陳 賽, 李洪雷, 劉 娟, 李 飛

(1. 南京醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211166 ； 2. 南京醫(yī)科大學(xué) 康達(dá)學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

痛風(fēng)是由于長期體內(nèi)尿酸過多導(dǎo)致的尿酸單鈉晶體在關(guān)節(jié)沉積引起關(guān)節(jié)發(fā)炎的疾病[1]。高尿酸血癥是導(dǎo)致痛風(fēng)的主要因素，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界高尿酸血癥患者中大約有5 %～12 %的病人會(huì)轉(zhuǎn)化為痛風(fēng)患者[2]。并且隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，痛風(fēng)的發(fā)病率也在逐漸上升，而且發(fā)病年齡正在趨于年輕化[3]。當(dāng)關(guān)節(jié)處尿酸長時(shí)間處于高水平后，尿酸會(huì)不斷堆積，形成結(jié)晶，導(dǎo)致關(guān)節(jié)反復(fù)發(fā)炎疼痛甚至畸形。除此之外，高尿酸血癥還和代謝紊亂[4]、糖尿病[5]、慢性心力衰竭[6]、高血壓、心血管疾病[7]、腎疾病[8]、動(dòng)脈粥樣硬化[9]、癡呆[10]等有關(guān)。

Chart 1

目前上市的治療高尿酸血癥的藥物只有兩類，一類是：促進(jìn)尿酸排泄的藥，如：苯溴馬隆、丙磺舒等；另一類是抑制尿酸生成藥，如別嘌醇，非布司他，托比司他等(Chart 1)。目前對于非布司他結(jié)構(gòu)修飾的方法主要有3類：第一類是將五元噻唑環(huán)變成其他五元雜環(huán)如吡唑、咪唑、噻吩、三氮唑等[11-12]；第二類是將五元噻唑環(huán)變成其他六元雜環(huán)如吡啶、嘧啶等[13-14]；第三類是增加苯環(huán)與雜環(huán)之間的連接鍵如用酰胺鍵、醚鍵連接，如化合物(1～3)等[15-17](Chart 2)。結(jié)合非布司他的作用機(jī)制[18]以及現(xiàn)有對非布司他結(jié)構(gòu)修飾的方法，保留其整個(gè)噻唑環(huán)，在二位上引入氨基后與同樣具有治療高尿酸血癥的阿魏酸類[19]結(jié)構(gòu)形成酰胺結(jié)構(gòu)得到目標(biāo)化合物(Scheme 1)。

Chart 2

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

WRR型熔點(diǎn)儀；Bruker ARX-300型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent-1100 型質(zhì)譜儀；N4S型紫外可見分光光度計(jì)。

黃嘌呤氧化酶(西格瑪奧德里奇公司)；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)1的合成[20]

稱取N-溴代丁二酰亞胺1.78 g(10 mmol)和對甲苯磺酸10 mg溶解于30 mL二氯甲烷中。在冰浴下，加入乙酰乙酸乙酯1.3 g(10 mmol)，反應(yīng)0.5 h(TLC檢測)。反應(yīng)完成后，濃縮，得白色固體，100 mL石油醚萃取，過濾，濃縮得無色黏稠狀液體1.7 g，收率81 %。

(2)2的合成[21]

稱取2-溴乙酰乙酸乙酯2.09 g(10 mmol)和硫脲0.76 g(10 mmol)溶解于15.4 mL水中，55 ℃反應(yīng)4 h(TLC檢測)。反應(yīng)結(jié)束后，加水稀釋，氨水調(diào)節(jié)pH至有固體析出，過濾，干燥，得白色固體1.7 g，收率90 %， m.p.170～173 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.71(s, NH2), 4.14(dd,J=5.0 Hz, 10.0 Hz, 2H), 2.85(s, 3H), 1.22(t,J=5.0 Hz, 10.0 Hz, 3H)。

Scheme 1

(3)3a～3n的合成通法[22]

稱取取代苯甲醛10 mmol和丙二酸3.12 g(30 mmol)溶解于6 mLN,N-二甲基甲酰胺和1 mL吡啶的混合溶液中，90 ℃反應(yīng)4 h(TLC檢測)。反應(yīng)結(jié)束后，加水15 mL，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH到1，冷卻至0 ℃后有白色固體析出，過濾，冷水洗滌兩次，烘干，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率60%～83%。

(4) 4a～4n的合成通法[16]

稱取取代肉桂酸1 mmol和2-氨基-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯0.186 g(1 mmol)溶解于10 mL吡啶中，冰浴下加入三氯氧磷0.5 mL后繼續(xù)攪拌30 min，恢復(fù)至室溫，繼續(xù)反應(yīng)5 h(TLC檢測)。反應(yīng)結(jié)束后，加入800 mL冰水，待冰完全融化后，過濾，得目標(biāo)產(chǎn)物，收率為20%～50%。

(5) 5a～5n的合成通法[17]

稱取2-取代肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯0.2 mmol溶解于6 mL混合溶劑中(乙醇/水=2/1,V/V)，加入氫氧化鈉0.16 g(4 mmol)，55 ℃反應(yīng)2 h(TLC檢測)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓除去溶劑，二氯甲烷萃取，分離水層后過濾，濾液用1 M的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，有固體析出，過濾，即得目標(biāo)產(chǎn)物。

