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        大黃?蟲(chóng)丸對(duì)TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞增殖的影響

        2021-01-30 09:44:54蔣鋒利任士杰孫文麗趙明鏡張立山
        吉林中醫(yī)藥 2021年1期
        關(guān)鍵詞:增殖率含藥肺纖維化

        蔣鋒利,蔡 松,任士杰,孫文麗,張 晶,趙明鏡,張立山

        (北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院呼吸科,北京 100029)

        關(guān)鍵字:肺絡(luò)干血;IPF;含藥血清;EMT;cck-8

        特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種病因不明、慢性進(jìn)展、致死性間質(zhì)性肺疾病,以肺組織中存在“成纖維細(xì)胞灶”為特征,它是由成纖維細(xì)胞在內(nèi)的間充質(zhì)細(xì)胞聚集體和能表達(dá)a-SMA,并能促進(jìn)有絲分裂及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌增加的肌成纖維細(xì)胞構(gòu)成[1]。該病隸屬于中醫(yī)“肺痿”“肺痹”范疇,病性為本虛標(biāo)實(shí)。武維屏、姜良鐸為代表的肺病專家提出“肺系絡(luò)病”理論,將本病病機(jī)概括為“氣虛血瘀、痰熱互結(jié)、痹阻肺絡(luò)”[2-3]?;谝陨险J(rèn)識(shí),本課題組提出“特發(fā)性肺纖維化患者存在肺絡(luò)干血”的假說(shuō),認(rèn)為“肺絡(luò)干血是肺纖維化病因,細(xì)胞外基質(zhì)沉積是干血實(shí)質(zhì)”[4]。針對(duì)“干血”一證,張仲景治以“緩中補(bǔ)虛”之大黃?蟲(chóng)丸,尤在涇將本方治法概括為“潤(rùn)以濡其干,蟲(chóng)以動(dòng)其瘀,通以去其閉”,此實(shí)為仲景治療“干血”的三大法門。研究[5]證實(shí)大黃?蟲(chóng)丸對(duì)博來(lái)霉素致特發(fā)性肺纖維化大鼠的保護(hù)作用可能通過(guò)抑制MMP-2 的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)選擇吡非尼酮作為陽(yáng)性對(duì)照藥,通過(guò)制備不同濃度大黃?蟲(chóng)丸含藥血清,對(duì)獲取的TGF-β1干預(yù)48h 后A549 細(xì)胞進(jìn)行Masson 染色,使用cck-8 法觀察24 h、48 h、72 h大黃?蟲(chóng)丸含藥血清對(duì)TGF-β1干預(yù)后的A549 細(xì)胞增殖情況的影響,探索大黃?蟲(chóng)丸對(duì)IPF 防治作用的更多內(nèi)在機(jī)制,進(jìn)一步豐富捜剔肺絡(luò)法防治特發(fā)性肺纖維化的學(xué)術(shù)內(nèi)涵。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物與細(xì)胞健康SD 雄性大鼠60 只,體質(zhì)量250~300 g。由北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,SPF/VAF 級(jí),許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。人肺泡上皮A549 細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù),北京)。

        1.2 藥物及試劑大黃?蟲(chóng)丸(國(guó)藥準(zhǔn)字:Z11020002,批號(hào):17013170),購(gòu)自北京同仁堂;吡非尼酮膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字:H20133376,批號(hào):190505),購(gòu)自北京康蒂尼藥業(yè)。均在常溫干燥處保存。DMEM/F-12培養(yǎng)基(Biological Industries),F(xiàn)BS(Biological Industries),重組人TGF-β1(PeproTech),0.25%Trypsin EDTA(Biological Industries),PBS(Biological Industries),青-鏈霉素(Caisson Labs),cck-8(北京北仁化學(xué)),戊巴比妥鈉(中國(guó)醫(yī)藥北京公司)。

