張晨，李燕，郭鳳英，劉子歌，宋國瑞，陳德勝

（寧夏醫(yī)科大學(xué) 1.總醫(yī)院脊柱骨科，銀川 750004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，銀川 750004）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是現(xiàn)階段治療終末期骨性關(guān)節(jié)炎的重要方法，它不僅能有效緩解關(guān)節(jié)疼痛，還能重建關(guān)節(jié)功能。由于我國老齡化人口正以比總?cè)丝谠鲩L更快的速度增加，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)也呈遞增趨勢［1］。無菌性松動導(dǎo)致的假體下沉、松動和失效是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的主要并發(fā)癥，也是人工關(guān)節(jié)翻修的最主要原因［2］。如何預(yù)防和治療假體周圍骨溶解導(dǎo)致假體無菌性松動，是目前骨科關(guān)注的熱點和難點。人工關(guān)節(jié)各部件相互摩擦產(chǎn)生的磨損顆粒進(jìn)入機體內(nèi)，通過刺激假體周圍界膜組織的巨噬細(xì)胞釋放多種炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞，引起假體周圍無菌性炎癥反應(yīng)，刺激破骨細(xì)胞增殖活化，導(dǎo)致假體周圍的骨溶解［3］。骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）構(gòu)成RANKL/RANK/OPG信號通路，對調(diào)控破骨細(xì)胞的骨溶解起重要作用［4］。RANKL/RANK/OPG信號通路的調(diào)控，可能對預(yù)防和延緩人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后無菌性松動有非常重要的意義。目前研究［5］發(fā)現(xiàn)，采用外源性O(shè)PG作用于骨質(zhì)疏松動物模型，能減少骨質(zhì)流失，表明OPG具有調(diào)控實驗性骨質(zhì)疏松骨質(zhì)流失的作用。本研究采用外源性O(shè)PG作用于磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠氣囊植骨模型，探討RANKL/RANK/OPG信號通路對人工假體周圍無菌性骨溶解的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

BALB/c小鼠由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物實驗許可證號：SCXK（京）2016-0008；磨損顆粒（美國Alfa Aesar公司）；OPG、RANKL、RANK（美國Sigma公司）；白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）試劑盒（美國Sigma公司）。

1.2 實驗分組及造模

8～10周齡雌性BALB/c小鼠45只，體質(zhì)量25～30 g，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，動物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。對小鼠進(jìn)行編號，采用隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為對照組、模型組和OPG組，每組15只。另選45只SPF級BALB/c同屬同齡雌性小鼠，做為磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解動物模型植骨的供體，每只小鼠可提供2片用于植骨的顱骨骨片，大小約0.5 cm×0.25 cm×0.1 cm。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）進(jìn)行麻醉，腹腔麻醉成功后背部消毒備皮，注射2 mL無菌空氣形成氣囊；之后連續(xù)每天向小鼠背部氣囊中注射0.5 mL無菌空氣，至第7天氣囊形成；另外隨機選同屬同齡小鼠處死，取顱骨骨片；切開氣囊，植入顱骨骨片，縫合切口。

對照組：植骨后向小鼠氣囊內(nèi)注射0.1 mL PBS，此后腹腔注射0.1 mL生理鹽水，1次/d，持續(xù)14 d。模型組：植骨后向小鼠氣囊內(nèi)注射 0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，此后腹腔注射0.1 mL生理鹽水，1次/d，持續(xù)14 d。OPG組：植骨后向小鼠氣囊內(nèi)注射0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，之后腹腔注射OPG（3 mg/kg），1次/d，持續(xù)14 d。將3組小鼠同時間處死，取出小鼠顱骨及其囊壁組織進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 HE染色觀察炎性改變

切片先后置入不同濃度二甲苯、無水乙醇以及75%乙醇浸泡，之后蒸餾水洗滌；加蘇木素染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，用0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗；置入伊紅染液染色；置入不同濃度乙醇以及二甲苯脫水透明；中性樹膠封片。

1.4 TRAP染色觀察骨溶解

TRAP對觀察、確定破骨細(xì)胞具有特異性。將小鼠顱骨及其囊壁組織經(jīng)脫鈣、切片、脫蠟后，經(jīng)過不同濃度乙醇階梯脫水，沖洗后放入丙酮溶液中固定，之后將玻片放入暗盒內(nèi)，滴加新鮮配制的TRAP染液，染液須完全覆蓋切片，37 ℃水浴鍋避光孵育1 h后沖洗、蘇木素復(fù)染，再次沖洗后晾干、封片。

1.5 ELISA法檢測氣囊植骨組織中IL-6和TNF-α的水平

每組隨機取3只小鼠處死后，取氣囊植骨組織先剪碎，再通過RIPA裂解液裂解，12 000 r/min離心15 min后收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6和TNF-α。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測氣囊植骨組織中RANKL、RANK、OPG的表達(dá)