3,4,5-三甲氧基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5a)： 棕色固體，收率77%, m.p.255～258 ℃；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.54(brs, COOH), 7.71(d,J=15.7 Hz, 1H), 6.99(s, 2H), 6.86(d,J=15.8 Hz, 1H), 3.84(s, 6H), 3.72(s, 3H), 3.46(brs, NH), 2.55(s, 3H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.33, 164.11, 159.72, 156.06, 153.59, 143.78, 140.07, 130.20, 118.86, 116.11, 106.08, 60.62, 56.41, 17.41; MS(ESI)m/z: 379.1{[M+H]+}。

肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5b)： 棕色固體，收率37%， m.p.253～256 ℃；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.38(brs, COOH), 7.78(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.65(dd,J=7.5 Hz, 1.9 Hz, 2H), 7.50～7.45(m, 3H), 6.90(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.40(brs, NH), 2.56(s, 3H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.24, 164.11, 159.74, 156.04，143.68，134.61, 131.01, 129.57, 128.57, 119.54, 116.19, 17.41; MS(ESI)m/z: 289.1{[M+H]+}。

2-硝基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5c)： 棕色固體，收率69%， m.p.261～263 ℃；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.82(brs, COOH), 8.12(d,J=10.0 Hz, 1H), 8.05(d,J=15.7 Hz, 1H), 7.85(m, 1H), 7.80(d,J=5.0 Hz, 1H), 7.71(m, 1H), 6.86(d,J=15.6 Hz, 1H), 3.44(brs, NH), 2.56(s, 3H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.05, 163.54, 159.51, 156.03, 148.73, 138.98, 134.61, 131.48, 130.10, 129.44, 125.35, 124.08, 116.49, 17.39; MS(ESI)m/z: 334.0{[M+H]+}。

3,4-二氯肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5d)： 棕色固體，收率50%， m.p.252～257 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.67(brs, COOH), 7.93(d,J=5.0 Hz, 1H), 7.77(s, 1H), 7.75～7.72(m, 1H), 7.64(m, 1H), 6.93(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.40(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.06, 163.83, 159.57, 155.90, 140.92, 135.49, 133.30, 131.71, 130.58, 128.02, 121.76 , 119.60, 116.44, 17.47; MS(ESI)m/z: 357.0{[M+H]+}。

4-硝基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5e)： 棕色固體，收率50%， m.p.280～281 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.81(brs, COOH), 8.31(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.91(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.88(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.05(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.49(brs, NH), 2.56(s,3H)；13C NMR(125 MHz, MHz, DMSO-d6)δ: 164.07, 163.65, 159.54, 156.34, 148.55, 141.09, 141.04, 129.64, 124.72, 123.66, 116.46, 17.40; MS(ESI)m/z: 334.0{[M+H]+}。

4-溴肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5f)： 棕色固體，收率61%， m.p.255～258 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.70(brs, COOH), 7.75(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.68(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.60(d,J=8.5 Hz, 2H), 6.91(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.64(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 164.09, 159.67, 156.03, 143.09, 142.36, 133.90, 132.57, 130.46, 124.30, 120.34, 116.25, 17.40; MS(ESI)m/z: 367.0{[M+H]+}。

4-氯肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5g)： 棕色固體，收率74%， m.p.264～268 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.69(brs, COOH), 7.77(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.67(d,J=8.5 Hz, 1H), 7.54(d,J=8.5 Hz, 1H), 6.89(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.46(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.09, 164.06, 159.68, 156.03, 142.26, 135.45, 133.56, 130.25, 129.64, 120.28, 116.25, 17.40; MS(ESI)m/z: 323.0{[M+H]+}。

3-溴肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5h)： 棕色固體，收率63%， m.p.262～264 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.67(brs, COOH), 7.86(s, 1H), 7.75(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.65(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.44(t,J=7.5 Hz, 1H), 6.92(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.38(brs, NH), 2.56(s, 3H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.08, 163.92, 159.62, 156.04, 141.93, 137.15, 133.44, 131.65, 131.20, 127.22, 122.81, 121.20, 116.30, 17.40; MS(ESI)m/z: 367.0{[M+H]+}。

3-氯肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5i)： 棕色固體，收率68%， m.p.260～263 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.68(brs, COOH), 7.76(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.72(s, 1H), 7.64～7.60(m, 1H), 7.53～7.49(m, 2H), 6.92(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.40(brs, NH), 2.56(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.08, 163.94, 159.62, 156.03, 142.00, 136.88, 134.25, 131.39, 130.54, 128.33, 126.85, 121.22, 116.30, 17.39; MS(ESI)m/z: 323.0{[M+H]+}。

2-溴肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5j)： 棕色固體，收率81%， m.p.254～256 ℃；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.78(brs, COOH), 7.98(d,J=15.7 Hz, 1H), 7.76～7.74(m, 2H), 7.51(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.40(td,J=5.0 Hz, 1.5 Hz, 1H), 6.90(d,J=15.7 Hz, 1H), 3.39(brs, NH), 2.56(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.07, 163.73, 159.58, 156.04, 141.19, 134.13, 133.87, 132.56, 128.98, 128.42, 125.17, 122.74, 116.43, 17.40; MS(ESI)m/z: 366.9{[M+H]+}。