        1.3 主要儀器超凈工作臺(tái)FLC-3型(哈爾濱市東聯(lián)),二氧化碳培養(yǎng)箱MC0175 型(日本SANYO),離心機(jī)5417R 型(德國(guó)Eppendorf),倒置顯微鏡CKX41 型(日本OLYMPUS),全景掃描儀Pannoramic MIDI 型(匈牙利3D HISTECH),酶標(biāo)儀352 型(芬蘭Thermo Multiskan MS)。

        1.4 方法

        1.4.1 大黃?蟲(chóng)丸含藥血清的制備及保存 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后,參考盧磊[6]等人方法,按人與動(dòng)物等效劑量換算法,分別算得大黃?蟲(chóng)丸高、中、低及吡非尼酮給藥劑量為1.8、0.9、0.4 5、0.18 mg·kg-1·d-1,以上劑量分別各給10 只SD 大鼠灌服,每日1 次,持續(xù)7 d。末次給藥1 h 后,3%戊巴比妥鈉(0.15 mL·100 g-1)腹腔內(nèi)麻醉,無(wú)菌條件腹主動(dòng)脈取血,冰上靜置2 h,4℃,3 000 r·min-1離心15 min 取上清,分裝并標(biāo)記,56℃滅活30 min,-80 ℃快速凍固保存,待用。剩余20 只SD 大鼠灌以等量等滲鹽水,以同樣方法制備空白血清并保存,待用。

        1.4.2 IPF 細(xì)胞模型的建立 參照Kasai H 等的方法復(fù)制特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞模型[7]。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(K 組)、模型組(M 組)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104·mL-1,每孔2 mL接種于12 孔板,2 組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,邊緣孔用無(wú)菌PBS 填充,37 ℃、5%CO2條件下,培養(yǎng)24 h,換用無(wú)血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,換液,K 組每孔加入2 mL 培養(yǎng)基,M 組每孔加入2 mL 含TGF-β1(5 ng·mL-1)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡下拍照,見(jiàn)圖1。

        1.4.3 Masson 染色 重復(fù)1.4.2 中分組及實(shí)驗(yàn)過(guò)程,獲取TGF-β1(5 ng·mL-1)干預(yù)48 h 后A549 細(xì)胞。0.01 mol·L-1無(wú)菌PBS 將K 組、M 組分別洗板3 次×2 min,4%的多聚甲醛室溫固定15 min,0.01 mol·L-1無(wú)菌PBS 將K 組、M 組分別洗板3 次×2 min,常規(guī)Masson 染色后,全景掃描儀記錄圖像,見(jiàn)圖2。

        1.4.4 實(shí)驗(yàn)分組及cck8 法觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況 選擇吡非尼酮作為陽(yáng)性對(duì)照藥。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(K組)、模型組(M 組)、西藥組(P 組)、模型+大黃?蟲(chóng)丸含藥血清大劑量組(D 組)、模型+大黃?蟲(chóng)丸含藥血清中劑量組(Z 組)、模型+大黃?蟲(chóng)丸含藥血清小劑量組(X組)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104·mL-1,每孔100 uL 接種于96 孔板,各組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,邊緣孔用0.01 mol·L-1無(wú)菌PBS 填充,37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h 后,換用無(wú)血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,加入100 uL 對(duì)應(yīng)的10%含藥血清及含5 ng·mL-1的TGF-β1培養(yǎng)基。分別于24 h、48 h、72 h 后,盡量吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,統(tǒng)一加入含10% cck-8無(wú)血清培養(yǎng)基100 uL,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h,酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)并記錄OD 值,計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組增殖率,過(guò)程需注意避光。增殖率(%)=(給藥組-空白組)OD 值/空白組OD 值×100%。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析,滿足正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),兩兩比較采用LSD,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞模型的鑒定倒置顯微鏡下,M 組A549 細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo),形態(tài)逐漸由鵝卵石狀變?yōu)樯扉L(zhǎng)的紡錘形或梭形,細(xì)胞圓形度降低,與成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞形態(tài)相似。圖1 為TGF-β1干預(yù)A549 細(xì)胞48 h 細(xì)胞形態(tài)。Masson 三色染色法是膠原纖維染色經(jīng)典而又權(quán)威的技術(shù)方法。該法染色原理與陰離子燃料分子的大小和組織的滲透有關(guān),小分子量易穿透結(jié)構(gòu)致密、滲透性低的組織;而大分子量則只能進(jìn)入結(jié)構(gòu)疏松、滲透性高的組織。因此Masson染色后肌纖維呈紅色,膠原纖維呈綠色或藍(lán)色,胞核呈藍(lán)褐色。圖2 為TGF-β1干預(yù)A549 細(xì)胞48 h 后Masson 染色結(jié)果,結(jié)合圖1 說(shuō)明發(fā)生EMT,即特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞模型成功。

