鮑方劍 黃 雷 陳 偉 王思鵬 陳 琛 黃曉林 張德民 張化俊

(1.寧波大學海洋學院,寧波 315211;2.浙江省海洋水產養(yǎng)殖研究所,溫州 325005)

隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)高速發(fā)展,高密度集約化的養(yǎng)殖模式逐漸成為當前市場的主流趨勢。為了維持高密度對蝦養(yǎng)殖生產系統(tǒng)中的水質而進行的大面積水體交換,極易向養(yǎng)殖體系中引入病原導致對蝦患病[1,2]。因此,對蝦高密度養(yǎng)殖體系中亟需一種能有效管控水體水質,減少外界環(huán)境水體輸入的技術策略。生物絮團技術(Biofloc Technology)是一項環(huán)境友好型的水產養(yǎng)殖新技術,該技術通過向水體中輸入額外的碳源,促進異養(yǎng)細菌、硝化菌、真菌、藻類和原生動物等的生長和聚集,通過代謝活動進行有效的水質管控。同時,這些異養(yǎng)微生物及其分泌物,可依附于綠藻、絲狀真菌等[3],在恒定的曝氣、攪拌及外源碳輸入條件下,在水體中保持高度懸浮狀態(tài),進一步形成生物絮團[4],提高水體中氮的吸收與轉化[5]。

生物絮團可以降低水體中過剩的營養(yǎng)物質,有機物以及病原體,從而最大限度地減少養(yǎng)殖污水進入外圍水域環(huán)境,實現(xiàn)更高的經濟和環(huán)境效益。此外,生物絮團可作為凡納濱對蝦的日糧[6],絮團中的多種微生物以聚合的形式為對蝦提供蛋白質、脂類、氨基酸和脂肪酸等營養(yǎng)物質,并促進對蝦的免疫因子的表達[7],從而提高對蝦的成活率[8]。同時,生物絮團可以抑制哈維氏弧菌的群體感應能力[9],從而降低其對對蝦的致病風險。生物絮團對水質也具有顯著的調控效果,研究發(fā)現(xiàn)水體輸入碳源可以顯著降低其亞硝酸鹽、氨氮、硝酸鹽和化學需氧量水平[10];而且,輸入不同組分的碳源也會影響絮團形成的種類,進而影響絮團對水質的凈化效率[11]。同時,對生物絮團濃度的管控可以顯著提高對蝦的生長速度,飼料轉換率和總生物量的產量[12]。當前,生物絮團技術已經展示出在水產養(yǎng)殖領域的重要應用潛力,但是對其形成的真核微生物過程及與水體真核微生物的互作特征研究仍然較為匱乏?；诖?本文研究在外源碳氮輸入條件下,對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)生物絮團形成過程中的水體真核微生物與絮團真核微生物的組成及群落結構,揭示在該養(yǎng)殖模式下養(yǎng)殖系統(tǒng)中微生物之間的相互作用,從而明確碳源輸入對生物絮團形成的影響機制,為外源碳氮輸入促進生物絮團形成提供理論支持和應用基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗設計及樣品采集

本研究在浙江溫州的浙江水產養(yǎng)殖研究所永興基地(120°50′24″E,27°51′36″N)進行。實驗時,在600 L的小型對蝦養(yǎng)殖生態(tài)實驗體系中輸入400 L的消毒海水,養(yǎng)殖系統(tǒng)配備增氧、排換水裝置。實驗飼料購于浙江省澳華飼料有限公司,粗蛋白含量為42%,碳、氮元素比值約為6。碳源為白色粉末狀蔗糖,純度為99%。設置三組實驗,通過調節(jié)蔗糖添加量維持輸入物的C/N比分別為10(CN10)和15(CN15);對照組不添加蔗糖即初始C/N為6(CK);每組設置6個重復。在每個實驗體系中投放210尾(500尾/m3)凡納濱對蝦,使用相同的日常管理措施進行對蝦養(yǎng)殖。

在第0、第11和第28天采集水體微生物;在形成穩(wěn)定的生物絮團后(第28天),采生物絮團,分析其真核微生物群落組成。

水體微生物每個實驗桶采2 L水樣,混勻。先用100 μm紗絹預過濾,再經0.2 μm的聚碳酸酯膜(Millipore)過濾,收集微生物,置-20 ℃保存,用干冰運送回實驗室-80℃保存。利用Power Soil?DNA 提取試劑盒(MOBIO)試劑盒提取總DNA,用NanoDrop ND1000 核酸測(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)定儀測定 DNA 濃度和純度,并進行后續(xù)測序分析。

