孫紅娟，陳 仲，賀 迪，高 杉，王 擺，關曉燕，蔣經偉，董 穎，周遵春

(1.遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧省海洋水產分子生物學重點試驗室，遼寧 大連 116023； 2.凌海市達蓮海珍品養(yǎng)殖有限責任公司，遼寧 錦州 121209 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動物門、海參綱、仿刺參屬，代表著原始后口動物，在進化和發(fā)育生物學研究中占據重要地位[1]。仿刺參生活在潮間帶泥沙底質區(qū)域，周圍環(huán)境中存在大量的病原體，這表明機體已經進化形成一套有效的免疫系統(tǒng)。無脊椎動物依賴于先天性免疫系統(tǒng)參與免疫反應，主要通過細胞表面的模式識別受體(PRR)特異地識別病原相關分子模式(PAMP)，如蛋白質、糖類、脂質、核酸和這些生物大分子的衍生物[2]。Toll樣受體(TLR)是一個在進化上高度保守的免疫受體家族，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質區(qū)組成[3]。Toll樣受體胞質區(qū)是一個與白細胞介素-1(IL-1)受體家族具有高度同源性的TLR和IL-1受體結構區(qū)域(TIR)，能夠募集含有TIR結構的接頭蛋白參與信號傳導。目前已經發(fā)現了5種接頭蛋白，包括髓樣分化因子(MyD88)、類MyD88接頭(MAL)、誘導干擾素β且含有TIR區(qū)的接頭(TRIF)、TRIF相關接頭分子(TRAM)和含有Sterile α和armadillo基序的蛋白(SARM)，表明機體在受到病原體刺激后會產生與特定接頭蛋白相對應的免疫應答[4]。根據接頭蛋白的不同可以將TLR信號通路分為MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑。

SARM是最新被發(fā)現的TIR結構蛋白，位于MyD88非依賴信號傳導途徑。該接頭蛋白從線蟲到哺乳動物中均為高度保守，基因序列包含2個SAM結構域，1個C端的TIR結構域和N端的ARM重復結構域[5]。線蟲和文昌魚的相關研究表明，SARM參與了免疫應答信號通路以及神經發(fā)育的過程[6-8]。

目前已經報道的仿刺參Toll樣受體信號通路相關基因有Toll、TLR3、MyD88、TRAF6、TRAF3、IRAK4、P105和Rel[9-13]，尚未見MyD88非依賴途徑接頭蛋白的相關報道。筆者通過克隆仿刺參SARM基因，分析其結構序列和進化地位，探索其在仿刺參免疫應答和生長發(fā)育過程中的表達模式，為研究Toll樣受體信號通路的進化及其在發(fā)育和免疫方面的調控機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用仿刺參體質量(6.4±1.1) g，取自遼寧省海洋水產科學研究院引育種中心。試驗之前暫養(yǎng)一周，水溫16～18 ℃，pH 8.3～8.5，鹽度29。試驗采用燦爛弧菌(Vibriosplendidus)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifacien)、希瓦氏菌(Shewanellabaltica)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)4種病原菌進行免疫刺激試驗。各菌株在2216E培養(yǎng)基中，溫度28 ℃，150 r/min的條件下培養(yǎng)。當密度達到108cfu/mL時，進行刺激試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因全長克隆

參照動物組織RNA提取試劑盒(TIANGEN)說明書進行仿刺參體腔細胞RNA提取。對總RNA的濃度和完整性進行檢測，合格后用于后續(xù)試驗。利用Primer 5.0設計RACE特異引物(GSP)(表1)。試驗使用SMARTer 5′/3′RACE試劑盒(Clontech)對仿刺參SARM基因5′端進行克隆,其反應體系見表2。

表1 仿刺參SARM的 RACE引物

表2 仿刺參SARM的5′RACE PCR反應體系

反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。當上述反應沒有產生特異性條帶時，可以采用巢式PCR，用1 μL稀釋過的初級PCR 產物代替用于RACE的cDNAs。反應程序和初級RACE PCR的相同。

試驗使用3′-Full Race PrimeScripTMRTase試劑盒(Takara)對仿刺參SARM基因的3′端進行克隆，首先使用已設計好的Outer Primer克隆其反應體系(表3)。反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min?？筛鶕嶋H情況適當地提高或降低退火溫度(37～65 ℃)。在設置退火溫度時，最好使溫度維持在37～65 ℃。從延伸時間溫度來看，以1 min/kb為宜。當上述反應沒有產生特異性條帶時，可以采用Inner Primer進行二次克隆(表3)。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表3 仿刺參SARM的3′RACE PCR反應體系

