趙 鑫，胥 朵，李少海，張文信 (.渭南職業(yè)技術學院西醫(yī)臨床教研室，陜西 渭南 7406;.渭南市中醫(yī)醫(yī)院骨科，陜西 渭南 7406)

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)作為兒科比較常見的一種眼內惡性腫瘤，全球范圍的發(fā)病率為1/20 000[1]。RB在非洲及一些發(fā)展中國家的發(fā)病率較高，并且患兒的5年生存率要低于發(fā)達國家[2]。RB發(fā)現越早其治愈的可能性越高，由于發(fā)病初期腫瘤體積小，并位于視網膜周邊，不會有明顯的視力影響，而一旦出現眼部癥狀后，治愈的可能性則明顯降低[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調控功能的非編碼RNA，其核苷酸序列長度一般為19～25 bp，在細胞的增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用[4]。近年來大量實驗研究證實,miRNA可作為原癌基因或抑癌基因參與到腫瘤的發(fā)生及進展中，因此miRNA具有成為治療癌癥靶點的潛在價值[5]。既往研究發(fā)現，miR-198能夠通過抑制HGF/c-MET信號途徑提高非小細胞肺癌的放療敏感性，誘導細胞凋亡[6],并且能夠通過調節(jié)ADAM28/JAK-STAT信號通路影響大腸癌的增殖和凋亡[7]，還能夠抑制TLR4蛋白表達及胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[8]，但miR-198在RB細胞中的調控機制尚未明確。因此本研究通過在RB細胞株系Y79細胞中轉染miR-198模擬物，以探究miR-198對RB細胞生長、侵襲的影響，并進行裸鼠體內荷瘤試驗，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

miR-198 mimic及miR-NC(上海吉凱基因技術有限公司)，脂質體、Lipofectamine?2000(美國Thermo Fisher Scientific)，10%胎牛血清(美國Gibco公司)，100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素(美國Invitrogen公司)，TRIzol Kit、Revertaid First Strand cDNA Kit(Thermo Fisher科學公司)，兔抗人Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin、GAPDH以及兔抗小鼠Ki67、SOX2、VEGF單克隆抗體(美國Abcam公司)，細胞計數試劑盒(碧云天公司)，鋪有Matrigel膠的Transwell小室(美國BD公司)，高速冷凍離心機(德國Beckman Coulter)，正置熒光顯微鏡(日本Thermo)，實時熒光定量PCR儀(羅氏診斷)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

RB Y79細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的完全RPMI 1640培養(yǎng)液中，并在37 ℃的5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數期，隨后以0.25%胰蛋白酶消化液處理制成細胞懸液。將細胞懸液隨機分為空白對照組(Control組)、陰性對照組和過表達組，參照試劑盒操作說明采用Lipofectamine?2000將miR-NC、miR-198模擬物分別轉染至陰性對照組和過表達組的Y79細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后置于熒光顯微鏡下觀察轉染陽性細胞，若發(fā)出綠色熒光信號則視為轉染陽性，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-198表達水平

Trizol法提取各組中的總RNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，利用Revertaid First Strand cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，采用SYBR-Green PCR Mix試劑盒檢測mRNA的表達水平。PCR參數設置：95 ℃預變性20 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸20 s，循環(huán)40次，并根據溶解曲線分析結果是否為特異性擴增。miR-198上游引物：5′-GGTCCAGAGGGGAGAT-3′；下游引物：5′-GAATACCTCGGACCCTGC-3′。內參基因U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′；下游引物：5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′。應用2-△△Ct法分析miR-198的相對表達水平。

1.4 干細胞成球試驗檢測Y79細胞增殖能力

將各組Y79細胞消化后計數，調整濃度至1×105/mL,接種至6孔板上，加入含有2%胎牛血清、10 μg/mL胰島素、20 ng/mL表皮生長因子、20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、20 ng/mL B27細胞培養(yǎng)添加劑、500 ng/mL氫化可的松的干細胞培養(yǎng)液后，放入37 ℃的5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，之后在光學顯微鏡下觀察干細胞成球的直徑及數量，并拍照記錄。

1.5 Transwell小室試驗檢測Y79細胞侵襲能力

將鋪有Matrigel膠的Transwell小室預熱至37 ℃后，消化各組Y79細胞，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞 3次后重懸細胞，并調整細胞密度至1×105/mL，在Transwell下室放入1 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入300 μL細胞懸液后培養(yǎng)36 h。取出Transwell小室，用棉簽輕柔地擦去上層未穿膜的細胞和基質膠，用冰甲醛對濾膜進行固定后結晶紫染色。將濾膜剝離后正面朝下固定在載玻片上，在光學顯微鏡下隨機選擇5個高倍鏡(×400)下視野進行細胞計數，以穿膜細胞數表示細胞侵襲能力。