絮團微生物每個實驗桶采集2 L水樣,利用100 μm紗絹過濾,收集紗絹上生物絮團過濾物,放入滅菌的1.5 mL EP管中,置-80℃保存。用Qiagen公司的DNA提取試劑盒提DNA,用 NanoDrop ND1000 核酸測定儀測定 DNA 濃度和純度,并進行后續(xù)測序分析。

1.2 水體理化指標測定

使用YSIQS600便攜式水質檢測儀(YSI,USA)每日測定各實驗體系的溫度、pH、溶解氧和鹽度。銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、活性磷、葉綠素a和化學需氧量的分析方法均參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378-2007)和《海洋調查規(guī)范》(GB 12763-2007)的標準規(guī)范進行測定。

1.3 MiSeq測序及數(shù)據(jù)處理

針對真核微生物18S rRNA基因的V4可變區(qū),利用引物3NDF:5′-GGCAAGTCTGGTGC CAG-3′和V4eukR2R:5′-ACGGTATCTRATCRTCTTCG-3′[13]進行擴增。采用20 μL PCR反應系統(tǒng),擴增條件為:95℃預變性3min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共27個循環(huán);72℃延伸10min,每個反應3個平行。擴增產物經TaKaRa 的純化試劑盒(Takara Purification Kit,TaKaRa,Japan)純化后,將三個PCR產物混合并通過Quant-It Pico Green試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)定量。將樣品PCR產物以等摩爾量混合,利用TruSeq DNA樣品制備試劑盒(San Diego,CA,USA)構建文庫,送于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Illumina MiSeq測序。

通過QIIME v.1.9.0平臺(Quantitative insights into microbial ecology,http://qiime.org/)對下機測序數(shù)據(jù)進行樣品分裝、去嵌合體和質量篩選[14];利用SILVA 132數(shù)據(jù)庫將相似性大于97%的序列歸為同一個分類操作單元(OTU),以每個OTU中豐度最高的作為代表序列,在SILVA132數(shù)據(jù)庫中比對確定其所屬類群;去除未鑒定序列,保留后生動物(Metazoa)的OTU,得到的樣本的序列數(shù)為7028—64041。

1.4 統(tǒng)計分析

將每個樣品中的序列標準化為最小測序深度7020。在門水平(相對豐度大于 0.1%)分析每個樣品的群落組成。通過Bray-Curtis距離測量β-多樣性,并通過非度量多維尺度分析(NMDS)展示輸入碳源情況下真核微生物的演替規(guī)律?；贐ray-Curtis距離的相似性分析(ANOSIM)分析各組真核微生物群落的相似性。應用冗余分析(RDA)和Mantel分析來評估環(huán)境因素對群落變異的貢獻度。使用SPSS計算40種最豐富的OTU和環(huán)境因子的Spearman相關性,篩選得到相關性系數(shù)ρ值大于0.6的OTUs,并通過R中的“pheatmap”包繪制熱圖[15]。基于Bray-Curtis距離對水體和絮團樣品進行平均聚類并繪制聚類樹,使用 “stats”包[16]和“ggplot2”[17]包進行計算繪圖。利用R包的“psych”包[18]計算水體與絮團微生物群落間相互作用相關性系數(shù),對水體和絮團中浮游真核微生物豐度大于0.1%的OTU進行相關性分析。篩選得到相關性系數(shù)ρ值大于0.6,顯著性P值小于0.05的相關性OTUs,用“gephi”[19]繪制無向性微生物互作網(wǎng)絡圖,并進行加權隨機模塊化網(wǎng)絡分析。

