徐文文，梁玉林，王云霞，劉秀*，尹建軍，周廣軍，宋全厚，丁夢璇，周鵬飛

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010110)3(山東稻香村食品工業(yè)有限公司，山東 菏澤，274100)

乳制品在食品行業(yè)中占據(jù)不可忽視的地位。據(jù)中國奶業(yè)質(zhì)量報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，2011—2016年，我國每年以87.1萬t的增長趨勢，完成全國乳制品消耗量從2 480.5到3 204.7萬t的飛越[1]；2018—2019年乳制品行業(yè)趨于穩(wěn)定，但全國每年總消耗量也均為2 400萬t以上，巨大的消耗在推動(dòng)乳業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)，對乳制品質(zhì)量安全提出考驗(yàn)。根據(jù)國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌被列為乳粉中重點(diǎn)關(guān)注的食源性致病菌[2-3]。沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，其通過多種毒力因子作用于人體引起腸道炎、敗血癥，在我國已報(bào)道的細(xì)菌性食物中毒事件中沙門氏菌占比70%以上[4]，在全球沙門氏菌也穩(wěn)居前列。金黃色葡萄球菌是世界范圍內(nèi)另一大食源性致病菌，主要通過腸毒素污染食物引起食物中毒，2000年，日本雪印乳品公司的牛奶中毒事件就是由金黃色葡萄球菌感染造成，先后涉及8個(gè)縣，14 780人中毒[5]。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌引起的乳品污染危害不容小覷。

目前沙門氏菌和金黃色葡萄球菌檢測多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction， PCR)方法[6-7]。前者通過菌落形態(tài)特征及其生理生化特性進(jìn)行菌種鑒定，工作繁瑣且耗時(shí)較長，檢測結(jié)果往往滯后于生產(chǎn)，無法及時(shí)為企業(yè)提供風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警；后者雖有效提高了檢測效率，但對實(shí)驗(yàn)人員和儀器精密度要求高，難以在車間得到有效開展。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種依托核酸進(jìn)行目標(biāo)物體識別的一種新技術(shù)，該技術(shù)通過4條或6條引物，在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。與其他方法相比，LAMP技術(shù)極大減少了對儀器精密度的要求，檢測耗時(shí)短且靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于各類微生物檢測[8-13]。但現(xiàn)有的LAMP方法大多只能針對一種菌種進(jìn)行檢測，當(dāng)樣品中同時(shí)存在多種微生物時(shí)只能分批進(jìn)行定性檢測，工作量較大。本研究分別利用沙門氏菌invA侵襲蛋白A基因[14-16]和金黃色葡萄球菌nuc耐熱核酸酶基因[17-18]設(shè)計(jì)合成引物，優(yōu)化引物濃度并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，建立二重LAMP檢測體系，旨在為乳制品尤其是乳粉中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的篩查鑒定提供一種快速、有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)共涉及15株菌株，包括3株沙門氏菌、3株金黃色葡萄球菌及另外9株非目標(biāo)常見食源性致病菌，具體菌株信息見表1。

表1 菌株信息

1.2 儀器與設(shè)備

G49194G微量移液器、5804R、5424型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SX-700高壓滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司；CPA323S精密天平，德國Sartorius公司；VORTEX-5渦旋儀，Kylin-bell公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡Esco公司；Biodrop超微量核酸蛋白分析儀，英國柏點(diǎn)公司；Genie Ⅱ溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀，英國OptiGene Limited公司。

1.3 試劑

腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth, BHI)，平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar, PCA)，北京路橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、無菌雙蒸水，天根生化科技有限公司；Isothermal Master Mix(IMM)，英國OptiGene Limited公司；LAMP擴(kuò)增引物，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)及DNA模板制備

將表1中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等15株細(xì)菌分別接種于10 mL腦心浸液肉湯中，36 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體。以滅菌生理鹽水對所得菌體進(jìn)行重懸，充分混勻制成菌懸液，并按照細(xì)菌DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成

