張 洪 武正才 黃春球 謝忠浪 騰利兵 郭 昕

云南植物藥業(yè)有限公司，云南 昆明 650109

燈盞花為菊科植物短葶飛蓬 [ErigeronBreviscapul(Vent.)Hand- Mass.]的干燥全草[1]，又名燈盞細(xì)辛，是云南道地的民族藥材。全草具有散寒解表、祛風(fēng)除濕、活絡(luò)止痛、消積的功效，臨床上多用于治療腦血栓、腦栓塞、中風(fēng)等腦血管意外所致的癱瘓癥、心絞痛等[2]。燈盞花主要成分為燈盞花乙素，此外還含有黃酮、吡喃酮、倍半萜、咖啡酸酯、酚酸類化合物等多種化學(xué)成分[3]。

2015版中國藥典以燈盞花乙素的含量作為評價(jià)藥材質(zhì)量的指標(biāo)。然而，僅控制燈盞花乙素的含量并不能反映燈盞花藥材或提取物的整體質(zhì)量。指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù)通過全面反映中藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，能有效的反映中藥質(zhì)量[4]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜分析方法對10批市售燈盞花藥材和8批自提燈盞花提取物進(jìn)行系統(tǒng)的指紋圖譜研究，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(版本2004A和B)”建立燈盞花藥材及其提取物對照指紋圖譜，對各批次的燈盞花藥材及其提取物的指紋圖譜相似度進(jìn)行分析比較。近年來雖然有一些文獻(xiàn)對燈盞花藥材及其提取物HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究[5-6]，但是這些指紋圖譜僅僅指認(rèn)了參照色譜峰的結(jié)構(gòu)。筆者對生產(chǎn)用市售燈盞花藥材及燈盞花提取物的HPLC指紋圖譜進(jìn)一步進(jìn)行研究，標(biāo)定其中3個(gè)指紋峰的結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果為市售燈盞花藥材及其提取物的質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)參考依據(jù)，為市售燈盞花藥材及其提取物提供一種有效的質(zhì)量控制方法，確保外購燈盞花藥材及其提取物相關(guān)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和均一性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1260高效液相色譜儀(四元梯度泵，自動(dòng)恒溫進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測器)，超聲波清洗儀，中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(版本2004A和B)的相關(guān)軟件。

1.2 材料 乙腈(色譜純)，醋酸銨(分析純)，磷酸(分析純)，超純水。燈盞花乙素、燈盞花甲素、野黃芩素對照品(云南植物藥業(yè)有限公司研究院自制)。10批燈盞花藥材(云南植物藥業(yè)有限公司外購)，8批燈盞花提取物(云南植物藥業(yè)有限公司按2015版《中國藥典》一部中燈盞細(xì)辛顆粒標(biāo)準(zhǔn)制法提取外購燈盞花所得的提取物)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent zorbax C18(5μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)，0.1%的醋酸銨水溶液(磷酸條PH為3)(B)，梯度洗脫比例見表1；檢測波長：335 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：1 mL/min。

表1 梯度洗脫系統(tǒng)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取燈盞花乙素對照品適量，加甲醇超聲溶解制成含量為0.140 mg/mL的溶液。精密稱取燈盞花甲素對照品適量，加甲醇超聲溶解制成含量為0.238 mg/mL 的溶液。精密稱取野黃芩素對照品適量，加甲醇超聲溶解制成含量為 0.043 mg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取1 g已粉碎成細(xì)粉的燈盞花藥材，加入75%甲醇溶液100 mL，超聲(200 W,50 Hz)45 min,過濾，濾液用0.45 μm的濾膜過濾，即得燈盞花藥材供試品溶液。取燈盞花提取物60 mg置50 mL三角錐形瓶中，精密加入75%的甲醇溶液20 mL，超聲振蕩(200 W,50 Hz)40 min,用0.45 μm的濾膜過濾，即得燈盞花提取物供試品溶液。

2.3 精密度試驗(yàn) 分別取第6批燈盞花藥材和第4批燈盞花提取物供試品溶液，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，每次5 μL，記錄所得到的色譜指紋圖譜，考察共有峰的相對保留時(shí)間，以燈盞花乙素色譜峰為參照，計(jì)算大于總峰面積10%的共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD值，結(jié)果表明，同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次的燈盞花藥材和提取物大于總峰面積10%共有峰的相對保留時(shí)間 RSD<2%、相對峰面積RSD<3%，表明該方法精密度良好。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取第6批燈盞花藥材和第4批燈盞花提取物，按2.2.2中供試品液制備方法分別制備6份供試品溶液，按2.1的色譜條件依次測定，記錄所得到的色譜指紋圖譜，考察共有峰的相對保留時(shí)間，以燈盞花乙素色譜峰為參照，計(jì)算大于總峰面積10%的共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD值，結(jié)果表明，燈盞花藥材和提取物各6份供試品溶液大于總峰面積10%共有峰的相對保留時(shí)間RSD<2%、相對峰面積RSD<3%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份第6批燈盞花藥材和第4批燈盞花提取物供試品溶液，按2.1的色譜條件，分別于不同的時(shí)間進(jìn)樣，記錄0、2、4、6、8、10、16、24 h所得到的色譜指紋圖譜，考察共有峰的相對保留時(shí)間，以燈盞花乙素色譜峰為參照，計(jì)算大于總峰面積10%的共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD值，結(jié)果表明，不同時(shí)間進(jìn)樣的燈盞花藥材和提取物大于總峰面積10%共有峰的相對保留時(shí)間 RSD<2%，相對峰面積RSD<3%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.6 指紋圖譜的建立 將10份燈盞花藥材的HPLC的指紋圖譜(見圖1)和8份燈盞花提取物的HPLC的指紋圖譜(見圖3)，分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(版本2004A)，經(jīng)軟件將指紋圖譜自動(dòng)匹配分析，分別生成燈盞花藥材對照指紋圖譜(見圖2)和燈盞花提取物對照指紋圖譜(見圖4)。

