhì)量，因此，測(cè)序后要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列。然后在去除嵌合體序列后進(jìn)行OTU 聚類分析。高通量測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 細(xì)菌高通量測(cè)序數(shù)據(jù)Table 1 High-throughput sequencing data of bacteria

表2 真菌高通量測(cè)序數(shù)據(jù)Table 2 High-throughput sequencing data of fungi

表1和表2可知，通過(guò)提取樣品DNA，對(duì)細(xì)菌338F-806R 區(qū)擴(kuò)增得到細(xì)菌的優(yōu)化序列數(shù)135 033 個(gè)，優(yōu)化堿基數(shù)目59 756 429 個(gè)；對(duì)真菌1737F-2043R 區(qū)擴(kuò)增，Illumina MiSeq 平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)處理之后，得到真菌的優(yōu)化序列數(shù)227 417 個(gè)，優(yōu)化堿基數(shù)目72 649 655 個(gè)，表明本次結(jié)果可信度高。結(jié)果顯示蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵3 個(gè)時(shí)期樣本中包含細(xì)菌Species 數(shù)386 個(gè)，聚類分析得到466個(gè)OTU。真菌Species 數(shù)5 個(gè)，聚類分析得到8 個(gè)OTU。

2.3 蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵不同時(shí)期樣本的微生物多樣性分析

基于OUT 聚類分析結(jié)果，Chao 常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，Ace 可估計(jì)群落中OUT 數(shù)目的指數(shù)，Shannon 和Simpson 用于估算微生物多樣性，Shannon 數(shù)值越大則多樣性越高，而Simpson 指數(shù)值越大則多樣性越低[18]。結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 蘋(píng)果酵素的細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 3 Bacteria diversity index of apple fermented beverage

表4 蘋(píng)果酵素的真菌多樣性指數(shù)Table 4 Fungal diversity index of apple fermented beverage

由表3可知，蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵不同時(shí)期樣品中，細(xì)菌多樣性指數(shù)Chao 和Ace 值先減小后增大，表明在整個(gè)發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌的物種總數(shù)存在先減少再增多的變化過(guò)程。第10 天Shannon 值最大而Simpson 值最小，表明蘋(píng)果酵素在發(fā)酵前期細(xì)菌多樣性最高。由表4可知，3 個(gè)樣品隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，真菌多樣性指數(shù)Chao 值和Ace 有所增大，表明在發(fā)酵過(guò)程中，真菌物種數(shù)有所增多。Shannon 值逐漸增大而Simpson 值逐漸減小，表明真菌多樣性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)有所增多。細(xì)菌的Chao 值、Ace 值和Shannon 值均比真菌的高，Simpson 值比真菌低，說(shuō)明細(xì)菌多樣性大于真菌的多樣性。

Alpha 多樣性圖，以Chao，Shannon，Ace，Simpson，Coverage 為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用柱形圖展現(xiàn)結(jié)果，可以反映一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)物種的多樣性。不同時(shí)期樣本細(xì)菌和真菌的Alpha 多樣性分別見(jiàn)圖4和圖5。

圖4和圖5顯示，蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵第10 天的樣品可以檢測(cè)到337 種細(xì)菌，4 種真菌；第20天的樣品可以檢測(cè)到79 種細(xì)菌，5 種真菌；第35天的樣品可以檢測(cè)到299 種細(xì)菌，5 種真菌。

本課題組在此之前對(duì)桑葚自然發(fā)酵酵素宏基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌物種數(shù)也存在先降低后增加的過(guò)程。田偉[19]研究的四川泡菜中也存在發(fā)酵中期微生物多樣性降低的現(xiàn)象。本研究結(jié)果提示，自然發(fā)酵過(guò)程中可能存在優(yōu)勢(shì)菌的富集，抑制其它菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象。

2.4 蘋(píng)果酵素發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，將多個(gè)樣本的群落結(jié)構(gòu)放在一起對(duì)比分析，既可以觀測(cè)樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)，也可以觀測(cè)其變化規(guī)律。本試驗(yàn)在屬水平上分析蘋(píng)果酵素不同時(shí)期樣品微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