        圖1 TGF-β1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞48 h(白光片,×400)

        圖2 TGF-β1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞48 h 后Masson 染色(全景掃描儀,×400)

        2.2 大黃?蟲(chóng)丸含藥血清對(duì)TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖率影響見(jiàn)表1。

        表1 大黃?蟲(chóng)丸含藥血清對(duì)TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖率影響(,n=6) %

        表1 大黃?蟲(chóng)丸含藥血清對(duì)TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖率影響(,n=6) %

        注:與K 組比較,正值為促進(jìn)作用,負(fù)值為抑制作用

        2.3 大黃?蟲(chóng)丸含藥血清對(duì)TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖OD 值影響見(jiàn)表2。

        表2 大黃?蟲(chóng)丸含藥血清對(duì)TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖OD 值影響(,n=6)

        表2 大黃?蟲(chóng)丸含藥血清對(duì)TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖OD 值影響(,n=6)

        注:與P 組比較,# P<0.05,## P<0.01;與K 組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與M 組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01

        3 討論

        如表1、表2 中所示結(jié)果,24 h 時(shí),K 組所得OD值最高,且與其他各組比較均有顯著性差異(P<0.01),可能與經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后A549 細(xì)胞發(fā)生EMT,部分肺腺癌細(xì)胞變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞后,增殖能力降低有關(guān);各組所得增殖率依次為Z 組、X 組、M 組、D 組、P 組,各組對(duì)比有差異,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.05),提示TGF-β1干預(yù)24 h 后A549 細(xì)胞未發(fā)生EMT,可認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化發(fā)病早期。48 h 時(shí),K 組所得OD值均高于其他各組,且與之相比均有顯著性差異(P<0.01);各組所得增殖率依次為M組、Z組、X組、P組、D 組,與M 組相比,除Z 組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其他各組均有顯著性差異,提示TGF-β1干預(yù)48 h 后A549 細(xì)胞部分發(fā)生EMT[8],可認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化發(fā)病中期,各藥物組對(duì)該期特發(fā)性肺纖維化保護(hù)作用較早期明顯。72 h 時(shí),K 組所得OD 值仍最高,但與M 組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能與A549 細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)快,培養(yǎng)基消耗太多,影響其增殖有關(guān);各組所得增殖率依次為M組、D 組、Z 組、P 組、X 組,與M 組相比,X 組、P組有顯著性差異,提示TGF-β1干預(yù)72 h 后的A549 細(xì)胞已全部發(fā)生EMT,可認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化發(fā)病晚期,各藥物組對(duì)本期特發(fā)性肺纖維化保護(hù)作用最明顯,且以X 組最優(yōu)。

        24 h 時(shí),K 組與其他組比較均有顯著性差異,且48 h、72 h 時(shí),P 組、D 組、Z 組及X 組對(duì)TGF-β1干預(yù)后A549 細(xì)胞增殖率均不同程度高于M 組。提示各實(shí)驗(yàn)組不僅不同程度阻斷或逆轉(zhuǎn)了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT,對(duì)A549 細(xì)胞也具有一定殺傷作用,即吡非尼酮與大黃?蟲(chóng)丸亦具有不同程度的抗腫瘤效用[9-10],亦從實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證了中醫(yī)“一方多病”的科學(xué)[11-12]。原文方后注曰“上十二味,煉蜜和丸小豆大,酒飲服五丸,日三服”[13]。在本實(shí)驗(yàn)中,為方便對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃,由“丸”改“湯”,亦未用酒,得到大黃?蟲(chóng)丸抗纖維化作用以中小劑量使用為佳的結(jié)果。臨床應(yīng)用本方時(shí),用量選擇上自不能以此作為主要依據(jù),仍需臨證綜合考量。