2 結果

2.1 水體真核微生物群落組成

水體真核微生物在不同組別中存在顯著差異(圖1)。第0天,水體中主要門類為不等鞭毛類(Heterokonta,55.4%)、纖毛蟲(Ciliophora,32.5%)、眼蟲門(Euglenozoa,6.1%)和綠藻門(Chlorophyta,4.7%)。第11天時,CK組中綠藻門相對豐度高達47.7%,較第0天提高了近10倍;而不等鞭毛類的相對豐度則降低到2%;而CN10組綠藻門比例相比第0天水體有升高,與CK組水體相對豐度接近;同時,檢測到之前未出現(xiàn)的脊索動物(Chordata),平均相對豐度為26.3%;CN15組的綠藻門低于CK組,相對豐度為僅為6.0%;三個實驗中的不等鞭毛類相對豐度接近,均為2.1%。第28天,CK組的綠藻門較第11天的相對豐度有顯著升高,達到了80.4%;同時首次檢測到輪蟲門(Rotifera),平均相對豐度為11.3%。CN10組中綠藻門比例比CK組低4倍;輪蟲門的相對豐度為CK組的兩倍;腹毛動物門(Gastrotricha)比例增長為12.8%;CN15組中綠藻門相對豐度為40.8%,為相對豐度最高的類群;輪蟲門的相對豐度為35.8%。

圖1 養(yǎng)殖系統(tǒng)中真核微生物群落組成(門水平,相對豐度大于 0.1%)Fig.1 Microeukaryotic community compositions in aquaculture system at phylum level(relative abundance of ＞0.1%)

2.2 水體真核微生物群落結構演替及影響因素

NMDS分析(圖2)發(fā)現(xiàn),在第11天,三個處理組的水體真核微生物群落具有差異,其中CK與CN15組差異顯著(表1);第28天時,CK組與CN15組沿NMDS2軸分離;ANOSIM分析發(fā)現(xiàn)(表1),CK與CN15有顯著差異。

RDA分析(圖3A—C)及Mantel分析(表2)發(fā)現(xiàn),28d時,溶氧、亞硝態(tài)氮、活性磷與蔗糖輸入對真核微生物群落結構變異有顯著影響。在微生物群落組成方面,真核微生物群落受到DO(P＜0.05)的影響最為顯著,OTU5193(綠藻門,ρ=0.77)、OTU1634(輪蟲,ρ=0.78)和OTU6373(綠藻門,ρ=0.93)的相對豐度受DO影響最為顯著;輸入碳源與OTU1634(輪蟲,ρ=0.80)、OTU3672(輪蟲,ρ=0.75)、OTU131(纖毛蟲,ρ=0.73)和OTU7049(網(wǎng)黏菌綱Labyrinthulomycetes,ρ=0.74)的相對豐度正相關,與OTU6373(綠藻門,ρ=-0.70)的相對豐度負相關。

2.3 絮團真核微生物群落結構

在第28天時,絮團中各組的優(yōu)勢真核微生物類群均為綠藻門(圖4A),平均占比91.4%。NMDS分析發(fā)現(xiàn)CN10組與CN15組沿NMDS1軸分離(圖4B)?；贐ray-Curtis 距離的聚類分析(圖4C)發(fā)現(xiàn),來源于水體和絮團的微生物群落可顯著聚為兩類;同時,經ANOSIM分析發(fā)現(xiàn)絮團和水體真核微生物群落差異顯著(表3)。

2.4 水體與絮團真核微生物群落互作特征

微生物互作的Co-occurance網(wǎng)絡是由955個邊連接的198個節(jié)點組成的非隨機網(wǎng)絡(SES=3.7447),其中有173個邊是水體真核微生物與絮團真核微生物的相互作用。綠藻有62個節(jié)點(絮團27個,水體35個),水體與絮團相互作用的邊有114條;不等鞭毛類有22個節(jié)點(絮團7個,水體15個),水體與絮團相互作用的邊有56條;輪蟲有23個節(jié)點(絮團5個,水體18個),水體與絮團相互作用的邊有28條;纖毛蟲有23個節(jié)點(絮團3個,水體20個),水體與絮團相互作用的邊有22條。

圖2 基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析真核浮游生物群落結構Fig.2 Nonmetric multidimensional scaling(NMDS)analysis of microeukaryotic community structure based on Bray-Curtis distance