由圖6可知，宏基因組測(cè)序技術(shù)顯示，此蘋(píng)果酵素樣本中細(xì)菌組成在屬水平上分類主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）、乳酸乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、醋酸菌屬（Acetobacter），還有少量其它菌（Others）。乳桿菌屬是第1 階段豐度最大的菌屬，占比為58.73%，第2，3 階段有所下降，占比分別為49.08%，56.34%，然而仍是主要菌屬。葡萄糖酸桿菌屬占比先增加后降低，分別為20.42%，34.72%，24.64%。乳酸乳球菌在所測(cè)得的3 個(gè)階段占比變化不大，3 個(gè)時(shí)期分別為6.51%，8.25%，8.12%。明串珠菌屬占比分別為2.15%，1.97%，1.76%。醋酸菌屬在第1，2 階段占比極少，分別為0.97%，1.10%，第3 階段增加到3.27%。魏斯氏菌屬占比分別為1.84%，0.98%，2.18%。第1 階段其它菌占比為9.38%，第2，3 階段占比逐漸下降為3.90%，3.69%。本研究結(jié)果表明，蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵過(guò)程一直存在乳酸菌發(fā)酵。葡萄糖酸桿菌貫穿發(fā)酵始終，該菌含有多種酶類，可以產(chǎn)生多種重要化合物，這些化合物在發(fā)酵中起著重要作用，可能影響發(fā)酵過(guò)程中抗氧化性能的變化。酵素中酶活力的強(qiáng)弱可能與葡萄糖酸桿菌中富含酶有關(guān)。醋酸菌在后期有所增長(zhǎng)，說(shuō)明后期可能存在醋酸發(fā)酵。明串珠菌呈逐漸下降的趨勢(shì)，說(shuō)明其可能是前期啟動(dòng)發(fā)酵的菌株。魏斯氏屬是異型發(fā)酵，與產(chǎn)品的風(fēng)味形成相關(guān)。

圖4 細(xì)菌Alpha 多樣性分析Fig.4 The Alpha diversity analysis of bacteria

圖5 真菌Alpha 多樣性分析Fig.5 The Alpha diversity analysis of fungi

由圖7可知，蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵樣本中真菌的物種多樣性比細(xì)菌少，在屬水平上主要有酵母屬（Saccharomyces）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、接合酵母屬（Zygosacharomyces），還有少量未知菌占比較低。第1 階段：接合酵母屬占89.5%，漢遜酵母屬占9.7%；第2 階段：接合酵母屬占18.2%，漢遜酵母屬占60.6%，酵母屬占19.3%；第3 階段：接合酵母屬占80.3%，漢遜酵母屬占8.7%，酵母屬占9.4%。本研究結(jié)果表明，接合酵母屬是第1 階段和第3 階段的主要菌株，漢遜酵母屬是第2 階段的主要菌株。酵母菌是發(fā)酵工業(yè)中經(jīng)常被利用的菌種，如啤酒和果酒的發(fā)酵[20]。有些酸馬奶的發(fā)酵也采用酵母菌[21]。由此可見(jiàn)，酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中起到很重要的作用。馮彥君[22]、楊培青[23]已將酵母菌應(yīng)用于人工控制發(fā)酵酵素中。

圖6 3 個(gè)樣品在屬水平上的細(xì)菌組成Fig.6 The bacterial composition of three samples at genus

本課題組在此之前對(duì)桑葚自然發(fā)酵酵素宏基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬占比達(dá)80%～90%，葡萄糖酸桿菌占比不足1%，研究結(jié)果與本研究有所差距。桑葚自然發(fā)酵酵素中的真菌主要為酵母屬和漢遜酵母屬，在種類和豐度上與本研究有所差異。可能是由于桑葚和蘋(píng)果的生長(zhǎng)環(huán)境、地區(qū)、季節(jié)不同，其表面附著微生物也有差異；制作工藝、發(fā)酵溫度、物料比例不同等，造成菌的種類及豐度有所差異。2 個(gè)研究的共同之處為主要菌種相似，并且真菌多樣性都比較低，遠(yuǎn)比細(xì)菌多樣性少。均存在酵母屬、漢遜酵母屬、乳桿菌屬、葡萄糖酸桿菌屬、乳酸乳球菌屬、魏斯氏屬、明串珠菌屬和醋酸菌屬。

