張皓迪 王 雙 李 虹 馮麒鳳 陳小川 黎學(xué)練 雷登華 羅 莉

(1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室,重慶 400715;2.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,重慶 400000;3.重慶市開州區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站,重慶 405400)

大鯢(Andrias davidianus)俗稱“娃娃魚”,隸屬兩棲綱(Amphibia)、有尾目(Urodela)、隱鰓鯢科(Cryptobranchidae)、大鯢屬(Andrias)[1]。大鯢肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富,具有極高的食用和藥用價值。在大鯢的人工育種和養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)成熟的背景下[2],其主要飼喂方式依然是鮮活餌料(魚塊、小型水生昆蟲、鮮活小雜魚蝦、小型貝類等)[3—5],鮮活餌料經(jīng)濟(jì)成本較高、易攜帶病菌,運輸儲存困難,飼喂步驟復(fù)雜[6,7]。此外,目前市場上沒有大鯢配合飼料流通,其飼料研發(fā)也處于滯后狀態(tài)?；诖?本課題組結(jié)合大鯢餌料的誘食性、口徑等要求,評定了大鯢相關(guān)營養(yǎng)需求參數(shù),通過設(shè)計大鯢蛋白質(zhì)需求對比試驗,得出了大鯢人工配合飼料的最適蛋白質(zhì)干基含量(55.7%)[8],并配制出相應(yīng)的大鯢人工配合飼料。本試驗則通過比較人工配合飼料和鰱魚肉對大鯢生長、常規(guī)營養(yǎng)成分、消化和抗氧化能力的差異影響,以期為大鯢人工配合飼料的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗用鮮活餌料為鰱,購自重慶北碚天生農(nóng)貿(mào)市場,用絞肉機粉碎后投喂。人工配合飼料以魚粉、肉粉、血球蛋白粉、酪蛋白和明膠為蛋白源,大豆油為脂肪源設(shè)計而成,試驗飼料配方及基本營養(yǎng)組成見表1,飼料原料均過40目篩,混合機混勻,擠壓制成直徑2.0 mm左右的飼料,風(fēng)干分裝,-20°C保存?zhèn)溆?每次投喂前30min取出解凍。

表1 試驗飼料配方及主要營養(yǎng)物質(zhì)(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Diet feed formula and major nutrients(air-dry basis,%)

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗用大鯢為陜西省漢中市綠源大鯢養(yǎng)殖場的子二代人工繁殖個體。在正式試驗前,先將大鯢經(jīng)濃度1%的食鹽溶液消毒后,在室內(nèi)的養(yǎng)魚池馴化兩周。隨機選擇體格健壯、規(guī)格一致(20.99±0.15)g的大鯢,分成2組,每組設(shè)3個重復(fù),每個重復(fù)8尾。試驗大鯢飼養(yǎng)于西南大學(xué)動物科技學(xué)院國家示范中心循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的塑料方形箱內(nèi)(規(guī)格為:70 cm×45 cm×17.5 cm,水深5 cm),水源為曝氣自來水。每天17:00投喂1次,2h后去除剩余飼料,每隔2周對試驗大鯢進(jìn)行稱重一次,然后根據(jù)試驗大鯢的增重情況調(diào)整投喂量,正式試驗時間92d。因大鯢消化食物時間較長,故連續(xù)投喂3d后停食2d。每天早晚換水一次。飼養(yǎng)期間無光照,水溫22—25℃,溶解氧＞6.0 mg/L,氨氮含量＜0.10 mg/L,亞硝酸鹽含量＜0.10 mg/L,pH在6.5—7.5。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)實驗結(jié)束,大鯢停食3d后對每個重復(fù)的重量和尾數(shù)進(jìn)行記錄,用于生長數(shù)據(jù)的統(tǒng)計;每個重復(fù)隨機選取3尾大鯢用0.01% Ms-222麻醉,測量體長、體高和體質(zhì)量;然后在冰盤中解剖,剝離腸道和肝臟,濾紙瀝干并稱重,取背部組織分離出肌肉和皮膚,將所有分離出的組織迅速轉(zhuǎn)入液氮速凍,隨后分別置于-80℃冰箱中保存。

