王莉潔，韓 曦 ，鄭 霞，周園園，侯惠蓮 ，陳 葳，李 旭 ，趙 樂

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院1轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，5婦產(chǎn)科，6病理科，7檢驗科，8陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點實驗室，陜西 西安710061；2蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦科，甘肅 蘭州 730030；3陜西省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710068；4浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 杭州 310009

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤［1］。因卵巢位于盆腔深部、卵巢癌早期無特異性的癥狀和體征，加之缺乏有效的早期篩查方法和特異的診斷指標(biāo)，導(dǎo)致卵巢癌難以被早期發(fā)現(xiàn)，約三分之二的卵巢癌患者于中晚期才被確診［2］。目前，晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為15%～45%［3］。因此，改善晚期卵巢癌患者的預(yù)后是亟待解決的醫(yī)學(xué)問題。篩選獲得靶向關(guān)鍵分子的卵巢癌治療新藥將是改善卵巢癌患者治療效果的一個重要途徑。

人參皂苷是人參具有藥物活性的精華成分［4］。目前已分離獲得70種以上的人參皂苷單體，包括Ra1-3、Rb1-3、Rg1、Rg3、Rh1等［5］。其中Rg3的抗腫瘤活性吸引了眾多注目，已報道Rg3在膠質(zhì)瘤［6］、結(jié)腸癌［7］、肺癌［8］、前列腺癌［9］、乳腺癌［10］、宮頸癌［11］、卵巢癌［12］等多種腫瘤中具有抗腫瘤作用。Rg3根據(jù)第20位碳原子（C20）上羥基的空間位置而分為20(S)-Rg3和20(R)-Rg3兩個同型異構(gòu)體［13］。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，20(S)-Rg3通過上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中的von Hippel-Lindau（VHL）的表達(dá)而減弱卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［12］。VHL的一個重要功能是介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解［14］。常氧下，HIF-1α的關(guān)鍵脯氨酸殘基由脯氨酸羥化酶區(qū)域蛋白羥基化，使得HIF-1α被VHL/E3泛素連接酶復(fù)合物識別，進(jìn)而被多泛素化并被26S蛋白酶體降解［15］。VHL基因失活則使得HIF-1α蓄積，進(jìn)而促進(jìn)VEGF、TGF-α等細(xì)胞因子表達(dá)，加快細(xì)胞能量代謝、血管生長等過程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［16］。VHL基因的失活機(jī)制主要包括基因突變、雜合性缺失和基因啟動子區(qū)的甲基化［17-18］。但是，20(S)-Rg3上調(diào)抑癌基因VHL的機(jī)制尚不明確。

本研究從DNA甲基化這一轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控機(jī)制入手，發(fā)現(xiàn)20(S)-Rg3通過下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A而削弱了其介導(dǎo)的VHL基因啟動子區(qū)甲基化，使得VHL表達(dá)水平升高，為20(S)-Rg3能成為治療卵巢癌的新型藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；人參皂苷20(S)-Rg3（天士力制藥集團(tuán)股份有限公司）；1640培養(yǎng)基（GIBCO）；5-Aza-CdR（Sigma）；DNMT3A過 表 達(dá) 載 體（Addgene）［19］。 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 試 劑 X-tremeGENE HP（Roche）；基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技）；EZ-DNA Methylation-Direct試劑盒（Zymo Research）；RNA提取試劑盒RNAfast 200（上海飛捷生物）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid first strand cDNA synthesis Kit（Thermo Fisher）；甲基化PCR試劑盒Epi Taq HS和real-time PCR試劑SYBR Green Master Mix（TaKaRa）；小鼠抗人β-actin多克隆抗體、兔抗人VHL多克隆抗體、兔抗人DNMT3A單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；HRP-羊抗兔/鼠IHC二抗試劑盒（福州邁新生物技術(shù)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與20(S)-Rg3處理

