杜欣欣，劉福利，袁艷敏，梁洲瑞，張朋艷，劉升平

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè) 資源可持續(xù)利用重點開放實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266000 )

極北海帶(Laminariahyperborea)，屬褐藻門、褐藻綱、海帶目、海帶科、海帶屬，是一種冷水性海藻，分布于北大西洋東北海區(qū)，北起斯堪的納維亞半島，南至加那利群島，包括波羅的海、北海沿岸[1-3]。極北海帶個體較大，長度一般為2～4 m，是多年生的海藻，壽命一般為10～20 a[4-6]。極北海帶通常生長于潮下帶的硬質(zhì)基質(zhì)上，根據(jù)海水透明度不同，其垂直分布的下限為海平面下10～35 m。在北大西洋東北海區(qū)臨近大潮低潮線下底質(zhì)為基巖的區(qū)域，極北海帶是優(yōu)勢種，常與其他大型褐藻[糖海帶(L.saccharina)等]形成“海藻森林”[7-8]，可成為海洋動物的索餌場、產(chǎn)卵場和棲息地，其也對淺海生態(tài)環(huán)境的改善、海洋生物多樣性的增加具有積極作用[8-9]。

海藻苗種培育是養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的前提，通過建立極北海帶配子體繁育技術(shù)體系，可以實現(xiàn)人工增養(yǎng)殖的需要，但對其幼苗培養(yǎng)過程中營養(yǎng)鹽的需求尚不清楚。國內(nèi)外對海藻吸收氮、磷營養(yǎng)鹽方面已有較多研究。王翔宇等[10]對6種大型海藻吸收營養(yǎng)鹽的能力進(jìn)行了研究；李文慧[11]分析了氮、磷營養(yǎng)鹽因子對緣管滸苔(Enteromorphalinza)生長、葉綠素?zé)晒馓匦院偷赘患挠绊?；許忠能等[12]研究了環(huán)境因子對細(xì)基江蘺繁枝變種(Gracilariatenuistipitatavar.liui)氮、磷吸收速率的影響。氮、磷和鐵是限制海藻生長的主要元素，這些元素在海水中的含量變化較大，其在海藻內(nèi)的含量遠(yuǎn)高于海水中的含量，但對大型海藻中氮、磷、鐵間的相互影響作用尚不清楚[13]。目前國內(nèi)外對氮、磷營養(yǎng)元素的研究較多[14-16]。海藻對不同氮營養(yǎng)鹽的利用效率不同，海藻對NH4+-N的吸收率大于對NO3--N的吸收率。田千桃等[17]發(fā)現(xiàn)，2種氮源同時存在時，滸苔(E.prolifera)對NH4+-N的吸收速率高于對NO3--N的吸收速率。呂冬偉等[18]以孔石莼(Ulvapertusa)為材料，研究其對水體中氮磷營養(yǎng)鹽吸收情況時發(fā)現(xiàn)，孔石莼對NH4+-N和PO43--P的吸收效果明顯高于NO3--N。鐵也是海藻生長的主要限制性營養(yǎng)元素之一[19-23]，其既能參與海藻光合及呼吸過程，又能參與光合和呼吸過程中的光合磷酸化和氧化磷酸化[21,24-25]。朱明遠(yuǎn)等[26]探討了鐵(EDTA-Fe)對三角褐指藻(Phaeodactylumtricornulum)生長、光合作用及生化組成的影響；陳靜峰等[27]研究了磷、鐵鹽的協(xié)同作用對赤潮隱藻(Crytomonassp.)生長的影響；姚波等[28]綜述了鐵限制對浮游植物生長和群落組成的影響，認(rèn)為鐵是浮游植物生長的限制性因素，鐵含量的改變會引起群落結(jié)構(gòu)的變化。但關(guān)于鐵離子對大型海藻尤其是海帶方面的研究較少。

筆者通過表征氮、磷、鐵在不同質(zhì)量濃度條件下的生長速度和光合生理參數(shù)，探明極北海帶幼苗生長所需要的適宜氮、磷、鐵用量，為極北海帶幼苗的人工培育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用極北海帶幼苗是通過配子體繁育技術(shù)所得，選取3～5 cm、無褶皺損傷、無病害的極北海帶幼苗作為材料。幼苗培育條件為：充氣培養(yǎng)，溫度11～13 ℃，光合有效照射度(PAR)為40 μmol/(m2·s)，光周期為12L∶12D，使用天然過濾滅菌海水(氮0.1 mg/L，磷0.01 mg/L，鐵0.002 mg/L)作為培養(yǎng)液，添加營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度為NO3--N:4 mg/L，PO43--P:0.4 mg/L。培養(yǎng)液更換1次/3 d。試驗開始前，從挑選出的極北海帶幼苗中再次選擇，使得試驗各處理組平均質(zhì)量為(1±0.05) g，質(zhì)量差異性不顯著(P>0.05)。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗生長和光合生理的影響

