石佳，張紅梅，蘇子杰，徐方，余翔1,2,3,，馮艷麗1,2,3,*

1(食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北師范大學(xué))，湖北 黃石，435002)2(生物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(湖北師范大學(xué))，湖北 黃石，435002)3(特色野菜良種繁育與綜合利用技術(shù)湖北省工程研究中心，湖北 黃石，435002)4(湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石，435002)

紅曲菌(Monascusspp.)是我國(guó)傳統(tǒng)的特色可食用真菌資源，紅曲菌發(fā)酵大米等淀粉質(zhì)原料所得的產(chǎn)品——紅曲，在我國(guó)已有2 000多年的應(yīng)用歷史[1]。紅曲菌的有益代謝產(chǎn)物主要包括紅曲色素(Monascuspigments, MPs)、莫納可林K(monacolin K, MK)及γ-氨基丁酸等[2]。其中，MPs可按顏色分為紅色素、黃色素和橙色素三類[1]。MPs主要用于發(fā)酵豆制品、紅曲米酒及干制魚(yú)、肉制品等的著色，保健食品及替代肉品加工中的部分亞硝酸鹽等[2-3]。MK可有效抑制膽固醇生物合成中關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂水平[4]。目前，市場(chǎng)銷售的功能性紅曲主要指通過(guò)紅曲菌發(fā)酵淀粉質(zhì)原料等獲取的含MK等有益次級(jí)代謝產(chǎn)物的紅曲產(chǎn)品[4]。

目前，生產(chǎn)功能性紅曲的淀粉質(zhì)原料除大米外，還有大豆、薏米及燕麥等[5-6]。可采用響應(yīng)面法等優(yōu)化紅曲發(fā)酵工藝條件，如培養(yǎng)基配方、發(fā)酵溫度、pH等提高發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量[7-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在大米培養(yǎng)基中添加大豆粉可顯著提高紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量(P<0.05)[9]。然而，大豆粉含有過(guò)敏原Gly m Bd60K即β-伴大豆球蛋白的β亞基，且豆粉中的油脂也易氧化造成紅曲產(chǎn)品出現(xiàn)哈敗味，進(jìn)而影響含大豆原料紅曲類產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)品推廣[10-11]。另有研究表明，大豆中相關(guān)組分如大豆異黃酮及亞油酸等對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有顯著影響[12-13]。然而，大豆粉中促進(jìn)MK產(chǎn)生的關(guān)鍵組分并不清楚。因此，難以在充分利用大豆粉促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)生MK的同時(shí)避免其過(guò)敏原及脂質(zhì)氧化等問(wèn)題。因大豆粉中含有豐富的蛋白質(zhì)，可作為紅曲發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)氮源[14]。另一方面，在固態(tài)培養(yǎng)基中補(bǔ)充適量速效碳源——葡萄糖，也可促進(jìn)紅曲菌生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物生成[15]。由此，也將大豆分離蛋白和葡萄糖作為研究對(duì)象加以探討。

結(jié)合已有的研究基礎(chǔ)，本研究以可高產(chǎn) MK但不產(chǎn)桔霉素的叢毛紅曲菌(Monascuspilosus)MS-1為實(shí)驗(yàn)菌株，考察葡萄糖及大豆中幾種組分對(duì)紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響，以期篩選獲得可促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)MK的組分，進(jìn)而獲得高M(jìn)K含量的功能性紅曲。該研究結(jié)果可為利用葡萄糖或大豆中某些組分生產(chǎn)高M(jìn)K含量的功能性紅曲提供理論及技術(shù)支持，還可為采用某一種或某幾種組分替代大豆粉在功能性紅曲中的應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

叢毛紅曲菌(M.pilosus)MS-1(CCTCC M 2013295，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，市售紅曲米中分離獲得。

1.1.2 原料

大豆異黃酮(純度為60%)、大豆卵磷脂、大豆分離蛋白，河南華悅化工產(chǎn)品有限公司；大米及大豆，市售。

1.1.3 溶液及試劑

MK標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，阿拉丁公司；色譜純乙腈及常規(guī)試劑如葡萄糖、H3PO4、蛋白胨、瓊脂、冰醋酸、NH4H2PO4、CaCl2、MgSO4·7H2O、無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