1.2.2 組織和發(fā)育樣品

試驗所研究的組織包括：管足、體壁、腸道、呼吸樹和體腔細胞。取15頭健康仿刺參，每5頭為1組，分為3組，將每組中同一組織的混合樣放入1個含有RNA保存液的離心管中。4 ℃條件下保存12 h，后置于-80 ℃超低溫冰箱，用于組織表達分布研究。獲取仿刺參不同發(fā)育時期(受精卵、囊胚期、原腸期、小耳、中耳、大耳、樽型、五觸手和稚參)樣品，保存方法同上。

1.2.3 免疫刺激試驗

將300頭健康的仿刺參平均分為5組：對照組與4個菌刺激組。采用滅菌注射器對仿刺參進行體腔注射，對照組每頭仿刺參注射100 μL滅菌海水，試驗組每頭仿刺參注射100 μL菌液。試驗采用的注射劑量參考仿刺參體腔細胞中免疫相關酶的應答變化試驗[14]。注射4、24、48、72 h和96 h后解剖獲取體腔液，每組每個時間點隨機選取15頭，并隨機分成3份，樣品混合后在4 ℃，3000 r/min的條件下離心10 min，收集沉淀的體腔細胞。提取總RNA后使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒進行反轉錄，加5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL，反轉錄RNA的總量不超過900 ng，添加RNase Free dH2O至20 μL。反應條件為：37 ℃ 5 min，85 ℃ 5 s。經過反轉錄后獲得的cDNA樣品保存在-20 ℃，用于qRT-PCR試驗。

熒光定量PCR使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)試劑盒，以Cytb作為內參基因[15]，具體信息見表4。反應體系：ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，cDNA模板1 μL，TB Green Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus) (2×Conc.)10 μL，正反引物各0.8 μL，dH2O 7 μL。qRT-PCR反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 25 s，40個循環(huán)。每個反應重復3次。

表4 仿刺參SARM熒光定量引物信息

1.2.4 數據分析

采用美國國立生物技術信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行開放閱讀框預測；采用在線工具Expert Protein Analysis Systerm(http://www.expasy.org/tools/)進行核酸、氨基酸的翻譯，親水性等分析；采用蛋白二級結構預測及注釋平臺(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行結構域分析；采用多重序列比對(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行序列相似性分析；氨基酸序列全長進行Clustal W對比后采用MEGA 4.0軟件來構建鄰接進化樹, Bootstrap值設為1000次重復。根據qRT-PCR所獲取的Ct值，使用軟件REST 384 v.2 (Relative Expression Software Tool，REST)進行分析，試驗組和對照組之間發(fā)生的表達變化采用隨機配對檢驗分析法計算得到[16]。相對表達量選取平均值±標準誤差的方式表示。當P<0.05時，表明具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 仿刺參SARM基因的序列分析

通過RACE技術，獲得仿刺參SARM基因已知部分序列的3′和5′端的序列，拼接得到cDNA，全長為3874 bp，命名為AjSARM，GenBank登錄號MN906447。AjSARM基因的5′非編碼區(qū)131 bp，3′非編碼區(qū)1331 bp，開放閱讀框為2412 bp(圖1)。將完整的開放閱讀框進行翻譯，結果顯示，AjSARM基因編碼803個氨基酸，預測分子量為89.97 ku，理論等電點為7.76，不存在跨膜結構。BLASTX比對后發(fā)現，AjSARM基因與棘冠海星(Acanthasterplanci)SARM基因序列最為相似，核酸序列相似度為50%。

圖1 AjSARM基因的cDNA序列和預測的氨基酸序列全長Fig.1 Full-length cDNA sequences and deduced amino acid sequences of AjSARM gene

應用SMART軟件對AjSARM蛋白進行二級結構預測，AjSARM蛋白由2個SAM結構域以及1個C端的TIR結構域組成(圖2a)。通過Swiss Model對AjSARM蛋白的三級結構進行預測(圖2b)。

圖2 AjSARM蛋白的二級結構(a)和三級結構(b)示意Fig.2 Schematic diagram of the secondary structure (a) and tertiary structure of AjSARM(b) 圖2a中的數值表示AjSARM蛋白的氨基酸序列長度. The values in Fig.2a indicate the length of amino acids in AjSARM.