SKOV3細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2、100%濕度的條件下培養(yǎng)。種板后24 h使細(xì)胞密度達(dá)到50%，更換新的完全培養(yǎng)基，并加入終濃度為80 μg/mL的20(S)-Rg3，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取總DNA、RNA或48h后提取總蛋白備用。

1.3 使用5-Aza-CdR處理細(xì)胞

3×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后細(xì)胞匯合度達(dá)到40%～50%時加5-Aza-CdR儲存液（10mmol/L）使其終濃度分別達(dá)到1、2或5 μmol/L。放入37℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h提取總RNA。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

4×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，約24h后細(xì)胞匯合度達(dá)70%時按照X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。每孔使用轉(zhuǎn)染試劑6 μL，質(zhì)粒2 μg。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h提取總RNA，72h提取總蛋白。

1.5 DNA提取、重亞硫酸鹽處理和甲基化特異性PCR（MSP）

利 用 MethPrimer（http://www.urogene.org/methprimer/）獲取VHL基因啟動子區(qū)的CpG島信息，并設(shè)計MSP引物（序列信息見表1）。提取基因組DNA后，用EZ DAN Methylation-Direct Kit進(jìn)行DNA重亞硫酸鹽處理及純化回收。按下列體系進(jìn)行MSP反應(yīng)：Epi Taq HS 0.1 μL，10×Epi Taq PCR Buffer 2 μL，dNTP mixture 2.4 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，硫化的DNA＜40 ng，滅菌水補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件：94℃ 5 min，之后 94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72℃30 s，32個循環(huán)，之后72℃10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與real-time PCR

按照RNAFast200試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。核酸蛋白濃度分析儀檢測RNA濃度和A260/280比值。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid first strand cDNA synthesis Kit進(jìn)行 RNA 反轉(zhuǎn)錄：總 RNA 2 μg，random hexamer primer1 μL，用nuclease-free water補(bǔ)足體積到12 μL，在PCR儀中65℃5 min，然后冰上急冷5 min；再加入5×Reaction Buffer 4 μL，dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，將PCR管放入預(yù)熱的PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件25℃5 min，42℃60min，70℃5min。將得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。按照SYBR Green Master Mix說明書進(jìn)行realtime PCR反應(yīng)：2×SYBRP remix Ex Taq10μL，10μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA1 μL，滅菌水7.4 μL，realtime PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30 s，然后95℃5 s、60℃30 s，重復(fù)40個循環(huán)，之后接熔解曲線條件。采用CFX-96 real-time PCR system（Bio Rad）軟件通過2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.7 Westernblotting

提取總蛋白，BCA法定量，蛋白變性后按照每孔30 μg進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，320 mA轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜（均為1∶1000），二抗室溫孵育1h（1∶2000），化學(xué)發(fā)光。

1.8 20(S)-Rg3治療的裸鼠皮下移植瘤組織以及對照組織切片的制備

課題組前期進(jìn)行了20(S)-Rg3治療裸鼠皮下移植瘤的實驗［12］，在裸鼠左前肢背側(cè)皮下接種SKOV3細(xì)胞懸液0.1 mL（2×106個），10 d后腫瘤體積大于10 mm3時隨機(jī)將裸鼠分成對照組和20(S)-Rg3干預(yù)組，后續(xù)30 d中干預(yù)組隔天尾靜脈注射5 mg/kg的20(S)-Rg3，對照組則尾靜脈注射相同體積的PBS。觀察結(jié)束時頸椎脫臼處死裸鼠，剝離腫瘤，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片。

1.9 免疫組織化學(xué)

石蠟脫蠟、水化，高壓抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：VHL和DNMT3A以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性。

1.10 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組之間差異比較采用獨立樣本雙側(cè)t檢驗。甲基化特異PCR結(jié)果采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20(S)-Rg3上調(diào)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的VHL表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，相對于對照細(xì)胞，終濃度80 μg/mL的20(S)-Rg3處理24 h后卵巢癌細(xì)胞SKOV3的VHLmRNA水平顯著升高（圖1A）。與mRNA水平的變化一致，Western blotting結(jié)果顯示，20(S)-Rg3令SKOV3細(xì)胞的VHL蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)（圖1B）。

圖1 20(S)-Rg3上調(diào)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的VHLFig.1 20(S)-Rg3 upregulates VHL in ovarian cancer cell line SKOV3.A:Real-time PCR shows elevatated VHL mRNA levelin 20(S)-Rg3-treated cells;B:Western blotting shows increased VHL protein level in20(S)-Rg3-treated cells.*P＜0.05.