安捷倫1260型高效液相色譜儀，Agilent科技有限公司；其他設(shè)備均為常規(guī)設(shè)備。

1.1.5 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g去皮后的馬鈴薯，切成約2 cm3的小塊。加入約1 000 mL蒸餾水后煮沸約20 min。用紗布過(guò)濾后將濾液定容至1 000 mL。加入20 g葡萄糖和15 g瓊脂粉并加熱使其充分溶解。自然pH，在1×105Pa滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80、蛋白胨10、無(wú)水CaCl20.1、NH4H2PO42、MgSO4·7H2O 0.5，以土豆汁(PDA不添加葡萄糖和瓊脂)定容。pH值為6.0，分裝后于1×105Pa滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵天然培養(yǎng)基：將50 g細(xì)度為20 目的大米加入250 mL三角瓶中，分別調(diào)整培養(yǎng)基含水量、冰醋酸及MgSO4·7H2O添加量為35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、0.6 mL/100g和0.004 mol/kg，充分混勻，1×105Pa滅菌20 min后趁熱打散備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中MK的測(cè)定

紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中MK的測(cè)定參考已建立的方法進(jìn)行[9]。在50 mL的離心管中加入0.3 g粉碎后的紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物和10 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，充分振蕩混勻后超聲提取1 h。提取液在8 000 r/min離心10 min，所得上清液過(guò)0.22 μm濾膜后采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測(cè)定紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量。HPLC系統(tǒng)為Agilent 1260，色譜柱為InertsilODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)∶V[0.5%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4]=60∶37∶3，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm，進(jìn)樣量20 μL。紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量計(jì)算如公式(1)所示：

MK/(mg·g-1)=

(1)

1.2.2 種子液的制備

將紅曲菌接種于PDA培養(yǎng)基斜面，30 ℃培養(yǎng)10 d。以無(wú)菌水沖洗PDA上的紅曲菌孢子并調(diào)整孢子濃度為106CFU/mL。以10 mL/100g的接種量將紅曲菌孢子接入1.1.5所述種子液培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.3 大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為考察大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對(duì)紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響，以大米為對(duì)照，在以大米為主要基質(zhì)的培養(yǎng)基中添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的上述添加物，將培養(yǎng)基含水量、MgSO4·7H2O及冰醋酸添加量分別調(diào)整至35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，0.004 mol/kg和0.6 mL/100g，接入13 mL/100g(質(zhì)量分?jǐn)?shù))紅曲菌種子液，在30 ℃條件下培養(yǎng)60 h后轉(zhuǎn)入25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至14 d。所得發(fā)酵產(chǎn)物在55 ℃烘干12 h并粉碎備用。采用HPLC分析MK的含量，具體方法同1.2.1。

1.2.4 大豆異黃酮添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為確定大豆異黃酮的最適加入量，向大米培養(yǎng)基中添加大豆異黃酮并分別將其添加量調(diào)整為0.5%、1%、3%、5%、10%、15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，以不添加大豆異黃酮的處理為對(duì)照。發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物處理同1.2.3，發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量的測(cè)定方法同1.2.1。

1.2.5 大豆分離蛋白添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為確定大豆分離蛋白的最適加入量，向大米培養(yǎng)基中添加大豆分離蛋白并分別將其添加量調(diào)整為1%、3%、5%、7%、9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，以不添加大豆分離蛋白的處理為對(duì)照。發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物處理同1.2.3，發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量的測(cè)定方法同1.2.1。

1.2.6 葡萄糖添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為確定葡萄糖的最適添加量，向大米培養(yǎng)基中添加葡萄糖并分別將其添加量調(diào)整為1%、3%、5%、7%、9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，以不添加葡萄糖的處理為對(duì)照。發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物處理同1.2.3，發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量的測(cè)定方法同1.2.1。

1.2.7 大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖復(fù)合對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為探究大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖復(fù)合對(duì)MK產(chǎn)生是否有協(xié)同作用，分別向大米培養(yǎng)基中添加3%大豆異黃酮、5%大豆分離蛋白、3%葡萄糖、3%大豆異黃酮和5%大豆分離蛋白、3%大豆異黃酮和3%葡萄糖、5%大豆分離蛋白和3%葡萄糖、3%大豆異黃酮和5%大豆分離蛋白及3%葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù),全文同)，以純大米培養(yǎng)基作為對(duì)照。發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物處理同1.2.3，發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量的測(cè)定方法同1.2.1。