2.2 仿刺參SARM蛋白序列的進化分析

為了對AjSARM蛋白序列進行進化分析，將處于不同進化地位的10個物種的氨基酸序列全長(表5)進行Clustal W對比后使用MEGA 4.0版本中的鄰接方法構建AjSARM蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設為1000次重復。研究結果顯示，AjSARM蛋白與棘冠海星、紫色球海膽的親緣關系最近(圖3)。

2.3 SARM基因在仿刺參不同組織和不同發(fā)育時期的表達模式

實時熒光定量PCR試驗測得SARM基因在仿刺參不同組織和不同發(fā)育時期的表達結果(圖4)。以管足為對照，AjSARM基因在體腔細胞中的表達量最高，其次是體壁、腸道、管足和呼吸樹。以稚參為對照，其他8個發(fā)育時期AjSARM基因的表達均上調。從小耳時期到五觸手時期，AjSARM基因的表達量較穩(wěn)定，均高于前3個時期。其中AjSARM基因在五觸手時期表達量最高，在稚參期表達量最低。

表5 不同物種SARM氨基酸序列

圖3 AjSARM蛋白序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of AjSARM 使用MEGA 4.0軟件構建AjSARM蛋白序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設為1000次重復；物種名縮寫及登錄號參考表5. Neighbor-joining tree of AjSARM is constructed by the MEGA version 4.0; the value of bootstrap is 1000 replicates; abbreviations and the accession numbers of SARM sequences are listed in Tab.5.

圖4 SARM基因在仿刺參不同組織和不同發(fā)育時期的表達模式Fig.4 Expression of SARM in different tissues and developmental stages in sea cucumber A. japonicus a.SARM在不同組織中的分布，以管足(1×)為對照；b.SARM在不同發(fā)育階段的分布，以稚參(1×)為對照；*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05). a.the distribution of AjSARM in different tissues, the expression level of AjSARM in tube feet as control (1×); b.the distribution of AjSARM at developmental stages, the expression level of AjSARM at juvenile stage as control (1×); * represent significant difference at the level of P<0.05 from the control.

2.4 不同病原菌刺激后仿刺參SARM基因的表達變化

通過4種病原菌對仿刺參進行免疫刺激，采用實時熒光定量方法檢測體腔細胞中AjSARM基因在刺激后4、24、48 h和96 h的表達變化情況。在燦爛弧菌刺激組，AjSARM基因在4 h和24 h都下調，48 h上調后72 h又顯著下調，直到96 h才顯著上調。在假交替單胞菌組，AjSARM基因表達水平在注射后4、24 h和48 h均下調，到72 h表達水平開始上調，96 h表達水平顯著上調7倍。在希瓦氏菌組，AjSARM基因的表達變化情況和燦爛弧菌組相似，在4、24 h和72 h均處于下調表達，在48 h和96 h表達水平上調。在蠟樣芽孢桿菌組，AjSARM基因在4 h表達水平下調，隨后在24 h和48 h表達水平上調，在72 h表達水平小幅度下調后在96 h表達水平顯著上調。

圖5 仿刺參體腔細胞中AjSARM基因在4種病原菌刺激條件下的表達變化Fig.5 Relative expression levels of AjSARM in coelomocytes of sea cucumber A. japonicus challenged by four pathogens 試驗采用4種病原菌進行體腔注射，劑量為100 μL/頭；AjSARM的相對表達量以Cytb的表達水平作為對照；柱形圖代表相對表達量的平均值±標準誤差，*表示差異顯著(P<0.05). Four different pathogens are conducted by coelomic injection for each animal with 100 μL；relative expressions of AjSARM are normalized to the expression of Cytb; the histogram indicates mean expression level of 3 tested pools±SE; * represents significant difference at the level of P<0.05 from the control.