以沙門氏菌invA基因，金黃色葡萄球菌nuc基因作為引物設(shè)計(jì)靶基因，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer(primerexplorer.jb/lampv5e/index.html)進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。具體引物信息如表2，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表2 沙門氏菌和金黃色葡萄球菌LAMP引物序列

1.4.3 單重LAMP體系的建立與二重LAMP體系的優(yōu)化

12.5 μL沙門氏菌和金黃色葡萄球菌單重LAMP反應(yīng)體系包括7.5 μL IMM、3.5 μL引物(2.5 pmol F3和B3，20 pmol FIP和BIP，10 pmol LF和LB)及1.5 μL核酸模板，擴(kuò)增溫度為65 ℃，擴(kuò)增時(shí)間為30 min。

為了保證沙門氏菌和金黃色葡萄球菌擴(kuò)增效率一致，對影響較大的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。分別在各自原混合引物濃度(5.2 μmol/L)的基礎(chǔ)上，調(diào)整每種引物混合液所占二重引物混合液的體積份額改變引物濃度，引物濃度比設(shè)定為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4。

1.4.4 特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

應(yīng)用6株目標(biāo)菌株和9株其他常見食源性致病菌菌株核酸，在Genie Ⅱ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀上分別測試單重、二重LAMP反應(yīng)體系，并以熒光積累擴(kuò)增曲線觀察擴(kuò)增結(jié)果，驗(yàn)證檢測方法特異性。

1.4.5 熔解曲線的分析

分別以單一沙門氏菌和金黃色葡萄球菌核酸為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測并對所得產(chǎn)物的熔解曲線進(jìn)行分析，確定沙門氏菌和金黃色葡萄球菌擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線特征峰。同時(shí)，觀察混合菌株核酸同時(shí)檢測時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線的退火溫度與單一菌株擴(kuò)增熔解曲線的退火溫度是否一致。

1.4.6 單一菌株檢測靈敏度

以沙門氏菌和金黃色葡萄球菌核酸為模板，進(jìn)行10倍梯度稀釋，使核酸終質(zhì)量濃度為100fg/μL～100ng/μL。采用LAMP方法分別對2種食源性致病菌各濃度核酸進(jìn)行檢測，每個(gè)梯度重復(fù)10次實(shí)驗(yàn)，把10次全部檢出的最低梯度定為最低檢測靈敏度。實(shí)驗(yàn)以無菌雙蒸水作為陰性對照。

1.4.7 混合菌間擴(kuò)增干擾測試

固定沙門氏菌核酸質(zhì)量濃度為100 pg/μL，金黃色葡萄球菌核酸分別與之按照1∶1、1∶50、1∶100、1∶150濃度比混合形成混合核酸模板；再將金黃色葡萄球菌核酸質(zhì)量濃度固定為100 pg/μL，沙門氏菌核酸分別與之按照1∶1、1∶50、1∶100、1∶150混合形成混合核酸模板，分別進(jìn)行10次二重LAMP擴(kuò)增檢測，并對產(chǎn)生的熔解曲線進(jìn)行分析，以此測試混合菌濃度未知情況下，高濃度核酸對低濃度核酸擴(kuò)增干擾程度。

1.4.8 脫脂乳粉樣品檢測及與國標(biāo)法的比較

將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌分別接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)12 h后，以脫脂乳粉作為基質(zhì)制備人工污染樣品，每個(gè)樣品制作10份，其中3份作為陰性對照，7份加入100CFU/mL的待檢測菌液(實(shí)際菌量通過培養(yǎng)法進(jìn)行計(jì)數(shù)獲得)作為污染樣品。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)國標(biāo)方法驗(yàn)證所用脫脂乳粉中不含任何病原菌。

將每份樣品分別采用2種方法進(jìn)行檢測，其中國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016、GB 4789.10—2016作為LAMP方法的基準(zhǔn)；LAMP法按照國標(biāo)法進(jìn)行預(yù)增菌后，取1 mL進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增檢測，探討該方法的實(shí)用性及可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 二重LAMP體系引物濃度配比