以過濾、滅菌的天然海水作為培養(yǎng)液，以NaNO3和KH2PO4為氮源和磷源，設(shè)置7個不同氮、磷質(zhì)量濃度[ρ(N)∶ρ(P)=10∶1]:NO3--N為0、0.5、2、4、6、8、10 mg/L。其他培養(yǎng)條件：光合有效照射度為40 μmol/(m2·s)，光周期為12L∶12D，溫度9 ℃，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液。每個處理組設(shè)置3個對照。

稱量每個處理組初始幼苗的質(zhì)量，7 d后再次稱量質(zhì)量，計算相對生長速率(vRGR)，計算公式為：

式中m0為初始藻的質(zhì)量(g)，mt為試驗結(jié)束時藻的質(zhì)量(g)，t為試驗持續(xù)的時間(d)。

在上述各質(zhì)量濃度條件下培養(yǎng)幼苗12、24、36、48、60 h，然后測定其葉綠素?zé)晒鈪?shù)(光系統(tǒng)Ⅱ最大熒光產(chǎn)量，F(xiàn)v/Fm)及培養(yǎng)12、24、48 h后幼苗的表觀光合速率。使用水下飽和脈沖葉綠素?zé)晒鈨x(DIVING-PAM，WALZ，Germany) 測定Fv/Fm值，使用液相氧電極(Hansatech Oxygraph，英國)測定表觀光合速率。

1.2.2不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗生長及氮磷需求的影響

以NaNO3和NH4Cl為氮源，KH2PO4為磷源，F(xiàn)eCl3為鐵源。設(shè)置不同氮、磷、鐵的組合[ρ(N)∶ρ(P)=10∶1]。NH4+-N組設(shè)置2個Fe3+質(zhì)量濃度(NH4+-N為3 mg/L):0、1 mg/L。NO3--N組設(shè)置4個Fe3+質(zhì)量濃度(NO3--N為3 mg/L):0、0.2、1.0、5.0 mg/L。分別測定在上述各質(zhì)量濃度條件下培養(yǎng)0、4、10、24、48 h后幼苗培養(yǎng)液中的PO43--P、NO3--N、NH4+-N和Fe3+質(zhì)量濃度以及處理3 d后的極北海帶幼苗的相對生長速率。每次試驗設(shè)置3個平行組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析、Duncan多重比較，以P<0.05作為顯著性差異，使用Prism軟件繪制圖形。

2 結(jié) 果

2.1 不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗生長和光合生理的影響

2.1.1 不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗的相對生長速率

方差分析結(jié)果顯示，不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗的相對生長速率有顯著性影響。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，極北海帶幼苗的相對生長速率隨著NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度的升高而升高(圖1)，NO3--N:2、4、6、8 mg/L組的相對生長速率較高，且相互之間差異不顯著(P>0.05)。NO3--N:0、0.5、10 mg/L的相對生長速率較低，且顯著低于NO3--N:2、4、6、8 mg/L組(P<0.05)，說明NO3--N質(zhì)量濃度2～8 mg/L是極北海帶生長的適宜質(zhì)量濃度范圍，氮、磷質(zhì)量濃度過高和過低均不利于極北海帶生長。

2.1.2 不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

極北海帶的光合效率(Fv/Fm值)隨著NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(圖2)。由NO3--N:2 mg/L組到NO3--N:4 mg/L組，極北海帶的Fv/Fm值逐漸上升，當(dāng)達(dá)到NO3--N:4 mg/L時，F(xiàn)v/Fm值達(dá)到最高值，此后隨著質(zhì)量濃度增加，F(xiàn)v/Fm值呈現(xiàn)下降趨勢。NO3--N:2、4 mg/L時的Fv/Fm值顯著高于其他NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度時的Fv/Fm值，說明NO3--N質(zhì)量濃度在2～4 mg/L時，極北海帶具有高水平的光合效率。另外，對于添加適量NO3--N、PO43--P營養(yǎng)鹽的處理組，不同培養(yǎng)時間的Fv/Fm值差異不顯著，而對于NO3--N:10 mg/L組，隨著培養(yǎng)時間延長，F(xiàn)v/Fm值顯著升高。

圖2 不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度下處理12、24、36、48、60 h后極北海帶幼苗的Fv/FmFig.2 Fv/Fm values of juvenile kelp L. hyperborea exposed to different NO3--N and PO43--P concentrations for 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 60 h 字母下標(biāo)為相同數(shù)字的作為同一組，進(jìn)行多重比較，同一組的不同字母表示在P<0.05水平具有顯著性差異，下同. Fv/Fm values with the same letters in the histogram are within the same group, and the means with different letters in the same group are significant difference at the level of P<0.05, et sequentia.