在指標(biāo)測定前,參照謝中國等[9]的方法剪取保存?zhèn)溆玫母闻K和腸部并勻漿。按1﹕9(g/mL)加入生理鹽水,迅速轉(zhuǎn)入高速分散器勻漿(勻漿過程在冰水浴中進(jìn)行),后將勻漿液離心(4℃,4000 r/min,10min),取上清液,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測定

生長及形體指標(biāo)測定:養(yǎng)殖實驗結(jié)束后,停食3d,準(zhǔn)確稱量各組大鯢體質(zhì)量和飼料重,計算其生長指標(biāo),計算公式如下:

增重率(Weight growth rate,WGR,%)=(Wt-W0)/W0×100;

特定生長率(Specific growth rate,SGR,%/d)=100×(lnWt－lnW0)/t

尾均攝食量(Feed intake,FI,g/尾)=Wf/N

飼料系數(shù)(Feed conversion rate,FCR)=Wf/(Wt-W0);

蛋白質(zhì)沉積率(Protein retention ratio,PRR,%)=100×(Wt×BP2-W0×BP1)/(F×P);

成活率(Survival rate,SR,%)=Nt/N0×100

式中,Wt為終末均重(g);W0為起始均重(g);t為養(yǎng)殖試驗天數(shù);Wf為總攝食飼料的干重(g);N為魚尾數(shù);BP1、BP2分別為試驗魚初始體粗蛋白質(zhì)含量和終末體粗蛋白質(zhì)含量(%);F為飼料攝入量(g);P為飼料粗蛋白質(zhì)含量(%);N0為初始尾數(shù)(尾);Nt為終末尾數(shù)(尾)。

常規(guī)營養(yǎng)成分測定:試驗大鯢飼料、全鯢和肌肉的常規(guī)營養(yǎng)成分采用AOAC(1995)[10]方法檢測。其中粗蛋白質(zhì)采用蛋白質(zhì)測定儀(GB/T 6432-1994)檢測,粗脂肪采用索氏抽提儀(GB/T 6433-1994)測定,水分采用105℃恒溫烘干法(GB/T 6435-2006)測定,粗灰分采用馬弗爐(GB/T 6438-1992)550℃灼燒法測定。

肌肉蛋白質(zhì)合成能力和皮膚膠原蛋白的測定:采用王桂芹等[11]的方法測定取樣肌肉中DNA、RNA含量,并計算RNA/DNA。膠原蛋白含量通過檢測羥脯氨酸含量(GB/T 9695.23-2008)再乘以系數(shù)11.0計算而得。

組織生化指標(biāo)的測定:胃蛋白酶和H+-K+-ATP酶,腸道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性,總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒及其使用方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0分析。經(jīng)過單因素方差分析(One-way ANOVA)之后,采用Duncan’s多重比較,P＜0.05表示差異顯著。除成活率外,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 大鯢生長性能與飼料效率

人工配合飼料和鰱魚肉會顯著影響大鯢的生長性能(表2)。飼料組的大鯢WGR、SGR和PRR顯著高于魚肉組(P＜0.05),而兩個試驗組的FCR無顯著差異(P＞0.05)。各實驗組大鯢成活率均為100%。

表2 大鯢飼喂配合飼料和鰱魚肉的生長和飼料利用率Tab.2 Growth and feed utilization of giant salamander fed with formula feed and silver carp meat

2.2 大鯢常規(guī)營養(yǎng)成分

飼喂人工配合飼料的大鯢的全鯢粗灰分、皮膚膠原蛋白顯著高于魚肉組(P＜0.05),而全鯢粗脂肪、肌肉水分和肌肉粗蛋白顯著低于魚肉組(P＜0.05),兩個試驗組的全鯢水分和粗蛋白、肌肉粗脂肪則無顯著差異(P＞0.05,表3)。