互作網(wǎng)絡由5個主要模塊組成(圖5B)。模塊1(Module I)主要由輪蟲、綠藻、腹毛動物門組成,且多數(shù)OTUs在CK有更高的豐度(圖5C)。模塊2(Model II)主要為水體中的輪蟲、纖毛蟲、子囊菌門(Ascomycota)、不等鞭毛類與絮團中的輪蟲、綠藻、不等鞭毛類的相互作用,且多數(shù)OTUs主要分布在CN10與CN15組,如水體中輪蟲豐度是CK組的近8倍與12倍,且CN15組中的纖毛蟲與子囊菌門有較高豐度;在絮團中,CN10與CN15的綠藻豐度分別是CK的近3倍和2倍。模塊3(Model III)不包含絮團OTUs,主要是水體中纖毛蟲、輪蟲等的相互作用。模塊4(Model IV)與模塊5(Model V)主要為水體中的不等鞭毛類、纖毛蟲、輪蟲與絮團中的綠藻的相互作用。CK組中的綠藻與輪蟲在絮團與水體中處于相同的模塊;實驗組中綠藻與絮團中綠藻處在相同的模塊,輪蟲、纖毛蟲和線蟲(Nematoda)處在相同的模塊。

表1 相似性分析不同時間段不同處理組真核微生物群落差異Tab.1 Similarity analysis of microeukaryotic community in different treatment groups at day 11 and day 28

圖3 冗余分析真核微生物群落結構與環(huán)境因子的關系Fig.3 Redundancy analysis(RDA)of the relationship between microeukaryotic community and environmental variables

3 討論

3.1 蔗糖輸入對水體和絮團真核微生物群落組成的影響

綠藻是構成水體和絮團微生物群落的重要組成部分,在整個實驗過程中都有較高豐度,且不同組別差異較大。綠藻的豐度主要受氮磷營養(yǎng)鹽和溶解氧的影響[20],對照組的氮、磷、溶解氧含量高于實驗組,可能有利于綠藻的生長。綠藻在絮凝作用下可組成絮團骨架,有利于細菌和原生動物等的附著,從而形成生物絮團[21]。此外,綠藻可以吸收水體中的氨、磷,進而改善水質,并降低水體透明度,避免對蝦的相互殘食[22]。但當浮游藻類過度生長,易引起水體環(huán)境劇烈變化,從而導致水質惡化[23],造成養(yǎng)殖水體生態(tài)系統(tǒng)崩潰。

表2 Mantel分析環(huán)境因子與真核微生物群落的相關性Tab.2 Mantel tests analysis the correlation between environmental factors and eukaryotic microbial communities

圖4 絮團真核微生物組成及群落結構Fig.4 Microeukaryotic community composition and structure in biofloc

在第11天時,實驗組與對照組中纖毛蟲和綠藻的相對豐度有較大差異,纖毛蟲在蔗糖輸入組具有更高的豐度。研究發(fā)現(xiàn),纖毛蟲的豐度與氮和磷含量顯著負相關[24],蔗糖的輸入使微生物代謝速率加快,提高了氮磷去除效率,從而使纖毛蟲在碳源輸入組中具有較高豐度。 此外,在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中,纖毛蟲能夠刺激菌落的形成與黏附,促進其攝取營養(yǎng)物質[25];同時,纖毛蟲對于浮游植物具有攝食作用,被認為是銨(“再生氮”)的重要來源,可以滿足初級生產者對氮的需要[26]。

在第28天時,對照組中綠藻豐度較高,而碳源輸入組中輪蟲、腹毛動物門和子囊菌門具有更高的豐度。該階段,養(yǎng)殖系統(tǒng)中有機質含量增高,微生物絮團增多,為輪蟲的生長和增殖提供了有利的條件;同時,輪蟲是對蝦幼蟲的重要食物來源[27]。子囊菌門可以降解水體中較難利用的顆粒及溶解腐殖質,隨后將其作為碳源和氮源輸入到食物網(wǎng)中,并改善水質[28]?？梢?輸入蔗糖能顯著改變真核微生物群落組成,對微生物絮團的形成和養(yǎng)殖系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用。

表3 相似性分析水體與絮團真核微生物群落結構差異Tab.3 Analysis of similarity(ANOSIM)of microeukaryotic community in water and biofloc

圖5 Co-occurrance網(wǎng)絡分析絮團與水體OTUs之間的相互作用Fig.5 Co-occurrence network among OTUs in water and biofloc based on correlation analysis

3.2 蔗糖輸入條件下真核微生物群落結構變異的驅動因素

當前,針對水體與絮團微生物群落的研究主要集中在原核微生物[29],對真核微生物群落結構的研究還較為缺乏;然而,真核微生物群落結構在維持養(yǎng)殖系統(tǒng)水質以及保障對蝦正常生長發(fā)育上的作用不容忽視。在實驗過程中,對照組與CN15組的群落組成差異不斷加大,而CN10組介于二者之間,與兩個組均沒有顯著差異。海水的細菌在碳氮比大于10時會保持較高生長水平較高,然而高碳氮比條件下細菌的過度繁殖會顯著影響水質[30]和絮團的形成[31],進而影響水體和絮團的真核微生物群落結構。