2-氯肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5k)： 棕色固體，收率33%， m.p.254～256 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.79(brs, COOH), 8.02(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.78～7.74(m, 1H), 7.60～7.57(m, 1H), 7.50～7.46(m, 1H), 6.95(d,J=15.8 Hz, 1H), 3.41(brs, NH), 2.56(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.06, 163.80, 159.58, 156.04, 139.14, 138.55, 134.28, 132.39, 130.64, 128.43, 128.38, 122.66, 116.41, 17.40; MS(ESI)m/z: 323.0{[M+H]+}。

4-甲氧基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5l)： 棕色固體，收率42%， m.p.274～277 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.55(brs, COOH), 7.73(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.03(d,J=8.8 Hz, 2H), 6.74(d,J=15.8 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.40(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.51, 164.15, 161.70, 159.89, 156.05, 143.53, 130.39, 127.21, 116.81, 116.02, 115.06, 55.85, 17.41; MS(ESI)m/z: 319.1{[M+H]+}。

3-硝基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5m)： 棕色固體，收率65%， m.p.268～271 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.73(brs, COOH), 8.48(t,J=1.7 Hz, 1H), 8.28(dd,J=10.0 Hz, 1.5 Hz, 1H), 8.10(d,J=7.5 Hz, 1H), 7.91(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.77(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.07(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.59(brs, NH), 2.56(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.06, 163.76, 159.53, 156.05, 148.77, 141.17, 136.44, 134.58, 131.13, 125.11, 122.81, 122.42, 116.39, 17.39; MS(ESI)m/z: 334.0{[M+H]+}。

2-甲氧基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5n)： 棕色固體，收率53%， m.p.271～273 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.64(brs, COOH), 7.93(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.58(dd,J=7.7 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.47～7.42(m, 1H), 7.13(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.04(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.02(d,J=15.2 Hz, 1H), 3.90(s, 3H), 3.57(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.72, 164.12, 159.84, 158.62, 156.04, 138.87, 132.52, 129.39, 122.96, 121.28, 120.02, 116.09, 112.37, 56.15, 17.42; MS(ESI)m/z: 319.1{[M+H]+}。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物活性

黃嘌呤可以被黃嘌呤氧化酶催化產(chǎn)生尿酸，而尿酸在295 nm處會(huì)有紫外吸收，所以通過檢查295 nm的吸收度值就可以算出尿酸的生成量。25 ℃下，吸取磷酸鹽緩沖液3 Ml, 100 μL黃嘌呤氧化酶溶液和50 μL溶解在DMSO中的各種待測化合物(100 μg/mL)，孵育10 min。然后向反應(yīng)體系中加入配置好的黃嘌呤溶液200 μL。最后在292 nm處記錄吸光值，記錄10 min,計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化[23]。測試結(jié)果如下表：

表1 目標(biāo)化合物的抑制率

2.2 分子對接

化合物5l與非索布坦在黃嘌呤氧化酶(PDB: 1FIQ)對接結(jié)果如圖1所示：化合物5l與非索布坦分子在黃嘌呤氧化酶的疏水口袋作用方向基本一致，但是它們與氨基酸的結(jié)合情況有所不同。其中化合物5l化合物與氨基酸殘基Pro-400、 Lys-256、 Leu-257、 Val-258、 Val-259、 Ile-264和Gly-260產(chǎn)生相互作用。非布索坦與氨基酸殘基Leu-404、 Gly-260、 Ser-347、 Val-259、 Ala-346、 Thr-262、 Leu-257和Ile-353產(chǎn)生相互作用。

共合成了14個(gè)化合物，但活性均低于陽性對照。結(jié)合活性測試結(jié)果和分子對接情況，原因可能有兩點(diǎn)：一是合成的化合物數(shù)量太少，取代基的種類太少；二是苯環(huán)和噻唑環(huán)之間的連接鏈太長可能超過了黃嘌呤氧化酶的疏水空腔。

圖1化合物5l與非布司他活性位點(diǎn)重疊圖

本文基于現(xiàn)有藥物非布索坦和天然產(chǎn)物查爾酮、肉桂酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過藥物拼接原理，在非布索坦藥效團(tuán)噻唑環(huán)2位氨基上引入不同取代基的肉桂酸得到了肉桂酰胺類化合物共計(jì)14個(gè)，結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H-NMR、13C-NMR和MS確證。對所合成的化合物進(jìn)行了體外XO抑制活性測試，結(jié)果表明，多個(gè)化合物顯示出一定的XO抑制活性，但活性均低于對照組臨床藥物別嘌醇，結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)，分析活性數(shù)據(jù)，初步構(gòu)效關(guān)系分析，肉桂酸連接取代基活性4位>2位>3位。當(dāng)向肉桂酸4位引入取代基甲氧基、硝基后，抑制率分別為64.91 %和64.33 %。