1.2.8 大豆分離蛋白復(fù)合葡萄糖替代大豆粉用于含MK的功能性紅曲發(fā)酵的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在1.2.7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，分別以大米添加5%大豆分離蛋白復(fù)合3%葡萄糖、大米復(fù)合豆粉，質(zhì)量比為3∶2 作為培養(yǎng)基，以純大米培養(yǎng)基為對(duì)照。發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物處理同1.2.3，發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量的測(cè)定方法同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

考察大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對(duì)紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響，測(cè)定紅曲菌發(fā)酵14 d所得發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量，結(jié)果如圖1所示，大豆分離蛋白和大豆卵磷脂對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK均有顯著促進(jìn)作用，而大豆異黃酮?jiǎng)t顯著抑制MK的產(chǎn)生(P<0.05)。研究表明，大豆異黃酮可促進(jìn)紅曲菌生物量的增加，還可影響紅曲菌菌絲的形態(tài)，進(jìn)而影響其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。然而，大豆異黃酮并非促進(jìn)紅曲菌所有代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，如大豆異黃酮可促進(jìn)MPs產(chǎn)生，但卻抑制桔霉素的產(chǎn)生[12]。因此，大豆異黃酮對(duì)紅曲菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響具有選擇性，這與本研究中得到的結(jié)果即大豆異黃酮可促進(jìn)MPs產(chǎn)生卻抑制MK產(chǎn)生相符(有關(guān)MPs的具體數(shù)據(jù)未列出)。另外，大豆異黃酮的添加量也可影響紅曲菌生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，需進(jìn)一步優(yōu)化。研究表明，在培養(yǎng)基中添加豆粉可顯著促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)生MK，大豆粉中除該研究涉及的3種組分外還有哪些組分參與該過(guò)程，仍待進(jìn)一步研究[9]。由于大豆卵磷脂對(duì)MK的影響不及大豆分離蛋白顯著，且其對(duì)MPs的產(chǎn)生也無(wú)顯著影響，暫不作深入探討。

圖1 大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

2.2 大豆異黃酮添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為考察大豆異黃酮添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響，以未添加大豆異黃酮的處理為對(duì)照，接種紅曲菌后培養(yǎng)14 d，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)大豆異黃酮添加量達(dá)到3%、5%和10%時(shí)，對(duì)MK的產(chǎn)生均有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。大豆異黃酮的添加量達(dá)到3%時(shí)MK產(chǎn)量可達(dá)對(duì)照的3.10倍。除添加0.5%大豆異黃酮的處理外，1%、15%添加量的大豆異黃酮均可顯著抑制MK產(chǎn)生(P<0.05)。推測(cè)大豆異黃酮添加量為0.5%時(shí)，難以在培養(yǎng)基中混勻并起效。

因此，大豆異黃酮的添加量對(duì)MK的產(chǎn)生影響顯著，即添加1%大豆異黃酮可顯著抑制MK的產(chǎn)生而添加3%大豆異黃酮?jiǎng)t顯著促進(jìn)MK的產(chǎn)生。工業(yè)上用于生產(chǎn)MK的菌株不同或同一菌株在不同條件下可選擇性產(chǎn)生某種主要代謝產(chǎn)物如MPs或MK[16]。因此，在對(duì)某實(shí)驗(yàn)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，應(yīng)考慮該菌株的具體發(fā)酵特性。

圖2 大豆異黃酮添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

2.3 大豆分離蛋白添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為分析大豆分離蛋白添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響，以不添加大豆分離蛋白的處理為對(duì)照，接種紅曲菌并培養(yǎng)14 d，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量，結(jié)果如圖3所示，添加1%及以上大豆分離蛋白即可顯著促進(jìn)MK的產(chǎn)生。大豆分離蛋白的添加量達(dá)到5%時(shí)MK的產(chǎn)量達(dá)到最高，為對(duì)照的17.19倍(P<0.05)，該結(jié)果與圖1的結(jié)果相符。當(dāng)大豆分離蛋白的添加量達(dá)到7%及以上，MK的產(chǎn)量下降。大豆分離蛋白作為優(yōu)質(zhì)氮源，對(duì)紅曲菌的生長(zhǎng)和代謝均有影響。然而，當(dāng)培養(yǎng)基中氮源含量過(guò)高時(shí)，可造成碳氮比失衡，反而不利于菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[17]。