冗余分析和Mantel分析發(fā)現(xiàn),水體溶氧、亞硝態(tài)氮、磷酸鹽和碳源的輸入對水體真核微生物群落演替具有顯著影響。溶氧能顯著影響浮游植物的光合作用和呼吸作用,對細菌和真核微生物群落結構具有顯著影響[32—34]。氮、磷是浮游植物生長的必需元素,是構成浮游植物細胞的重要物質基礎;磷常常作為限制性元素影響浮游植物的生長[35,36]。此外,溶氧和亞硝態(tài)氮能顯著影響綠藻和輪蟲的豐度,如輪蟲豐度常與溶氧負相關,與亞硝態(tài)氮正相關[37—39]。蔗糖輸入組中磷酸鹽含量高于對照組,這與Luis等[40]的結果類似,可能是由于微藻和其他固磷細菌的共同作用導致[41],進而抑制了綠藻的生長,降低了其在蔗糖輸入組中的比例。因此,碳氮輸入對養(yǎng)殖水體水質具有一定影響,并進而影響微生物群落結構和組成。

3.3 水體與絮團真核微生物群落互作特征

在實驗第28天時,綠藻、輪蟲、纖毛蟲與不等鞭毛類在水體與絮團具有較強的互作關系。在水體中碳氮比升高時,輪蟲和纖毛蟲在水體和絮團中的比例同時升高;而在低碳氮比組,真菌(Fungi)中的Zoopagales和壺菌門(Chytridiomycota)相互作用更加密切(圖5A)。壺菌門中的根囊壺菌目主要分布在對照組中;根囊壺菌目可寄生微藻和無脊椎動物[42],對對蝦的生長具有潛在危害作用。

在本研究中絮團中占據(jù)優(yōu)勢的原生動物為纖毛蟲,后生動物中占據(jù)優(yōu)勢的為輪蟲的單巢綱(Monogononta),這與Azim等[4]的研究結果不同,可能是由于不同水體對于絮團的微生物組成有一定的塑造作用。絮團真核微生物群落間的相互作用要強于絮團與水體真核微生物的相互作用(圖5C)。蔗糖輸入組的輪蟲在水體和絮團中與對照組均無顯著差異;但隨著碳氮比的增加,輪蟲的比例也相應升高。同時,水體與絮團中的輪蟲或具有一定的動態(tài)交換能力(圖5C),可在一定程度上彌補對方數(shù)量上不足。碳源輸入會增加不等鞭毛類在水體與絮團中的相互作用,特別是網(wǎng)黏菌綱在絮團中的比例;此外,網(wǎng)黏菌綱的作用與根囊壺菌目類似,在有機質降解中起著重要作用[43,44]。可見,在水體和絮團中有著復雜的微生物互作關系,其中絮團微生物內部互作更為密切,且碳源輸入對微生物互作具有一定的影響。

4 結論與展望

綜上,向對蝦養(yǎng)殖體系中輸入碳源,能夠改變真核微生物群落組成,提高纖毛蟲、輪蟲在水體的豐度,抑制綠藻過度生長,對微生物絮團形成和養(yǎng)殖微生物系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。增加輸入的碳氮比例會進一步影響水體和微生物的群落變化,且溶氧、亞硝態(tài)氮、活性磷對群落演替都有顯著影響,如輸入碳源可增加不等鞭毛類、纖毛蟲和輪蟲在水體和絮團中的相互作用,對養(yǎng)殖體系中藻類的過度繁具有一定的抑制作用,并提高對蝦對蛋白攝入。然而,當前研究并未就蔗糖輸入條件下的真核微生物與原核微生物之間的相互關系進行進一步研究,因而無法對碳、磷、氮的流向進行深入探討。同時,高通量測序在后生動物等多細胞生物相對豐度測定方面存在一定偏差,后續(xù)研究中會使用顯微計數(shù)的方式準確測定后生動物豐度。此外,后續(xù)研究可關注輸入蔗糖條件下的對蝦營養(yǎng)結構和免疫酶活變化,為生物絮團技術應用于凡納濱對蝦養(yǎng)殖提供理論支持和技術指導。