表3 大鯢飼喂配合飼料和鰱魚肉的全鯢和肌肉組成Tab.3 Whole body and muscle composition of giant salamander fed with formula feed and silver carp meat(%)

2.3 大鯢消化酶活性

投喂鰱魚肉的大鯢胃蛋白酶顯著高于飼料組,而兩個試驗組的大鯢胃H+-K+-ATP酶活性和腸道的胰蛋白酶活性、脂肪酶活性和淀粉酶活性都無顯著差異(P＞0.05,表4)。

表4 大鯢飼喂配合飼料和鰱魚肉的胃腸道消化酶活性Tab.4 Gastrointestinal digestive enzymes activity of giant salamander fed with formula feed and silver carp meat

2.4 大鯢肌肉蛋白質(zhì)合成能力

飼料組的大鯢肌肉中RNA、DNA和RNA/DNA比值顯著高于魚肉組的大鯢(P＜0.05,圖1和圖2)。

圖1 大鯢飼喂配合飼料和鰱魚肉的肌肉中RNA、DNA含量Fig.1 Muscle RNA and DNA levels of giant salamander fed with formula feed and silver carp meat

2.5 大鯢肝臟和腸道抗氧化能力

飼料組的大鯢肝臟T-AOC和SOD活性顯著高于魚肉組(P＜0.05);飼料組的大鯢肝臟MDA含量則顯著低于魚肉組(P＜0.05);而2個試驗組大鯢的腸道T-AOC、SOD活性和MDA含量無顯著差異(P＞0.05,表5)。

圖2 大鯢飼喂配合飼料和鰱魚肉的肌肉中RNA/DNA比值Fig.2 Muscle RNA/DNA ratio of giant salamander fed with formula feed and silver carp meat

表5 大鯢飼喂配合飼料和鰱魚肉的抗氧化能力Tab.5 Antioxidant capacity of giant salamander fed with formula feed and silver carp meat

3 討論

3.1 配合飼料和鰱魚肉對大鯢生長性能與飼料效率的比較

研究發(fā)現(xiàn),野生大鯢主要以動物性餌料為食,幼鯢時期喜食小型無脊椎動物,如水蚯蚓(Sludge worms)、水蚤(Water fleas)、水生昆蟲幼蟲等;成鯢階段則以小魚、小蝦及貝類等為食[7]。然而長期以來,人工養(yǎng)殖大鯢均沒有相應(yīng)的配合飼料,加上大鯢視覺退化,懼光、聲,捕食方式為“守株待兔”,在生產(chǎn)上其飼喂餌料通常是鮮活和冰鮮魚肉。為解決這種困境,本課題組在嘗試多種肉食性魚類配合飼料投喂大鯢開口失敗的基礎(chǔ)上,使用4種昆蟲餌料黑水虻(Hermetia illucens)、蠅蛆(Fly maggots)、家蠶(Bombyx moris)和黃粉蟲(Tenebrio molitors))進(jìn)行飼喂試驗,發(fā)現(xiàn)大鯢尤其喜食黃粉蟲。于是我們在按照大鯢營養(yǎng)需求配制的人工配合飼料中加入適量黃粉蟲及其他誘食性氨基酸組成復(fù)合蛋白粉誘導(dǎo)大鯢攝食。在本試驗中投喂飼料的大鯢WGR、SGR和PER顯著高于投喂鰱魚肉的大鯢,且飼料組增重率較魚肉組提高了53.5%,說明人工配合飼料符合大鯢幼體快速生長的營養(yǎng)需求,可大幅度提升大鯢的蛋白質(zhì)沉積。該結(jié)果與大口黑鱸(Micropterus salmoides)[12]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[13]、鱖(Siniperca chuatsi♀×Siniperca scherzeri♂)[14]等養(yǎng)殖肉食性魚類的研究結(jié)果存在差異。這可能與魚的不同種類有關(guān),分析其他原因還有:(1)相比鰱魚肉,人工配合飼料顆粒小、水分含量低、大鯢幼體需要攝入更多干物質(zhì)基礎(chǔ)的人工配合飼料才有飽感;(2)攝食人工配合飼料的大鯢幼體抗氧化能力較好,進(jìn)而體質(zhì)好,攝食量更高。此外,兩個實驗組的FCR無顯著差異,且FCR低于一般養(yǎng)殖魚類(表2),這可能與大鯢喜靜不喜動,活動水平低,攝食餌料中大部分能量用于生長消耗相關(guān),也說明人工配合飼料可以達(dá)到鮮活鰱魚肉相同的餌料轉(zhuǎn)化水平。