1.6 Western blot檢測細胞中相關蛋白表達水平

加入RIPA裂解液，提取各組培養(yǎng)48 h后的Y79細胞中的總蛋白，采用BCA法對蛋白水平進行定量，并利用Bradford將各組蛋白濃度調整一致，經SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至甲醛預處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin、GAPDH一抗(1∶500)，于4 ℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL試劑盒與DNR BioImaging System觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用凝膠圖像處理系統軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。

1.7 裸鼠體內移植實驗

將適應性培養(yǎng)的60只裸鼠隨機分為陰性對照組和過表達組，每組30只，收集2組對數生長期的Y79細胞，制成密度為1×1010/L的細胞懸液后，分別進行皮下注射，每只裸鼠注射200 μL，注射完成后，每5 d各組隨機處死3只裸鼠，取瘤體測量質量及體積，30 d時處死剩余裸鼠，取平均值計算。瘤體中miR-198的mRNA相對表達水平檢測同1.3。所有操作均符合動物實驗倫理標準。

1.8 免疫組化法檢測瘤體中蛋白表達水平

將瘤體組織進行常規(guī)石蠟切片，脫水、PBS溶液漂洗、3%H2O2與甲醇混合液浸泡10 min，超純水漂洗、抗原修復、PBS漂洗5 min、加入一抗37 ℃反應2 h、PBS漂洗5 min、加入二抗37 ℃反應40 min、PBS漂洗5 min、DAB室溫顯色20～30 min，光學顯微鏡下觀察有棕黃色顆粒出現時則采用自來水終止。再用蘇木素復染30 s、自來水漂洗、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察切片中Ki67、SOX2、VEGF的陽性表達細胞，其細胞漿表現為棕黃色顆粒。每張切片隨機選取10個視野，統計陽性細胞數目，計算陽性細胞率，陽性細胞率=陽性細胞數目/總細胞計數×100%。

1.9 統計學分析

所有實驗所得數據均采用SPSS 20.0以及Graph Pad Prism 5進行統計學分析，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染試驗結果

qRT-PCR結果顯示，陰性對照組與Control組Y79細胞中miR-198的相對表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而過表達組Y79細胞中miR-198的相對表達水平較Control組及陰性對照組提高了58倍，差異有統計學意義(P<0.05)，表明過表達miR-198成功(圖1)。

*：與過表達組比較，P<0.05

2.2 過表達miR-198抑制Y79細胞增殖能力

干細胞成球試驗結果顯示，陰性對照組與Control組Y79細胞的成球直徑及數量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而過表達組Y79細胞的成球直徑及數量較Control組及陰性對照組小，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 過表達miR-198抑制Y79細胞侵襲能力

Transwell試驗結果顯示，陰性對照組與Control組Y79細胞的細胞侵襲率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而過表達組Y79細胞的細胞侵襲率較Control組及陰性對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

a：各組Y79細胞干細胞成球試驗結果(×400)；b：各組Y79細胞的成球直徑和數量 *：與過表達組比較，P<0.05

a：各組Y79細胞Transwell試驗結果(結晶紫，×400)；b：各組Y79細胞侵襲情況 *：與過表達組比較，P<0.05

2.4 過表達miR-198抑制Y79細胞Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表達

Western blot結果顯示，陰性對照組與Control組Y79細胞中Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而過表達組Y79細胞中Ki67、SOX2、OCT4、VEGF、Fibronectin蛋白表達水平較Control組及陰性對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、5。

a：蛋白表達圖譜；b：各組Y79細胞中Ki67、SOX2、OCT4蛋白表達水平 *：與過表達組比較，P<0.05

a：蛋白表達圖譜；b：各組Y79細胞中VEGF、Fibronectin蛋白表達水平 *：與過表達組比較，P<0.05

2.5 過表達miR-198抑制Y79移植瘤體形成

過表達組裸鼠的移植瘤體質量和體積均小于陰性對照組(P<0.05)，見圖6a～c。qRT-PCR結果顯示，過表達組裸鼠的移植瘤中miR-198相對表達水平高于陰性對照組(P<0.05)，見圖6d。免疫組化檢測顯示，過表達組裸鼠的移植瘤中Ki67、SOX2、VEGF的陽性表達率低于陰性對照組(P<0.05)，見圖7。

a：皮下注射后30 d裸鼠移植瘤；b：皮下注射后不同時間點移植瘤體積；c：皮下注射30 d裸鼠移植瘤體質量；d：移植瘤中miR-198的相對表達水平 *：與陰性對照組比較，P<0.05