2.1.3 不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度下極北海帶幼苗的表觀光合速率

在不同的NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度下(除NO3--N:0 mg/L處理12 h外)，極北海帶的表觀光合速率具有先升后降的趨勢，在NO3--N:2、4 mg/L組時數(shù)值較高(圖3)。通過相同時間不同質(zhì)量濃度之間比較發(fā)現(xiàn)，NO3--N:2、4 mg/L組在24、48 h的表觀光合速率較大，與NO3--N:8、10 mg/L組具有顯著性差異(P<0.05)，12 h之內(nèi)各組與NO3--N:0 mg/L組之間均差異不顯著(P>0.05)；通過相同質(zhì)量濃度不同時間之間比較發(fā)現(xiàn)，NO3--N:0 mg/L組處理12 h顯著大于處理48 h(P<0.05)，NO3--N:10 mg/L組在12 h的表觀光合速率較大，并且與24、48 h之間具有顯著性差異(P<0.05)，其余各組在48 h之內(nèi)均無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗生長及氮磷需求的影響

2.2.1 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗相對生長速率的影響

NO3--N-Fe3+:1 mg/L組幼苗的相對生長速率最大(圖4)，顯著大于NH4+-N-Fe3+:0 mg/L和NH4+-N-Fe3+:1 mg/L組(P<0.05)，且顯著大于NO3--N-Fe3+:0 mg/L和NH4+-N-Fe3+:5 mg/L組(P<0.05)。NO3--N-Fe3+:1 mg/L和NO3--N-Fe3+:0.2 mg/L組間無顯著性差異(P>0.05)。NO3--N-Fe3+:5 mg/L組相對生長速率最小，顯著小于其他各組(P<0.05)，說明高質(zhì)量濃度Fe3+會抑制極北海帶生長。

圖3 不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度處理12、24 h及48 h后極北海帶幼苗的表觀光合速率 Fig.3 The net photosynthetic rates of juvenile kelp L. hyperborea xposed to different NO3--N and PO43--P concentrations for 12 h, 24 h and 48 h

圖4 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度處理3 d后極北海帶幼苗的相對生長速率 (PO43--P均為0.3 mg/L)Fig.4 Relative growth rate (RGR) of juvenile kelp L. hyperborea cultivated under different concentrations of Fe3+ (PO43--P concentration of 0.3 mg/L) for 3 days

2.2.2 極北海帶幼苗對不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度的需求

極北海帶對Fe3+的吸收主要在0～10 h之間(圖5)，單因素方差分析結(jié)果表明，F(xiàn)e3+:0.2、1.0、5.0 mg/L組中Fe3+質(zhì)量濃度在0 h與4 h之間差異顯著(P<0.05)，且均顯著高于10、24、48 h(P<0.05)；Fe3+:0.2 mg/L、1.0 mg/L組Fe3+質(zhì)量濃度在10、24、48 h間均無顯著性差異(P>0.05)，F(xiàn)e3+:5 mg/L組的Fe3+質(zhì)量濃度在48 h時顯著低于10 h和24 h(P<0.05)。因此，在0～5 mg/L范圍內(nèi)，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，極北海帶幼苗對Fe3+的吸收越多，且吸收作用主要在10 h內(nèi)完成，隨后吸收呈緩慢和穩(wěn)定趨勢。

圖5 極北海帶幼苗培養(yǎng)液中的Fe3+質(zhì)量濃度Fig.5 Fe3+ concentration in seedling culture solution of juvenile kelp L. hyperborea PO43--P均為0.3 mg/L，下同. PO43--P concentration of 0.3 mg/L, et sequentia