3.2 配合飼料和鰱魚肉對大鯢營養(yǎng)組成的比較

養(yǎng)殖魚類的品質(zhì)與其飼料的營養(yǎng)組成有著密切的關(guān)系,高蛋白質(zhì)低脂肪含量魚類的肉質(zhì)和營養(yǎng)價值更高[15,16]。在本試驗中投喂飼料的大鯢全鯢粗脂肪顯著低于投喂鰱魚肉的大鯢,這可能是因為飼料中含有多種礦物質(zhì)元素,有利于大鯢生長過程中的脂肪消耗,達(dá)到降脂的效果。此外,飼料組的全鯢粗灰分顯著高于魚肉組,說明攝食人工配合飼料的大鯢含有較多的礦物質(zhì)及微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)。本實驗還發(fā)現(xiàn),魚肉組的大鯢肌肉中的水分和粗蛋白含量顯著高于飼料組,而粗脂肪含量無顯著差異,與稀有逗鯽(Gobiocypris rarus)[17]、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[18]研究結(jié)果相似。該結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是一方面鰱魚肉水分含量高,促進(jìn)大鯢攝取較多的水分,另一方面鮮活餌料可能直接為大鯢提供有助于消化餌料中脂肪和蛋白的未知酶及腸道有益微生物[19]。綜合來看,人工配合飼料能有效改善大鯢的肉體品質(zhì)。

人工養(yǎng)殖大鯢皮中的膠原蛋白占鯢皮干質(zhì)量的60.66%,這些膠原蛋白可能具有一些陸生動物膠原蛋白沒有的特殊功能[20]。而且研究表明大鯢皮中的活性膠原蛋白COLLAGEN具有嫩白容顏、祛皺等美容功效[21]。本實驗發(fā)現(xiàn),飼料組的大鯢皮膚膠原蛋白含量高于魚肉組,可能是因為飼料蛋白水平高且富含大量作為膠原蛋白水解產(chǎn)物的明膠,提供較多的脯氨酸和賴氨酸。此外,人工配合飼料營養(yǎng)組成完全,含有許多與維生素C類似的輔助因子,促進(jìn)機體羥基化反應(yīng),使脯氨酸和賴氨酸轉(zhuǎn)化為構(gòu)成膠原蛋白的羥脯氨酸和羥賴氨酸,從而促進(jìn)大鯢皮膚膠原蛋白的生成[22]。