2.2 20(S)-Rg3降低卵巢癌細(xì)胞中VHL基因啟動子區(qū)的甲基化水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中VHL的mRNA水平隨著DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）處理濃度的增加而升高（圖2A）。調(diào)取VHL基因序列上游3000個堿基作為其啟動子區(qū)域，采用MethPrimer在線分析發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域存在CpG島（圖2B）。甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果顯示，20(S)-Rg3處理后卵巢癌細(xì)胞SKOV3的VHL啟動子區(qū)甲基化水平下降（圖2C）。

圖2 20(S)-Rg3降低VHL基因啟動子區(qū)的甲基化水平Fig.2 20(S)-Rg3 reduces methylation level in VHL gene promoter.A:Real-time PCR shows increased VHL mRNA level in 5-Aza-CdR-treated SKOV3 cells;B:The promoter region of VHL gene is predicted to contain CpG islands;C:MSP results show significantly decreased methylation level in the promoter region of VHL gene by 20(S)-Rg3.U=Unmethylated.M=Methylated.*P＜0.05.

2.3 20(S)-Rg3通過下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A表達(dá)而增強(qiáng)VHL的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，在用20(S)-Rg3處理卵巢癌細(xì)胞SKOV3后，DNMT3A的RNA水平下降、DNMT3B的RNA水平略有升高，但DNMT1的RNA水平無顯著變化（圖3A）。Western blotting結(jié)果顯示DNMT3A的蛋白水平明顯降低，而DNMT3B和DNMT1蛋白水平無明顯變化（圖3B）。在卵巢癌細(xì)胞SKOV3中過表達(dá)DNMT3A以及過表達(dá)DNMT3A同時用20(S)-Rg3處理，real-time PCR和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，單純過表達(dá)DNMT3A后VHL的mRNA和蛋白水平均較對照組下降，DNMT3A過表達(dá)拮抗了20(S)-Rg3上調(diào)VHL表達(dá)的作用（圖3C、D）。MSP結(jié)果顯示單純過表達(dá)DNMT3A后，VHL基因啟動子區(qū)的甲基化水平升高（圖3E）。

圖3 20(S)-Rg3通過抑制DNMT3A介導(dǎo)的DNA甲基化而上調(diào)VHLFig.3 20(S)-Rg3 upregulates VHL via suppressing DNMT3A-mediated methylation in the promoter region of VHL gene.A:Real-time PCR results show that 20(S)-Rg3 treatment decreases DNMT3A mRNA level and increases DNMT3B mRNA level without affecting DNMT1 mRNAin the cells;B:Western blotting results show that 20(S)-Rg3 treatment decreases DNMT3A and increases DNMT3B protein expressions without affecting DNMT1 expression in the cells;C:Real-time PCR shows reduced VHL mRNA level in 20(S)-Rg3-treated cells overexpressing DNMT3A;D:Western blotting results show lowered VHL protein expression in 20(S)-Rg3-treated cells overexpressing DNMT3A;E:MSP results show increased methylation level in the promoter region of VHL gene in 20(S)-Rg3-treated cells overexpressing DNMT3A.U=Unmethylated.M=Methylated.Ns:non-significant;*P＜0.05.