切片在68 ℃中烤片2 h后，置入不同濃度二甲苯、無水乙醇浸泡，經(jīng)自來水、蒸餾水沖洗、3% H2O2孵育后，用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液煮沸予抗原修復(fù)，滴加羊血清于玻片封閉。分別滴加一抗（RANKL、RANK、OPG）孵育、二抗，37 ℃孵育、沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白稀釋液，37 ℃孵育，滴加DAB靜置數(shù)分鐘，置于顯微鏡下觀察顯色，適時終止。后經(jīng)蘇木素液復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，碳酸鋰返藍(lán)，不同濃度的乙醇、二甲苯浸泡，中性樹脂封片。

顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果并進(jìn)行圖像采集，每張免疫組化切片隨機選取5個表達(dá)的高倍鏡（×400）視野，確保每張圖像的位置以及背景亮度一致。將采集的圖像用Image-Pro軟件進(jìn)行分析，確定統(tǒng)一的測定標(biāo)準(zhǔn)，計算分析后得到平均光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用表示，多組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

HE染色結(jié)果顯示，對照組中未見鈦顆粒浸潤，氣囊植骨復(fù)合體周圍組織見少量的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，炎癥反應(yīng)不明顯，植骨塊骨面平滑并光整；模型組氣囊植骨復(fù)合體的囊壁增厚，周圍鈦顆粒浸潤，可有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤，炎癥反應(yīng)明顯，植骨塊表面存在侵蝕，骨面不光整，部分有缺損表現(xiàn)；OPG組亦有鈦顆粒浸潤，氣囊植骨復(fù)合體周圍氣囊組織厚度與模型組相比較薄，周圍有少量炎癥細(xì)胞，植骨骨塊表面侵蝕反應(yīng)減輕，比較平整。見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果 ×20Fig.1 HE staining ×20

2.2 TRAP染色

對照組見少量的TRAP染色陽性細(xì)胞，染色較淺，陽性染色面積??；模型組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)較多，陽性染色面較大，而且染色深；OPG組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)與模型組相比較少。見圖2、表1。

2.3 ELISA檢測小鼠氣囊組織中IL-6、TNF-α水平

與對照組比較，模型組和OPG組小鼠氣囊植骨中IL-6、TNF-α水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，OPG組小鼠顱骨骨膜中IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠氣囊組織中RANKL、RANK、OPG表達(dá)

與對照組比較，模型組和OPG組小鼠氣囊植骨組織中RANKL、RANK表達(dá)增加，而OPG表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與模型組比較，OPG組小鼠氣囊植骨組織RANKL、RANK表達(dá)減少，而OPG表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1、圖3。

3 討論

圖2 TRAP染色結(jié)果 ×20Fig.2 TRAP staining×20

表1 3組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)、IL-6和TNF-α水平及RANKL、RANK、OPG平均光度值比較Tab.1 Number of TRAP staining positive cells，IL-6 and TNF-α levels，as well as the expression of RANKL，RANK，and OPG in the three groups

圖3 3組RANKL、RANK、OPG免疫組化結(jié)果×20Fig.3 Immunohistochemistry results for RANKL，RANK，and OPG in the three groups ×20

骨性關(guān)節(jié)炎是一種包含關(guān)節(jié)軟骨損害、軟骨愈合不充分、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)進(jìn)行性惡化等特點的退行性疾病，關(guān)節(jié)超負(fù)荷和生物力學(xué)改變等多種因素引起的關(guān)節(jié)軟骨潰瘍、皸裂、纖維化，常會導(dǎo)致關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、疼痛、活動受限等表現(xiàn)，發(fā)展至終末期還會造成患者關(guān)節(jié)畸形、功能受限，給患者帶來極大的痛苦［6］。由于目前缺乏早期診斷方法，臨床診治時多處于疾病的中晚期，治療方法多以手術(shù)為主，而在多種手術(shù)方法中，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是發(fā)展時間最長、技術(shù)最為成熟的治療方法［7］。但是人工關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后，假體表面與關(guān)節(jié)磨損會產(chǎn)生磨損顆粒，刺激骨-假體的界膜組織中的巨噬細(xì)胞釋放大量溶骨性炎性細(xì)胞因子，激活破骨細(xì)胞活化，誘導(dǎo)骨溶解而導(dǎo)致無菌性松動，這是制約人工關(guān)節(jié)置換術(shù)發(fā)展的重要并發(fā)癥［8］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以信號通路為靶點的研究逐漸成為解決假體無菌性松動的突破口，在以骨代謝失衡為主的溶骨性改變過程中，RANKL/RANK/OPG信號通路被證實起重要的調(diào)控作用。