2.2.3 不同質(zhì)量濃度Fe3+對極北海帶幼苗NO3--N需求的影響

比較不同質(zhì)量濃度間的處理，4 h時Fe3+:1 mg/L組NO3--N含量顯著低于其他3組(P<0.05)(圖6)。10 h時Fe3+:0 mg/L組NO3--N含量顯著高于其他3組(P<0.05)，F(xiàn)e3+:0.2 mg/L組顯著高于Fe3+:1 mg/L組(P<0.05)，其余各組之間均無顯著性差異(P>0.05)。24 h時各組間無顯著性差異(P>0.05)。48 h時Fe3+:5 mg/L組NO3--N含量顯著高于Fe3+:0.2 mg/L(P<0.05)，其余各組間無顯著性差異(P>0.05)。通過相同質(zhì)量濃度不同時間之間的比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+:0 mg/L組和Fe3+:0.2 mg/L組的4、10 h與24 h、48 h間NO3--N含量有顯著性差異(P<0.05)，且4 h與10 h含量顯著高于24 h與48 h(P<0.05)。Fe3+:1 mg/L和Fe3+:5 mg/L組24 h與48 h間NO3--N含量無顯著性差異(P>0.05)，且含量顯著低于4、10 h(P<0.05)。由此可見，F(xiàn)e3+對極北海帶吸收NO3--N具有促進(jìn)作用，在0～10 h，且Fe3+質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/L時較為合適。

圖6 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度條件下極北海帶幼苗培養(yǎng)液中的 NO3--N含量Fig.6 The NO3--N concentration in culture medium of juvenile kelp L. hyperborea exposed to different concentrations of Fe3+

2.2.4 不同質(zhì)量濃度Fe3+對極北海帶幼苗NH4+-N需求的影響

與NO3--N相比，NH4+-N更易被吸收(圖7)，在4～48 h內(nèi)培養(yǎng)液中NH4+-N的含量均顯著低于同時期培養(yǎng)液中NO3--N的含量(P<0.05)，NH4+-N-Fe3+:0 mg/L組在48 h時含量顯著低于NH4+-N-Fe3+:1 mg/L組(P<0.05)，0～24 h時，差異不顯著(P>0.05)。

圖7 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度條件下極北海帶幼苗培養(yǎng)液中 NH4+-N的含量Fig.7 The NH4+-N concentration in culture medium of juvenile kelp L. hyperborea exposed to different concentrations of Fe3+

2.2.5 不同質(zhì)量濃度Fe3+對極北海帶幼苗PO43--P需求的影響

在相同溫度、NO3--N、PO43--P條件下，加入不同質(zhì)量濃度Fe3+后，培養(yǎng)液中PO43--P含量變化(圖8)。通過相同時間不同質(zhì)量濃度之間的比較發(fā)現(xiàn)，4 h時Fe3+1 mg/L組PO43--P含量顯著低于其他3組(P<0.05)；10 h時Fe3+1 mg/L組PO43--P含量顯著低于Fe3+0、5 mg/L組(P<0.05)，F(xiàn)e3+0.2 mg/L組顯著低于Fe3+5 mg/L組(P<0.05)；24 h時各組的PO43--P含量均無顯著性差異(P>0.05)；48 h時Fe3+5 mg/L組PO43--P含量與其余各組具有顯著性差異(P<0.05)，其余各組間無顯著性差異(P>0.05)。通過相同質(zhì)量濃度不同時間之間的比較發(fā)現(xiàn):Fe3+0 mg/L、0.2 mg/L組在48 h之內(nèi)的PO43--P含量均有顯著性差異(P<0.05)；Fe3+:1 mg/L組10、24 h間的PO43--P含量無顯著性差異(P>0.05)，其他組之間均有顯著性差異(P<0.05)；Fe3+5 mg/L組24、48 h間的PO43--P含量無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著低于4、10 h時的PO43--P含量(P<0.05)。1 mg/L左右的Fe3+在24 h之內(nèi)能促進(jìn)極北海帶對PO43--P的吸收，24 h后促進(jìn)效果不明顯。高質(zhì)量濃度的Fe3+在10 h后對極北海帶吸收PO43--P可能有抑制作用。

圖8 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度條件下極北海帶幼苗培養(yǎng)液中 PO43--P的含量Fig.8 The PO43--P concentration in culture medium of juvenile kelp L. hyperborea exposed to different concentrations of Fe3+