圖3 大豆分離蛋白添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

2.4 葡萄糖添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為分析葡萄糖添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響，以不添加葡萄糖的處理為對(duì)照，接種紅曲菌后培養(yǎng)14 d，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量，結(jié)果如圖4所示，在培養(yǎng)基中添加葡萄糖可顯著抑制紅曲菌產(chǎn)MK(P<0.05)，且葡萄糖添加量與MK產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)前期研究結(jié)果和查閱文獻(xiàn)可知，葡萄糖更利于MPs的產(chǎn)生(與本研究得到的有關(guān)MPs的數(shù)據(jù)相符，未列出)，尤其利于黃色素的產(chǎn)生[15]。然而，葡萄糖可促進(jìn)紅曲菌快速生長(zhǎng)進(jìn)而提升生物量，為抑制雜菌并促進(jìn)代謝產(chǎn)物積累奠定良好的基礎(chǔ)[18]。因此，在該研究中將繼續(xù)考察葡萄糖與其他添加物復(fù)合對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響。

圖4 葡萄糖添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

2.5 大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖復(fù)合對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

為分析大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖兩兩復(fù)合對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響，以大米培養(yǎng)基為對(duì)照，接種紅曲菌后培養(yǎng)14 d，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量，結(jié)果如圖5所示，5%大豆分離蛋白和3%葡萄糖復(fù)合對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK有協(xié)同促進(jìn)作用(P<0.05)。結(jié)合前述結(jié)果，在培養(yǎng)基中添加5%大豆分離蛋白可顯著促進(jìn)MK產(chǎn)生，添加3%葡萄糖卻可顯著抑制MK的產(chǎn)生(P<0.05)。究其原因，推測(cè)是大豆分離蛋白和葡萄糖可分別被紅曲菌用作氮源和碳源，同時(shí)添加上述物質(zhì)可獲取更適合紅曲菌產(chǎn)MK的碳氮比，或是兩者結(jié)合解除了葡萄糖的碳代謝抑制[17]。

圖5 大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖復(fù)合對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

2.6 大豆分離蛋白復(fù)合葡萄糖替代大豆粉用于含MK功能性紅曲發(fā)酵的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證大豆分離蛋白復(fù)合葡萄糖替代豆粉對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響，以大米培養(yǎng)基為對(duì)照，將紅曲菌接種于上述3種培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，分析發(fā)酵產(chǎn)物中MK的含量，結(jié)果如圖6所示，在大米培養(yǎng)基中添加豆粉或大豆分離蛋白復(fù)合葡萄糖，均可顯著促進(jìn)MK的產(chǎn)生，這與已有的研究結(jié)果相符(P<0.05)[9]。添加5%大豆分離蛋白復(fù)合3%葡萄糖比添加豆粉更利于MK的產(chǎn)生，其MK產(chǎn)量分別為添加豆粉和對(duì)照所得MK產(chǎn)量的1.53倍和16.80倍。

該結(jié)果可為用大豆分離蛋白復(fù)合葡萄糖替代豆粉在高M(jìn)K含量功能性紅曲中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。該研究可避免因直接使用豆粉造成所生產(chǎn)的功能性紅曲中油脂含量過(guò)高而發(fā)生脂肪氧化，但無(wú)法避免潛在過(guò)敏源。

圖6 大豆分離蛋白復(fù)合葡萄糖、豆粉對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響

3 結(jié)論

紅曲菌是我國(guó)具有傳統(tǒng)特色的可食用微生物，其主要代謝產(chǎn)物MPs和MK在我國(guó)得到廣泛的應(yīng)用。紅曲菌發(fā)酵大豆、豆粕、豆?jié){等均可獲取高M(jìn)K含量的紅曲產(chǎn)品[19-20]。然而，大豆促進(jìn)MK產(chǎn)生的具體組分并不清楚。本研究以大米為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察經(jīng)典碳源葡萄糖及大豆主要組分對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響。根據(jù)研究結(jié)果，在培養(yǎng)基中添加5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))大豆分離蛋白復(fù)合3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖，可促進(jìn)紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中MK的產(chǎn)生。在上述條件下，MK產(chǎn)量可達(dá)12.85 mg/g，高于添加大豆粉的處理所得紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中MK的產(chǎn)量。該研究結(jié)果可為利用經(jīng)典碳源葡萄糖復(fù)合大豆分離蛋白生產(chǎn)高M(jìn)K含量的功能性紅曲產(chǎn)品提供理論和技術(shù)支持。尤其是可考慮采用葡萄糖復(fù)合大豆分離蛋白替代大豆粉應(yīng)用于功能性紅曲的生產(chǎn)中，以此減少因直接使用豆粉造成的紅曲產(chǎn)品中脂類的氧化變質(zhì)等問(wèn)題。