2.7 共有指紋峰的確定及結(jié)構(gòu)指認(rèn)

2.7.1 藥材共有指紋峰的確定 在燈盞花藥材的指紋圖譜中確定10個(gè)峰作為特征峰(見圖2)。通過與對照品對照，確定了燈盞花藥材中5號(hào)峰為燈盞花乙素，9號(hào)峰為燈盞花甲素，選取含量最高且為燈盞花指標(biāo)性成分的燈盞花乙素5號(hào)峰為參照色譜峰。

2.7.2 提取物共有指紋峰的確定 在燈盞花提取物的指紋圖譜中確定12個(gè)峰作為特征峰(見圖4)。通過與對照品對照，確定了燈盞花提取物中5號(hào)峰為燈盞花乙素，10號(hào)峰為燈盞花甲素，12號(hào)峰為野黃芩素，選取含量最高且為燈盞花指標(biāo)性成分的燈盞花乙素5號(hào)峰為參照色譜峰。

2.8 相似度的計(jì)算

2.8.1 燈盞花提取物的指紋圖譜相似度測定 將10批燈盞花藥材液相色譜圖與對照指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(版本2004B)進(jìn)行指紋圖譜測定(見圖1)，并計(jì)算相似度，評價(jià)燈盞花不同外購批次的質(zhì)量，計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 10批燈盞花藥材相似度表

2.8.2 燈盞花提取物的指紋圖譜測定 將8批燈盞花提取物液相色譜圖與對照指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(版本2004B)進(jìn)行指紋圖譜測定(見圖3)，并計(jì)算相似度，評價(jià)燈盞花提取物不同批次的質(zhì)量，計(jì)算結(jié)果見表3。結(jié)果表明，10 批燈盞花藥材和8批提取物的HPLC圖譜和HPLC對照指紋圖譜對比的相似度均高于 90%，表明 10 批市售燈盞花藥材和8批燈盞花提取物相似性良好，質(zhì)量較穩(wěn)定。

表3 8批燈盞花提取物相似度表

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對10批市售燈盞花藥材和8批燈盞花提取物進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，并分別確定了燈盞花藥材及其提取物中的共有色譜峰，標(biāo)定了燈盞花藥材和及其提取物中3個(gè)共有峰的結(jié)構(gòu)，通過方法學(xué)的考察，該方法的精密度較高，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可用于市售燈盞花藥材及其提取物的HPLC指紋圖譜測定，為今后其質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

流動(dòng)相考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-四氫呋喃-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%的醋酸銨水溶液(磷酸調(diào)PH至3)的溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明，流動(dòng)相系統(tǒng)為乙腈-0.1%醋酸銨溶液(磷酸調(diào)PH至3)系統(tǒng)梯度洗脫條件下基線平穩(wěn)，色譜峰分離度好，色譜峰保留時(shí)間適宜。

經(jīng)燈盞花藥材與其提取物HPLC對照指紋圖譜對比發(fā)現(xiàn)，燈盞花提取物對照指紋圖譜比燈盞花藥材對照指紋圖譜增加了7號(hào)和12號(hào)色譜峰，其中12號(hào)峰標(biāo)定為野黃芩素，其為燈盞花乙素的苷元，燈盞花藥材按2015版《中國藥典》一部中燈盞細(xì)辛顆粒標(biāo)準(zhǔn)制法提取，其提取方法為75%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇至稠膏狀，即得燈盞花提取物，可能該方法提取濃縮時(shí)間受熱較長，燈盞花乙素少量水解成野黃芩素，其它也有成分降解生成化合物7號(hào)峰。

由于生產(chǎn)用市售燈盞花藥材來源較廣，品質(zhì)參差不齊，為了科學(xué)評價(jià)不同批次外購的市售燈盞花藥材質(zhì)量的均一性，本實(shí)驗(yàn)所用藥材均為生產(chǎn)用燈盞花藥材，不同批次均從市場上采購而來，每批次采購量均較大，具有生產(chǎn)用燈盞花藥材的代表性。同時(shí)對燈盞花進(jìn)行提取，評價(jià)不同批次采購的市售燈盞花藥材提取物的均一性，結(jié)果表明10批市售燈盞花藥材及8批自提燈盞花提取物樣品相似性良好，質(zhì)量穩(wěn)定。