江倩倩, 邵福平, 張孟孟, 楊 曄,2,3, 尹登科,2,3

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012； 2. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；3. 安徽省教育廳 現(xiàn)代藥物制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012)

光動(dòng)力療法(Photodynamic Therapy， PDT)是一種新興的癌癥治療技術(shù)[1-3]，它是指在特定波長(zhǎng)的光照射下，光敏劑將光能轉(zhuǎn)移給組織氧，產(chǎn)生以單線態(tài)氧為主的活性氧物質(zhì)(Reactive Oxygen Species， ROS)進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程[4-7]。其治療效果主要受腫瘤部位氧氣濃度的影響，然而，大多數(shù)腫瘤組織的乏氧性質(zhì)極大地限制了PDT的效率[8-10]，并且腫瘤在缺氧過程中，會(huì)產(chǎn)生H2O2等不良代謝物，這些代謝物會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[11]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)[12-14]，過氧化氫酶及部分金屬化合物可通過催化腫瘤微環(huán)境中的H2O2，實(shí)現(xiàn)催化產(chǎn)氧，改善光動(dòng)力治療效果。另外，由于以5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉為配體制備的金屬-有機(jī)框架(Metal-Organic Frameworks，MOFs)具有光敏性好，熱穩(wěn)定，不易淬滅等特點(diǎn)，也常被用于光動(dòng)力治療中[15-17]。

因此，本文以5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉為原料，采用分層法與溶劑熱法分別制備MOF1和MOF2，對(duì)其結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行表征。并將其應(yīng)用于腫瘤光動(dòng)力治療中，考察兩種材料對(duì)內(nèi)源性H2O2的催化產(chǎn)氧作用，及在光動(dòng)力作用下對(duì)4T1細(xì)胞的抑制作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SPECORD S600型紫外可見分光度計(jì)；Thermo Fisher Nicolet 6700型紅外光譜儀(KBr壓片)；PHILIPS PANalytical X’Pert 型X-射線衍射儀；Hitachi HT-7700型透射電子顯微鏡；Sirion 200型掃描電子顯微鏡。

5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉，鄭州艾克姆化工有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成制備

(1) 分層法制備MOF1[18]

稱取氯化銅85.24 mg(0.5 mmol)加至50 mL甲醇中，再稱取H2TPyP 70 mg(0.1 mmol)加至50 mL氯仿中溶解后，各取10 mL混合均勻，室溫下避光反應(yīng)24 h。離心15 min，真空干燥得紫紅色粉末狀MOF1 12.13 mg，收率89.2%；UVλmax: 424, 555, 594 nm; IRν: 3090(C—H), 2920(C—H), 1610(C=C), 1350(C=N), 972(Cu—N), 815(C—H), 715(C—H) cm-1; 晶胞參數(shù)a=13.636(3) ?,b=13.636(3) ?,c=19.467(4) ?,α=90°,β=90°,γ=90°。

(2) 溶劑熱法制備MOF2[19]

稱取H2TPyP 618 mg(0.1 mmol)與乙酸銅一水合物1.0 g(0.5 mmol)溶于50 mL乙酸中，125 ℃恒溫回流6 h。蒸發(fā)除溶劑后，將所得混合物加入50 mL水中，室溫?cái)嚢?0 min并加入0.5 mL吡啶。經(jīng)三氯甲烷多次萃取，水浴蒸干即得紫紅色粉末狀MOF2 65.07 mg，收率95.7%；UVλmax: 420, 540, 587.5; IRν: 3320(—CH3), 3020(C—H), 2923(C—H), 1590(C=C), 1350(C=N), 970(Cu—N), 810(C—H), 725(C—H) cm-1; 晶胞參數(shù)a=b=96.3568 ?,c=12.9808 ?,α=90°,β=90°,γ=120°。

1.3 催化過氧化氫

37℃下在含H2O2(20 mmol·L-1)的Tris-HCl緩沖液(pH=7.4， 10 mmol·L-1)中加入MOF1和MOF2粉末(300 μg·mL-1)。分別在0、 10、 20、 30、 60和90 min時(shí)，將混合物離心，取上清液置于石英比色皿中，使用紫外全波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 1O2的制備

精密稱取DPBF 0.15 mg，溶解于0.5 mL DMSO中。用脫氣處理后的19.5 mL Tris-HCl(pH=7.4， 10 mmol·L-1)將DPBF溶液稀釋至7.5 μg·mL-1。再將10 mg MOF1和MOF2粉末分別加入含DPBF的Tris-HCl緩沖液中，超聲分散。以同等體積的DMSO與Tris-HCl緩沖液混合制備參比溶液進(jìn)行校零。

經(jīng)532 nm的激光照射0、 30、 60、 90、 120和150 s后取樣，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)350 ～ 500 nm處DPBF的吸光度。

1.5 細(xì)胞毒性

采用MTT法測(cè)試了材料在523 nm的激光照射(200 mW·cm-2， 10 min)下對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)的光動(dòng)力作用[20]。