3 討 論

仿刺參是我國重要的水產養(yǎng)殖經濟品種，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，病害的發(fā)生成為限制其發(fā)展的重要因素。近年來對仿刺參免疫病害相關研究已經成為熱點，包括基因的克隆[9-13,17-20]、轉錄組測序[21-24]和miRNA-mRNA相互作用[25-31]等研究。仿刺參TLR信號通路MyD88依賴途徑的研究比較深入，對于MyD88非依賴途徑的研究相對較少。在哺乳動物中，MyD88依賴途徑通過快速激活NF-κB和MAPK產生炎癥細胞因子發(fā)揮免疫功能，MyD88非依賴途徑通過誘導IFN-β，緩慢激活NF-κB和MAPK產生炎癥細胞因子發(fā)揮免疫功能[32]。在MyD88非依賴途徑中，TLR3和TLR4可以識別細菌或病毒所產生的PAMPs，通過TRAM或TRIF以及SARM的共同作用將信號傳遞給下游分子。在仿刺參轉錄組測序結果中未發(fā)現TRAM和TRIF的基因片段，但是鑒定到了SARM基因的部分片段，這一接頭分子的發(fā)現將為仿刺參MyD88非依賴途徑的研究奠定基礎。

3.1 仿刺參SARM基因的序列特征

SARM基因具有高度的保守性，從節(jié)肢動物到哺乳動物中均普遍存在[33-34]。筆者采用RACE法克隆獲得AjSARM基因的cDNA全長為3874 bp，開放閱讀框為2412 bp，編碼803個氨基酸。二級結構由2個SAM結構域以及1個C端的TIR結構域組成，這和典型的SARM基因結構域相比缺少了N端的ARM區(qū)。對紫色球海膽的SARM氨基酸序列進行保守結構域預測發(fā)現也缺少ARM區(qū)，但是在棘冠海星中卻含有ARM重復序列。秀麗隱桿線蟲SARM基因的同源物TIR-1的N末端含有一段冗余序列，然而在文昌魚和人類中未出現，推測這段冗余序列在進化過程中消失了[35]。仿刺參SARM基因的結構差異是否會影響其功能，筆者通過熒光定量PCR技術對AjSARM基因在仿刺參不同發(fā)育階段和不同病原菌刺激后的表達模式進行了探索，為解析AjSARM基因的功能奠定基礎。

3.2 仿刺參SARM基因的功能分析

研究發(fā)現，秀麗隱桿線蟲SARM(TIR-1)基因參與了嗅覺神經的發(fā)育過程[6]。本試驗采用實時熒光定量PCR檢測AjSARM基因在仿刺參不同發(fā)育階段的表達模式，發(fā)現AjSARM基因從受精卵開始到原腸胚期均為低表達，從小耳期開始至五觸手時期都是高表達。Bishop等[36]使用免疫學手段檢測了黑海參(Holothuriaatra)幼體的神經發(fā)生，發(fā)現黑海參神經起源于耳狀幼體的原腸胚頂端。AjSARM基因正是從仿刺參小耳期開始出現高表達的，推測該基因參與了仿刺參神經發(fā)育的過程。

SARM基因不僅參與了秀麗隱桿線蟲神經元發(fā)育過程，還能有效地參與免疫應答[6-7]。在組織分布試驗結果中發(fā)現，AjSARM基因在體腔細胞中的表達量最高。體腔細胞作為仿刺參重要的免疫效應器，在應對不同病原體刺激時能產生特異性的免疫應答，因此試驗選取體腔細胞來檢測AjSARM基因如何應對4種病原菌的刺激。在燦爛弧菌、假交替單胞菌和希瓦氏菌刺激組，AjSARM基因在4 h和24 h均為被抑制表達，然而在蠟樣芽孢桿菌組，24 h表達上調。除了希瓦氏菌組外，其他3個組的AjSARM基因在96 h表達量達到最高。AjSARM基因在應對不同病原菌刺激后不同時間點所表現出的動態(tài)表達模式表明它參與了仿刺參體腔細胞免疫應答的過程。

4 結 論

SARM基因作為MyD88非依賴途徑的接頭分子，在Toll樣受體信號傳導過程中發(fā)揮著重要作用。采用RACE法對仿刺參SARM基因進行全長克隆，獲得cDNA全長為3874 bp，開放閱讀框為2412 bp，編碼803個氨基酸。對氨基酸序列進行保守結構域預測，發(fā)現存在TIR保守結構域，但是和其他物種的SARM蛋白結構存在一定的差異。筆者在mRNA層面對AjSARM基因的功能進行了初步探索。采用實時熒光定量PCR方法對AjSARM基因在不同發(fā)育階段和不同病原菌刺激后的表達模式進行分析，試驗結果表明，AjSARM基因參與了仿刺參的發(fā)育和免疫應答的過程。本試驗不僅探索了仿刺參MyD88非依賴途徑接頭分子SARM的功能，豐富了仿刺參Toll樣受體信號通路研究，同時為棘皮動物免疫系統(tǒng)進化研究提供了科學依據。