3.3 配合飼料和鰱魚肉對大鯢消化能力的比較

有胃魚對食物的消化過程分為胃部的蛋白質(zhì)變性和胃蛋白酶作用,之后腸道內(nèi)胰蛋白酶等為酶原激活并進(jìn)行消化,包括對蛋白質(zhì)、肽、糖、脂肪等的消化與吸收,整個過程主要依靠胃腸道消化酶催化作用進(jìn)行化學(xué)性消化,而消化酶活性會受魚類食性和食物組成成分的影響[23]。本實驗發(fā)現(xiàn),飼料的蛋白水平高于鰱魚肉(表1),但魚肉組的大鯢胃蛋白酶顯著高于飼料組。分析這可能與大鯢攝食人工配合飼料和魚肉在胃部的消化行為存在差異性有關(guān),包括鮮活餌料可以通過自溶或作為酶原來激活魚體內(nèi)源性消化酶,或者通過含有腸道神經(jīng)肽或營養(yǎng)“生長”因子促進(jìn)魚類消化,而人工配合飼料缺乏這類物質(zhì)并含有少量抗?fàn)I養(yǎng)因子,在一定程度上影響胃蛋白酶的分泌[24,25]。本實驗還發(fā)現(xiàn),投喂飼料和鰱魚肉的大鯢的腸道消化酶活性無顯著差異,說明飼喂人工配合飼料和鰱魚肉的大鯢腸道分解蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的酶活性相當(dāng),反映了人工配合飼料對類似鰱魚肉鮮活餌料的可替代性。此外,2個試驗組的淀粉酶活性都較一般養(yǎng)殖魚類低,這可能與大鯢作為肉食性兩棲動物,消化道較短,對淀粉等碳水化合物的利用能力較弱有關(guān)。

3.4 配合飼料和鰱魚肉對大鯢蛋白質(zhì)合成能力的比較

魚類生長的實質(zhì)是體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,表觀上是魚體積和體重的增加,內(nèi)在表現(xiàn)是組織體積的增加、細(xì)胞數(shù)量的增多以及物質(zhì)和能量的積累。相關(guān)研究表明,肌肉中DNA含量反映細(xì)胞的有絲分裂速率,RNA含量反映蛋白質(zhì)合成速率,而RNA/DNA比值則與細(xì)胞效率,即單個細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的速率成正相關(guān),其在水產(chǎn)動物中作為短期內(nèi)反映機體代謝活動的生長指標(biāo)[26,27]。Buckley[28]對大西洋鱈的研究中發(fā)現(xiàn)肌肉RNA/DNA比值與餌料營養(yǎng)水平和生長速率有高度的正相關(guān)關(guān)系。本實驗結(jié)果顯示飼料組的大鯢DNA、RNA、RNA/DNA比值顯著高于魚肉組,說明人工配合飼料可以加快肌肉細(xì)胞分裂速率,提高肌肉蛋白質(zhì)合成能力,明顯提升大鯢生長性能。

3.5 配合飼料和鰱魚肉對大鯢抗氧化能力的比較

由于正常的細(xì)胞功能,魚體內(nèi)會不斷產(chǎn)生自由基和活性氧,而T-AOC體現(xiàn)了酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對抗這些自由基的抗氧化防御能力,SOD作為其中主要的抗氧化酶之一,可以將超氧自由基分解為分子氧和過氧化氫。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物,其含量高低可以反映機體細(xì)胞受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度[29]。在本實驗中,2種餌料對大鯢肝臟抗氧化效果有顯著差異,對腸道的抗氧化效果差異不顯著,這可能是由于肝臟是魚體的主要抗氧化場所,具體原因還有待進(jìn)一步探究。本實驗還發(fā)現(xiàn)飼料組的SOD和T-AOC活性顯著高于魚肉組,而MDA含量則相反,說明投喂人工配合飼料的大鯢肝臟抗氧化酶活性升高,機體清除自由基的能力增強,投喂鰱魚肉的大鯢可能因為鰱魚肉中脂肪氧化腐敗或肝臟脂肪代謝發(fā)生障礙,使大鯢肝臟抗氧化酶活性降低,MDA含量增加。

4 結(jié)論

綜上所述,在本實驗條件下,大鯢可主動攝食人工配合飼料,而且從大鯢的生長性能、常規(guī)營養(yǎng)成分、消化酶活性和抗氧化能力等方面綜合考慮,人工配合飼料可以替代新鮮餌料成為大鯢的主要餌料。