1.6 ROS生成

采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽作為熒光探針對(duì)銅卟啉金屬有機(jī)框架細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生能力的考察。以 2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度將4T1細(xì)胞接種于鋪有無(wú)菌細(xì)胞爬片的24孔板中，分別設(shè)置對(duì)照組、MOF1組、MOF2組、MOF1+H2O2(1 mM)組、MOF2+H2O2(1 mM)組。培養(yǎng)24 h后，移去原培養(yǎng)基，加入相應(yīng)制劑繼續(xù)孵育24 h。棄去原培養(yǎng)基, 每孔再加入 DCFH-DA 溶液(1 mL, 10 μM)孵育30 min，經(jīng)532 nm激光照射(200 mW·cm-2， 2 min)后，PBS清洗3遍，用多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后，DAPI染核5 min ，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，并用ImageJ軟件分析細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅卟啉金屬有機(jī)框架物

由銅卟啉金屬有機(jī)框架的紅外光譜可見，H2TPyP在3347 cm-1有卟吩環(huán)上的N—H伸縮振動(dòng)吸收峰，MOF1與MOF2中無(wú)此吸收峰，這是由Cu2+與H2TPyP配位取代了卟吩內(nèi)環(huán)上的兩個(gè)H所致。另外，由于金屬離子進(jìn)入卟啉環(huán)內(nèi)形成配合物后，卟啉環(huán)上的對(duì)稱性提高，MOF1、 MOF2相對(duì)于H2TPyP來說，其紫外光譜表現(xiàn)為Q帶吸收峰的個(gè)數(shù)減少，Soret帶發(fā)生紅移。

圖1(A～B)MOF1和MOF2的TEM圖；(C～D)MOF1和MOF2的SEM圖

從TEM和SEM的結(jié)果(見圖1和圖2)可看出，MOF1呈八面體狀，粒徑約為100 nm， MOF2呈厚片狀，尺寸約為1 μm。

2.2 銅卟啉金屬有機(jī)框架催化過氧化氫的能力

為考察MOF1和MOF2是否能夠催化過氧化氫產(chǎn)生氧氣。分別在H2O2中加入相同量的MOF1和MOF2，反應(yīng)一段時(shí)間后，測(cè)定兩組剩余的H2O2紫外吸收。結(jié)果見圖2，加入銅卟啉金屬有機(jī)框架后，隨著時(shí)間的增加，H2O2紫外吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，且MOF1的降低程度均大于MOF2。結(jié)果表明，銅卟啉金屬有機(jī)框架具有催化H2O2分解生成O2的能力，且MOF1催化H2O2的能力大于MOF2。

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2.3 銅卟啉金屬有機(jī)框架在光照下產(chǎn)生1O2的能力

DPBF是一種1O2捕獲劑，當(dāng)被1O2氧化后，其在426 nm左右的吸光度顯著降低，故目前被廣泛用于衡量產(chǎn)生1O2的能力(圖3)， 150 s內(nèi)MOF1組吸光度值降低了0.2950而MOF2組吸光度值降低了0.1689。結(jié)果表明：MOF1和MOF2均可通過催化H2O2產(chǎn)氧來增強(qiáng)1O2的生成能力，且MOF1的催化能力更強(qiáng)。

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2.4 銅卟啉金屬有機(jī)框架對(duì)4T1的細(xì)胞毒性

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，對(duì)材料組添加光照后，隨著其濃度的增加，MOF1或MOF2的細(xì)胞毒性均逐漸增強(qiáng)，且當(dāng)濃度 ≥12.5 μg·mL-1，MOF1的細(xì)胞光毒性大于MOF2(P<0.001)。

2.5 銅卟啉金屬有機(jī)框架細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生能力

DCFH-DA是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的熒光探針，其本身沒有熒光，可自由穿過細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞后，可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH，而DCFH無(wú)法透過細(xì)胞膜，因此易積聚在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的ROS可將無(wú)熒光的DCFH 氧化生成有綠色熒光的DCF。由于細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度較低，為方便對(duì)比催化效果，實(shí)驗(yàn)時(shí)添加了外源H2O2。如圖5所示，MOF1+H2O2組、MOF2+H2O2組有較強(qiáng)的綠色熒光，且前者熒光強(qiáng)度大于后者(P<0.001)。說明加入的銅卟啉金屬有機(jī)框架主要是通過催化H2O2來提高細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生水平，且MOF1催化H2O2能力大于MOF2。

μg/mL圖4MOF1和MOF2在有無(wú)光照時(shí)對(duì)4T1細(xì)胞活力的影響作用。

以5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉為原料，采用分層法與溶劑熱法制備了兩種銅卟啉金屬有機(jī)框架材料(MOF1和MOF2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：兩種材料均具有過氧化氫催化能力，可有效改善4T1細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，且在光動(dòng)力作用下MOF1對(duì)4T1細(xì)胞的毒性作用強(qiáng)于MOF2(P<0.001)。