不同濃度配比的二重LAMP體系對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的擴(kuò)增檢測結(jié)果如圖1所示。由結(jié)果可知沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌引物濃度比為 3∶1時(shí)，同濃度核酸擴(kuò)增效率相對一致，均可在7.5 min產(chǎn)生熒光擴(kuò)增曲線，因此確定沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌最佳引物濃度比為3∶1。

a-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌1∶1;b-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌2∶1;c-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌3∶1;d-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌4∶1

2.2 特異性驗(yàn)證

對設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果如表3所示。單重LAMP體系及二重LAMP體系均只特異性擴(kuò)增沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，而對其他非目標(biāo)菌株無擴(kuò)增，表明建立的方法對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA具有良好特異性。

2.3 LAMP擴(kuò)增熔解曲線分析

對單重沙門氏菌、金黃色葡萄球菌擴(kuò)增熔解曲線進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。單一沙門氏菌的熔解曲線在85～90 ℃出現(xiàn)，特征峰在88 ℃產(chǎn)生；單一金黃色葡萄球菌的熔解曲線在80～84 ℃出現(xiàn)，特征峰在83 ℃產(chǎn)生。對等濃度混合基因組核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物分別在85～90 ℃和80～84 ℃各有一個(gè)熔解曲線特征峰，與單重熔解曲線特征峰退火溫度范圍一致，表明建立的二重LAMP擴(kuò)增方法可實(shí)現(xiàn)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌同時(shí)檢測。此外，根據(jù)不同特征峰退火溫度，也可直接判斷菌株信息，完成菌株定性區(qū)分鑒定。

2.4 單一菌檢測靈敏度

分別對不同濃度梯度沙門氏菌和金黃色葡萄球菌核酸進(jìn)行LAMP法檢測，結(jié)果如圖3所示。陰性對照及核酸質(zhì)量濃度為100fg/μL時(shí)，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌樣品均無擴(kuò)增曲線，≥101fg/μL時(shí)有擴(kuò)增曲線。對產(chǎn)生擴(kuò)增曲線的核酸濃度進(jìn)行10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，把10次全部檢出的最低梯度定為最低檢測靈敏度。結(jié)果表明，當(dāng)核酸質(zhì)量濃度為101fg/μL時(shí)，10次LAMP重復(fù)試驗(yàn)有2、3次未檢出；核酸質(zhì)量濃度≥102fg/μL時(shí)，10次重復(fù)試驗(yàn)全部檢出，因此規(guī)定本實(shí)驗(yàn)建立的二重LAMP檢測方法對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌最低穩(wěn)定檢測靈敏度為102fg/μL。

表3 LAMP特異性熒光曲線擴(kuò)增結(jié)果

2.5 混合菌間擴(kuò)增干擾測試

對不同濃度配比的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌混合基因組核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖4。當(dāng)沙門氏菌與金黃色葡萄球菌核酸濃度比為1∶1時(shí)，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌在85～90 ℃和80～84 ℃均有明顯的熔解曲線，隨著沙門氏菌核酸體積比減少，沙門氏菌特征峰熒光值漸漸降低，當(dāng)濃度比為1∶150時(shí)，85～90 ℃已不能觀察到對應(yīng)沙門氏菌的熔解曲線，反之亦然。證明進(jìn)行混合菌檢測時(shí)，2種菌液核酸濃度比不能超過100倍，一旦超過100倍時(shí)，高濃度核酸熔解曲線會(huì)掩蓋低濃度核酸熔解曲線的出現(xiàn)，影響目標(biāo)菌株的定性鑒定。

a-沙門氏菌熔解曲線;b-金黃色葡萄球菌熔解曲線;c-混合菌熔解曲線

a-沙門氏菌檢測靈敏度;b-金黃色葡萄球菌檢測靈敏度

a-沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌熔解曲線;b-金黃色葡萄球菌∶沙門氏菌熔解曲線

2.6 脫脂乳粉樣品檢測及與國標(biāo)法的比較

制備30個(gè)脫脂乳粉樣品，預(yù)增菌培養(yǎng)后分別進(jìn)行LAMP法檢測和國標(biāo)法檢測。結(jié)果如表4所示，100CFU/mL濃度的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌污染樣品，經(jīng)36 ℃增菌12 h，LAMP檢出結(jié)果和國標(biāo)法檢出結(jié)果完全一致，未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，說明該方法具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。此外，從預(yù)增菌到獲得檢測結(jié)果，全過程可在1 d內(nèi)完成，大大縮短了國標(biāo)法檢測周期，更省時(shí)便捷。