*：與陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

RB是一類由于RB1基因發(fā)生突變而導致的兒童眼內惡性腫瘤，近年來其臨床治療效果取得了巨大的進步，但在世界范圍內RB的病死率及繼發(fā)腫瘤率依舊較高，早發(fā)現、早治療及遺傳咨詢是控制該病的關鍵[9]。鑒于臨床上對患兒生存質量重視程度的不斷提高，RB治療的目標逐漸由保障患兒生命轉變?yōu)楸Ａ粞矍蛏踔烈暳?，因此對其治療方案的選擇提出了更高的要求[10]。常規(guī)化療聯合局部治療是臨床上最常用的方式，隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展及RB病因學的深入研究，基因療法、干細胞療法、靶向治療等方式逐漸應用于臨床[11]。miRNA作為單鏈短RNA，不具備開放閱讀框，因此不能進行翻譯蛋白表達，但能夠通過與靶基因的3′或5′段UTR區(qū)完全或不完全結合來進行表達的調控[12]。目前人類基因組中已經發(fā)現超過1 000種的miRNA，其不僅參與調控細胞的正常增殖凋亡過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要的作用，已成為了世界范圍內研究的熱點方向之一[13]。

miRNA在體內既能夠作為原癌基因促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，又能夠作為抑癌基因抑制腫瘤的進展[14]。miR-198作為一類抑癌基因，在多種癌細胞中低表達[15-16]，并且其表達水平與結直腸癌和胰腺導管腺癌患者的預后密切相關[17-18]。為了探究miR-198在RB中的可能機制，本研究選擇RB Y79細胞系為研究對象，并通過轉染miR-198模擬物獲得過表達細胞系，經RT-PCR試驗證實轉染miR-198模擬物后，Y79細胞內的miR-198表達水平升高了58倍。細胞的過度分裂及增殖是腫瘤癌變的重要環(huán)節(jié)，Ki67作為增殖性細胞核的標志物，在細胞分裂G1后期、G2期和S期表達逐漸升高，在M期表達量達到最高峰，因此Ki67是評價細胞增殖的敏感指標[19]。本研究顯示，過表達組Y79細胞內Ki67表達水平明顯降低，提示miR-198可能通過抑制腫瘤細胞的分裂，從而抑制細胞增殖。SOX家族具有高遷移率族蛋白結合區(qū)域，SOX2作為家族的重要成員之一，參與調控組織器官的形成以及發(fā)展，在維持干細胞特性方面具有重要作用；OCT4作為一類轉錄調節(jié)因子，能夠維持干細胞的多潛能性以及未分化狀態(tài)[20]。既往研究發(fā)現，在人類胚胎干細胞自我更新時miR-145呈現低表達，而在分化時miR-145能夠通過抑制SOX2及OCT4的表達從而促進細胞分化[21]。本研究過表達組Y79細胞的干細胞成球能力明顯降低，且SOX2、OCT4蛋白表達水平也明顯降低，提示miR-198可能通過抑制SOX2、OCT4蛋白表達，從而降低Y79細胞的干細胞特征，進而抑制其惡性增殖。

侵襲、轉移是惡性腫瘤的重要生物學特征[22]。VEGF能夠增加血管的通透性，導致腫瘤細胞侵入血管，進而向淋巴及遠處細胞侵襲轉移[23]。Fibronectin蛋白作為間質細胞源性標志物，其水平升高表明細胞發(fā)生上皮間質轉化，而間質細胞的增加會使得腫瘤細胞的形態(tài)發(fā)生改變，其侵襲及遷移能力明顯提高[24]。本研究顯示，過表達組Y79細胞中VEGF、Fibronectin蛋白水平明顯降低，提示miR-198可能通過抑制Y79細胞的上皮間質轉化進程，進而抑制腫瘤細胞的侵襲能力，與Hu等[25]的研究一致。本研究通過移植瘤實驗進一步證實了在體內過表達miR-198后能夠明顯抑制移植瘤的生長，并且腫瘤組織中Ki67、SOX2、VEGF蛋白的陽性表達率均明顯降低，提示在體內miR-198同樣能夠發(fā)揮抑制腫瘤生長、侵襲的作用。

綜上所述，miR-198在RB細胞中同樣作為抑癌基因發(fā)揮作用，在RB細胞系Y79細胞中過表達后，細胞的增殖能力及侵襲能力均明顯降低，可能是通過調控細胞周期、降低干細胞特性、抑制上皮間質轉化來實現的，同時移植瘤實驗也證實了其抑制腫瘤的潛在價值。本研究初步探索了miR-198對RB細胞的作用機制，為RB細胞的基因治療提供了新的治療靶標。