2.4 免疫組化檢測

采用免疫組織化學(xué)檢測組織中VHL和DNMT3A的表達(dá)結(jié)果顯示，相對于對照組，20(S)-Rg3治療過的移植瘤組織中VHL表達(dá)升高而DNMT3A表達(dá)降低（圖4）。

圖4 20(S)-Rg3治療的SKOV3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤組織中VHL表達(dá)增強(qiáng)而DNMT3A表達(dá)減弱Fig.4 Immunohistochemical staining showing increased VHL and lowered DNMT3A expressions in subcutaneous tumors derived SKOV3 cells in 20(S)-Rg3-treated nude mice(Original magnification,×200;insets,×400).

3 討論

本研究證實20(S)-Rg3下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中DNMT3A的蛋白水平，從而抑制其介導(dǎo)的VHL基因啟動子甲基化，促進(jìn)VHL的表達(dá)。

20(S)-Rg3抑制卵巢癌細(xì)胞惡性表型的重要機(jī)制之一為上調(diào)抑癌基因VHL基因，但相關(guān)分子機(jī)制不明［12,20］。在卵巢癌細(xì)胞中，20(S)-Rg3在mRNA水平即上調(diào)VHL，提示VHL mRNA轉(zhuǎn)錄增多或降解減少，相關(guān)調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平，如啟動子CpG島甲基化、非編碼RNA等表觀遺傳調(diào)控或轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等。5-Aza-CdR升高VHLmRNA水平的現(xiàn)象反映出VHL受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的負(fù)調(diào)控，而當(dāng)使用20(S)-Rg3處理后，哺乳動物體內(nèi)3種主要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中，僅催化從頭甲基化的DNMT3A表達(dá)下降，而維持DNA甲基化的DNMT1和催化從頭甲基化的DNMT3B表達(dá)無變化，提示20(S)-Rg3導(dǎo)致的人卵巢癌細(xì)胞VHL表達(dá)上調(diào)可能與DNMT3A有關(guān)。實驗結(jié)果證實了20(S)-Rg3下調(diào)DNMT3A蛋白水平、抑制其介導(dǎo)的DNA甲基化這一表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，最終促進(jìn)了VHL表達(dá)。這與研究報道的腫瘤中VHL的低表達(dá)與啟動子區(qū)異常高甲基化相關(guān)的結(jié)果相符［21-22］。DNMT3A在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用，其在卵巢癌組織中異常高表達(dá)，參與促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等［23］。下調(diào)DNMT3A蛋白水平是20(S)-Rg3抑制卵巢癌細(xì)胞惡性表型的另一重要機(jī)制。20(S)-Rg3不影響DNMT1和DNMT3B的表達(dá)，僅下調(diào)DNMT3A，顯示20(S)-Rg3對DNMT3A的抑制作用具有一定的特異性。文獻(xiàn)報道DNMT3A的蛋白表達(dá)水平受到microRNA的負(fù)調(diào)控［24-26］，同時其蛋白穩(wěn)定性受到泛素-蛋白酶體途徑的調(diào)控［27-28］。我們已獲得了20(S)-Rg3影響的卵巢癌細(xì)胞microRNA表達(dá)譜，但尚未鑒定到靶向抑制DNMT3A的microRNA［29］。有關(guān)20(S)-Rg3降低DNMT3A蛋白水平的機(jī)制有待探討。此外，我們前期發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞中DNMT3A通過介導(dǎo)microRNA前體基因啟動子區(qū)甲基化而抑制部分具有抑癌作用的microRNA包括miR-532-3p、miR-603等的表達(dá)，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［29-32］，本研究獲得的DNMT3A抑制VHL表達(dá)的證據(jù)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步豐富了DNMT3A促癌作用的分子機(jī)制。

綜上，人參皂苷20(S)-Rg3通過削弱DNMT3A介導(dǎo)的啟動子甲基化而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中VHL的表達(dá)，這一結(jié)果拓展了對20(S)-Rg3抗卵巢癌分子機(jī)制的認(rèn)識，為20(S)-Rg3成為臨床治療卵巢癌的候選藥物提供了一定的理論依據(jù)。