RANK是從小鼠類巨噬細(xì)胞的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中復(fù)制出的破骨細(xì)胞分化因子受體，屬于Ⅰ型三聚化的跨膜蛋白，在破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞、成熟破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等中起重要作用［9］。RANKL屬于TNF-α超家族成員Ⅱ型跨膜蛋白，其mRNA在骨骼和淋巴組織中均可以檢測到，在骨小梁、骨髓、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中高表達(dá)［10］。RANK的胞內(nèi)區(qū)域包含多個受體相關(guān)因子結(jié)合區(qū)域，可與腫瘤壞死相關(guān)因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）家族中的TRAF-1、TRAF-3、TRAF-6及白細(xì)胞介素（interleukin，IL）家族中的IL-1、IL-6、IL-15等結(jié)合，這是激活JNK、Wnt等骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)信號通路活性的關(guān)鍵步驟［11］。OPG同屬于TNF-α超家族成員，是一種分泌型糖蛋白，主要以單體形式由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生［12］。OPG是RANKL競爭性抑制因子，可與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞表面的RANK競爭性結(jié)合，以阻斷RANKL與 RANK結(jié)合，從而拮抗RANKL的促破骨細(xì)胞分化功能，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，抑制骨吸收［13］。

本研究選用鈦顆粒刺激小鼠氣囊植骨構(gòu)建磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解動物模型，病理形態(tài)學(xué)和TRAP染色結(jié)果顯示，模型組破骨細(xì)胞生成增加，骨吸收反應(yīng)增強，與對照組相比差異顯著。OGP組在將外源性O(shè)PG作用于磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠氣囊植骨模型后，磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解明顯減輕，說明OPG可能有效抑制顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成作用。免疫組化結(jié)果顯示，OPG在對照組有一定的表達(dá)，鈦顆粒刺激誘導(dǎo)骨溶解的模型組OPG表達(dá)量明顯減少，說明OPG和RANKL競爭性與RANK結(jié)合的作用減弱，使得RANKL與更多的RANK結(jié)合，增加磨損顆粒周圍組織中破骨細(xì)胞前體活化和分化，向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)骨溶解。加入外源性O(shè)PG的OPG組中OPG表達(dá)顯著增加，而RANKL表達(dá)減少，說明在OPG與RANK結(jié)合作用增強的同時，RANKL與RANK結(jié)合作用減弱，也促使破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生成減少，相應(yīng)的骨溶解作用減弱，對預(yù)防無菌性骨溶解有重要的促進(jìn)作用。

磨損顆粒刺激巨噬細(xì)胞釋放大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6等），這些炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子在信號通路的調(diào)控下被激活，作用于破骨細(xì)胞前體，使其分化和增殖，轉(zhuǎn)化為成熟的破骨細(xì)胞，誘導(dǎo)骨溶解［14］。本研究中，模型組中IL-6、TNF-α表達(dá)水平升高，說明炎癥反應(yīng)增強，而加入外源性O(shè)PG的OPG組中IL-6、TNF-α表達(dá)水平降低，說明OPG和RANKL競爭性與RANK結(jié)合作用增強后，RANKL與RANK結(jié)合作用減弱。RANKL是調(diào)節(jié)骨吸收、骨溶解的關(guān)鍵因子，與前體破骨細(xì)胞膜上的RANK受體結(jié)合減弱會降低破骨細(xì)胞活性，破骨細(xì)胞骨溶解作用減弱。加入外源性O(shè)PG除了抑制破骨細(xì)胞的溶骨作用，也相應(yīng)降低了IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的活性，減輕了炎癥反應(yīng)。

骨代謝平衡是一個很復(fù)雜的過程，RANK/RANKL/OPG是體內(nèi)維持骨代謝平衡的重要信號通路，王瑞燈等［15］通過研究OPG對腫瘤骨轉(zhuǎn)移的作用機制，發(fā)現(xiàn)IL-11、TNF-α等會通過成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞上調(diào)RANKL，抑制OPG參與溶骨性病變，同時骨微環(huán)境中釋放大量趨化因子如胰島素樣生長因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1等，使骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化異常，處于病理狀態(tài)。PHILIPPOU等［16］的機械應(yīng)力對骨骼生長影響的研究中，讓研究對象進(jìn)行適當(dāng)離心運動，6 h后發(fā)現(xiàn)血液中OPG水平升高，而RANKL水平降低，得出中等強度的運動能夠預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，而這種生理變化主要是通過RANK/RANKL/OPG信號通路實現(xiàn)的。OPG/RANKL比值的升高有助于骨細(xì)胞的成骨化，可以有效預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。最新的研究［17］還表明，骨細(xì)胞自身分泌的β干擾素是破骨細(xì)胞生成的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能夠抑制破骨細(xì)胞的形成，側(cè)面證實了OPG對預(yù)防骨溶解的發(fā)生起至關(guān)重要的作用。

綜上所述，加入外源性O(shè)PG作用于磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解后，可能使RANKL/RANK/OPG信號通路對破骨細(xì)胞骨溶解作用下調(diào)，本研究結(jié)果為假體周圍骨溶解的防治提供一種可能的理論依據(jù)，為延緩和阻止假體周圍無菌性松動尋找可靠的靶點。