表4 脫脂乳粉樣品檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

沙門氏菌和金黃色葡萄球菌已成為全球關(guān)注的食源性致病菌，每年感染人數(shù)達(dá)千萬人，死亡病例達(dá)上萬例，是我國乳粉出廠必檢項(xiàng)目[19-21]。通常被沙門氏菌和金黃色葡萄球菌污染的乳粉外觀和氣味沒有明顯異常，消費(fèi)者難以通過感官品評判斷產(chǎn)品污染，一旦被群眾食用，將對消費(fèi)者和廠家造成嚴(yán)重的健康危害和經(jīng)濟(jì)損失，因此對這2種食源性致病菌的實(shí)時(shí)檢測非常必要[22-23]。實(shí)驗(yàn)依據(jù)前人研究成果，選擇沙門氏菌特有侵襲蛋白invA基因和金黃色葡萄球菌特有耐熱核酸酶nuc基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。同時(shí)，由于不同引物本身對核酸擴(kuò)增效率不同，為避免低效率擴(kuò)增菌種漏檢風(fēng)險(xiǎn)，保證實(shí)際檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，對二重引物配比進(jìn)行調(diào)整。結(jié)果，沙門氏菌∶金黃色葡萄球菌引物濃度比為3∶1時(shí)，建立的二重檢測方法效率最佳。對6株目標(biāo)菌株和9株非目標(biāo)菌株分別進(jìn)行單獨(dú)和混合檢測，對應(yīng)的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌核酸均能得到特異性擴(kuò)增，而其他非目標(biāo)菌的菌液核酸均未產(chǎn)生擴(kuò)增，證明引物擴(kuò)增具有良好的特異性和穩(wěn)定性。

現(xiàn)階段應(yīng)用LAMP方法對微生物的定性檢測多集中在單一菌種的檢測，主要原因在于LAMP引物數(shù)量多，單個(gè)目標(biāo)菌的檢測已達(dá)到4條或者6條引物，多重引物更會(huì)翻倍增加，引物間堿基互補(bǔ)配對的不確定性為LAMP多重體系的構(gòu)建帶來了難度。TANNE等[24]和XIA[25]等也對多重體系進(jìn)行了研究，但多數(shù)僅能用于菌種快速篩查，而不能對幾種菌進(jìn)行同時(shí)定性鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用熔解曲線法對二重LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過觀察熔解曲線、特征峰的退火溫度，直接對檢測菌種進(jìn)行區(qū)分判定，直觀簡單，保證了2種菌種同時(shí)快速篩查和定性鑒定需求。

在單一菌種靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌靈敏度均達(dá)到102fg/μL，與文獻(xiàn)報(bào)道PCR法比較，檢測靈敏度提高了10～100倍[26]，檢測結(jié)果較理想。對混合菌間擴(kuò)增干擾測試中設(shè)置了1∶1、1∶50、1∶100、1∶150四個(gè)濃度梯度，擬驗(yàn)證實(shí)際樣品菌濃度不定情況下的檢出限制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌濃度比相差100倍以上時(shí)，低濃度菌種核酸會(huì)被高濃度菌種核酸掩蓋，使其無法產(chǎn)生對應(yīng)熔解曲線，低濃度目標(biāo)菌株產(chǎn)生假陰性結(jié)果，也是實(shí)驗(yàn)存在的一個(gè)局限，但乳粉中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測本身就是一種低濃度污染樣品檢測，因此實(shí)際應(yīng)用中，結(jié)果局限性實(shí)現(xiàn)可能不大。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以沙門氏菌侵襲蛋白invA基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因設(shè)計(jì)建立的二重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，實(shí)施性好，為乳粉企業(yè)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的風(fēng)險(xiǎn)評估提供方向，應(yīng)用前景廣闊。