3 討論

雖然酵素產(chǎn)品消費(fèi)市場(chǎng)十分火熱，在2018年12月21日中華人民共和國(guó)工業(yè)和信息化部發(fā)布了QB/T 5323-2018《植物酵素》，規(guī)定了植物酵素的產(chǎn)品分類、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則及標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸和貯存要求，然而其發(fā)酵機(jī)理和發(fā)酵工藝尚未十分明確。因此，探索酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的多樣性及其菌群的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，對(duì)于了解自然發(fā)酵酵素潛在質(zhì)量安全問(wèn)題，以及進(jìn)一步分離優(yōu)勢(shì)菌株，開(kāi)發(fā)人工可控發(fā)酵酵素，具有十分重要的理論意義和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

圖7 3 個(gè)樣品在屬水平上的真菌組成Fig.7 The fungal composition of three samples at genus

酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中，存在微生物種類多，發(fā)酵機(jī)制復(fù)雜，過(guò)程不易控制，產(chǎn)品品質(zhì)難以保證等問(wèn)題，通過(guò)宏基因組學(xué)技術(shù)可以對(duì)蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵不同時(shí)期樣品進(jìn)行微生物多樣性分析。本研究結(jié)果表明，蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物種類十分豐富，其中，細(xì)菌生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌生物多樣性。通過(guò)屬水平分析細(xì)菌和真菌的種類和豐度可知，乳桿菌屬、葡萄糖酸桿菌屬、接合酵母屬和漢遜酵母屬是發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。由此推斷蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵過(guò)程存在酵母菌發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵，以及其它發(fā)酵途徑。酵母菌能分解環(huán)境中可利用的糖產(chǎn)生酒精和二氧化碳，釀酒酵母可以抑制雜菌生長(zhǎng)[24]。乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸、酒精以及其它風(fēng)味物質(zhì)，使體系的pH 值降低，抑制了某些不耐酸菌的生長(zhǎng)。Bergillos-meca等[25]研究植物乳桿菌C4 可以在體外調(diào)節(jié)腸道微生物群，促進(jìn)一些和代謝相關(guān)的微生物種群的變化和SCFA 生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移，說(shuō)明酵素加速代謝的作用可能與植物乳桿菌相關(guān)。葡萄糖酸桿菌屬和醋酸菌屬可將中間產(chǎn)物葡萄糖酸和酒精轉(zhuǎn)化為醋酸以及其它風(fēng)味成分。此外，明串珠菌屬和魏斯氏屬可產(chǎn)生乙醇、乙酸、甘露醇等物質(zhì)，對(duì)酵素的風(fēng)味有一定影響[24]。由于發(fā)酵過(guò)程中，不同發(fā)酵階段微生物的種類和數(shù)量也發(fā)生變化，各種生化反應(yīng)和微生物間相互作用，賦予了蘋(píng)果酵素獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

綜上所述，蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵過(guò)程中存在著菌種的動(dòng)態(tài)變化，菌株之間的相互作用機(jī)理及某些菌株在不同時(shí)期發(fā)揮的作用和作用機(jī)制有待探索發(fā)現(xiàn)。本研究通過(guò)宏基因組學(xué)技術(shù)，分析蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的種類、豐度和動(dòng)態(tài)變化，探明了蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌株，為進(jìn)一步篩選獲得蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌株，研制高效直投式發(fā)酵劑，實(shí)現(xiàn)人工控制發(fā)酵蘋(píng)果酵素系列新產(chǎn)品，提高蘋(píng)果酵素產(chǎn)品生產(chǎn)效率與質(zhì)量安全水平，推動(dòng)蘋(píng)果深加工產(chǎn)業(yè)技術(shù)進(jìn)步與產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了理論依據(jù)。