3 討 論

3.1 不同NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗生長和光合生理的影響

隨著NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度的升高，極北海帶的相對生長速率逐漸升高，并在NO3--N質(zhì)量濃度為4 mg/L、PO43--P質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時達(dá)到峰值。這是因為氮是海藻蛋白質(zhì)的重要組成部分[29-30]，磷能促進(jìn)海藻生殖細(xì)胞的形成和酶的活動與轉(zhuǎn)化[31-32]，二者是海藻生長的重要影響因子[33-36]。隨著NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度的升高，其相對生長速率逐漸下降。王萍等[37]探究了營養(yǎng)鹽含量對繁枝蜈蚣藻(Grateloupiaramosissima)和孔石莼吸收氮、磷的影響, 結(jié)果顯示，其對氮、磷的吸收隨營養(yǎng)鹽含量升高而增加。當(dāng)?shù)⒘踪|(zhì)量濃度過高時，則會產(chǎn)生O22-、OH-、H2O2等自由基，這些自由基則會引發(fā)膜脂過氧化，破壞細(xì)胞膜[38]，從而影響海藻的生長。因此在高NO3--N、PO43--P質(zhì)量濃度時，極北海帶的相對生長速率下降。

Fv/Fm是衡量植物光合作用效率的重要指標(biāo)[39-41]。當(dāng)NO3--N質(zhì)量濃度在2～4 mg/L時，極北海帶Fv/Fm的值顯著高于其他NO3--N、PO43--P營養(yǎng)鹽組，這說明其在NO3--N、PO43--P營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較高的光合作用效率。當(dāng)NO3--N質(zhì)量濃度由0.5 mg/L升至4 mg/L[ρ(N)∶ρ(P)=10∶1]，其表觀光合速率隨之上升，在該營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度下極北海帶的表觀光合速率最大。NO3--N:0.5 mg/L、PO43--P:0.05 mg/L時，表觀光合速率的數(shù)值較低，是因為外源營養(yǎng)鹽供應(yīng)不足，降低了極北海帶對營養(yǎng)鹽的吸收，進(jìn)而影響光合作用的酶和色素的合成[42]。綜上所述，NO3--N在2～4 mg/L時極北海帶具有相對較高的光合效率。

3.2 不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度對極北海帶幼苗生長及氮磷需求的影響

Fe3+對極北海帶幼苗的生長有影響，主要是因為其在細(xì)胞生長、對NO3--N、PO43--P的吸收利用以及參與光合呼吸過程等方面發(fā)揮重要作用[43-44]。適宜質(zhì)量濃度的Fe3+能夠促進(jìn)極北海帶的生長，缺少Fe3+則會影響營養(yǎng)鹽的吸收以致抑制細(xì)胞生長[45]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為0.2～1 mg/L、NO3--N質(zhì)量濃度為3 mg/L[ρ(N)∶ρ(P)=10∶1]時極北海帶的相對生長速率較高。在相同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度下，培養(yǎng)3 d后NO3--N組的相對生長速率高于NH4+-N組。高質(zhì)量濃度的Fe3+對極北海帶的生長具有一定抑制作用。

Fe3+對極北海帶吸收氮磷營養(yǎng)鹽也有影響。當(dāng)2種氮源同時存在時，大型海藻可能更傾向于對NH4+-N的吸收利用[46-47]。劉靜雯等[13]認(rèn)為，海藻對NH4+-N的吸收率遠(yuǎn)大于對 NO3--N的吸收率。海藻對 NO3--N的吸收一般是主動運輸，對NH4+-N的吸收則以被動擴(kuò)散為主。大型海藻在NO3--N下比在NH4+-N下生長需要更多的鐵，這可能與大型海藻對NH4+-N和NO3--N吸收的運輸方式有關(guān)[48]。本試驗表明，適宜質(zhì)量濃度的Fe3+能夠顯著促進(jìn)極北海帶對NO3--N、PO43--P的吸收，其作用時間主要是10 h之內(nèi)，對不同質(zhì)量濃度Fe3+的吸收也主要集中在10 h之內(nèi)，10 h之后培養(yǎng)液中的Fe3+含量趨于平衡，并且和對照組無顯著差異。

4 結(jié) 論

無外源鐵離子時，極北海帶幼苗在NO3--N質(zhì)量濃度2～8 mg/L[ρ(N)∶ρ(P)=10∶1]時的相對生長速率較大；在氮、磷、鐵營養(yǎng)鹽試驗中，添加適宜質(zhì)量濃度的Fe3+，在10 h內(nèi)對極北海帶吸收NO3--N、PO43--P有顯著的促進(jìn)作用，添加1 mg/L的Fe3+對極北海帶吸收NH4+-N無顯著影響，NO3--N為3 mg/L、Fe3+為0.2～1 mg/L時較有利于極北海帶幼苗的生長。