        EMT 在多種病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,它可能是致病間充質(zhì)細(xì)胞主要來(lái)源[14]。TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及ECM形成等生物活性[15-16],被認(rèn)為是誘導(dǎo)包括肺在內(nèi)諸多臟器纖維化的“主開(kāi)關(guān)”[17]。TGF-β1首先被描述為正常乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)生EMT 的誘導(dǎo)劑[18],之后的研究中,TGF-β1作為EMT 誘導(dǎo)劑在包括肝臟、腎近端小管、晶狀體等上皮細(xì)胞中亦被證實(shí)[19]。在特發(fā)性肺纖維化動(dòng)物模型中,模型組TGF-β1分泌量顯著高于正常組,并加速了特發(fā)性肺纖維化的疾病進(jìn)程[20-21],在體外可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變,促進(jìn)EMT,保護(hù)成纖維細(xì)胞免于凋亡和促進(jìn)活性氧(ROS)的產(chǎn)生[22]。

        在特發(fā)性肺纖維化進(jìn)展過(guò)程中,肺泡及氣道上皮中均發(fā)現(xiàn)EMT 存在,其中,肺泡上皮(AEC)是肺纖維化的主要致病介質(zhì)[23-24]??紤]到AEC 損傷在特發(fā)性肺纖維化過(guò)程中的重要作用及可塑性,前期關(guān)于體內(nèi)外發(fā)生EMT 潛力的相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明,小鼠AEC 和AT2細(xì)胞系在含TGF-β1細(xì)胞培養(yǎng)基中均發(fā)生了EMT[25]。Yasuoka H 等[26]的研究表明,過(guò)表達(dá)IGFBP-5 小鼠纖維化模型的肺中AEC 共表達(dá)了E-cad 和a-SMA,提示存在EMT。特發(fā)性肺纖維化患者肺中活化AEC 可以合成分泌多種促凝血因子(如PAI-1/2)、促纖維化因子(如TGF-β、TNF-α、PDGF),這些細(xì)胞因子可以在AEC 和成纖維細(xì)胞之間相互傳遞信號(hào),進(jìn)而影響到彼此的增殖和凋亡[27]。特發(fā)性肺纖維化患者肺活檢中,發(fā)現(xiàn)纖維母細(xì)胞灶80%以上增生上皮細(xì)胞中共表達(dá)上皮(Nkx2.1、促生蛋白B)和間充質(zhì)(a-SMA)標(biāo)志,提示EMT 是體內(nèi)發(fā)生特發(fā)性肺纖維化的重要病理過(guò)程,且指出該過(guò)程受ECM 調(diào)節(jié)[28]。此外,Ward 等[29]在研究中發(fā)現(xiàn),取自臨床穩(wěn)定的肺移植受體氣道上皮細(xì)胞具有EMT 特征。

        綜上所述,AEC 損傷與重塑及TGF-β1誘導(dǎo)EMT在特發(fā)性肺纖維化發(fā)病過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。特發(fā)性肺纖維化患者中位生存期約2.8 年,被稱為“類腫瘤疾病”,治療上除氧療和肺移植外,包括吡非尼酮及尼達(dá)尼布在內(nèi),尚無(wú)具有確切療效的藥物,這一現(xiàn)狀急需改變[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大黃?蟲(chóng)丸對(duì)特發(fā)性肺纖維化的保護(hù)機(jī)制可能與不同程度阻斷或逆轉(zhuǎn)了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT 有關(guān)。這也為大黃?蟲(chóng)丸可以作為特發(fā)性肺纖維化患者潛在有效治療藥物提供了更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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