宋紫玉，王國棟，張麗莉，黃世玉，洪 偉，賈 奔，張元長

(集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021 )

中華鋸齒米蝦(Neocaridinadenticulatasinensis)屬十足目、匙指蝦科、新米蝦屬，具有生長迅速、生命力頑強(qiáng)等特點，是一種廣泛分布于亞洲淡水水域的小型蝦。其卵為大型卵，卵徑約1 mm，具有抱卵習(xí)性，幼體成活率高。因其體色艷麗多彩，經(jīng)人工培育后成為主要的觀賞蝦之一[1]。在國內(nèi)，觀賞蝦市場越來越受到各方的關(guān)注，消費(fèi)者對其體色的需求也更加多元化。目前的中華鋸齒米蝦品系都是通過篩選體色自然突變體，經(jīng)累代人工培育而成。但是自然突變體具有突變概率低，無法進(jìn)行定向選擇等缺點。因此人工誘導(dǎo)是一種較快速產(chǎn)生新體色的方法。可目前尚無人工誘導(dǎo)中華鋸齒米蝦體色突變體的有關(guān)報道。紫外線等高能射線照射受精卵或胚胎是一種人工誘導(dǎo)常用方法。研究表明，紫外線暴露能夠引起斑馬魚 (Daniorerio)[2]、青鳉(Oryziaslatipes)[3]和草蝦(Palaemonetespugio)[4]等水生動物DNA突變。使用這一方法可以顯著提高突變率，快速獲得更多的優(yōu)良變異類型。紫外線誘變處理可導(dǎo)致雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)[5]和豚鼠(Caviaporcellus)[6]中的色素累積，并且可以誘導(dǎo)紫菜(Porphyrahaitanensis)[7]產(chǎn)生可穩(wěn)定遺傳的色素突變體。上述研究表明，紫外線具有誘導(dǎo)產(chǎn)生新體色表型的潛力，可以用來進(jìn)行觀賞蝦新體色性狀誘導(dǎo)。因此，筆者對中華鋸齒米蝦不同發(fā)育階段的胚胎進(jìn)行紫外線暴露處理，計算其的24、48 h半數(shù)致死量，為紫外線誘導(dǎo)中華鋸齒米蝦產(chǎn)生體色突變體提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親蝦的培育

親蝦培育在50 cm×30 cm×40 cm的玻璃缸中進(jìn)行。玻璃缸刷洗干凈后，在其底部后方隔離出15 cm×30 cm×5 cm空間，填滿ADA陶土，用來提供底棲藻類和水草生長的營養(yǎng)鹽，并將水體pH維持弱酸性范圍。加滿經(jīng)過曝氣的自來水，并加入10 mL甲醛消毒。通常添加完甲醛后水體會變得渾濁，待水體變清之后換水1/2，并加入0.5 g的硝化細(xì)菌改良水體的微生物菌群。2 d后加入100 g的金魚藻(Ceratophyllumdemersum)和莫斯[海島明葉蘚(Vesiculariadubyana)]，它們有凈化水質(zhì)、供給氧氣、供蝦躲藏和美觀的作用。挑選體色鮮艷并覆蓋全身、體型大的個體用于試驗，日投喂2次飼料，飼養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2 胚胎的獲得

飼養(yǎng)時觀察雌蝦的性腺發(fā)育程度，當(dāng)性腺向腹部延伸至1/2時視為性腺發(fā)育成熟。將性腺發(fā)育成熟的米蝦，按n(雌蝦)∶n(雄蝦)=3∶1的比例，進(jìn)行培育。通常雌雄交配后，在第2天雌蝦開始產(chǎn)卵，若雌蝦抱卵，則將抱卵蝦移入新缸繼續(xù)培育。

將抱卵蝦放在培養(yǎng)皿中觀察并確定胚胎的發(fā)育時期。用解剖針將胚胎從雌蝦腹部剝離，取處于卵裂期、囊胚期、原腸胚期、無節(jié)幼體Ⅰ期4個時期的胚胎備用。卵裂期顏色呈黃綠色，細(xì)胞較少，內(nèi)含物較少；囊胚期卵內(nèi)充滿卵黃顆粒，無明顯細(xì)胞形態(tài)；原腸胚期卵一側(cè)卵黃顆粒減少，內(nèi)陷形成原腸。無節(jié)幼體Ⅰ期卵的一端透明略帶乳白色，顯微鏡下可以觀察到芽基[8]。

1.3 紫外線暴露

將每個時期的胚胎分為6組，每組設(shè)3個平行，每個平行10粒胚胎，試驗在培養(yǎng)皿中進(jìn)行。設(shè)置1～6組紫外線照射劑量分別為0、1、2、4、8、16 W·s/cm2。先將紫外滅菌燈預(yù)熱30 min，再按照設(shè)定的紫外線照射劑量梯度照射胚胎。照射10 min后將胚胎放入24孔培養(yǎng)板中，每孔放1粒胚胎并加入滅菌水1.5～2.0 mL。紫外線輻射劑量為紫外燈表面強(qiáng)度和角系數(shù)的乘積，表面強(qiáng)度為輸出功率與表面積之比，具體計算方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.4 胚胎體外培養(yǎng)及觀察

將裝有胚胎的24孔培養(yǎng)板放入人工振蕩培養(yǎng)箱(YC-RGZD-4C，常州中誠儀器制造有限公司)中，以速度55 r/min、溫度25 ℃、濕度60%培養(yǎng)。日換水2次，換水時，用膠頭滴管將卵吸出放入新培養(yǎng)板中，每孔加入滅菌水1.5～2.0 mL。每隔24 h在解剖鏡下觀察胚胎發(fā)育情況、判斷其是否死亡，觀察至48 h后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。出現(xiàn)以下情況之一則認(rèn)為胚胎死亡：(1)胚胎內(nèi)含物流出；(2)卵膜破裂；(3)胚胎細(xì)胞顆粒界限模糊；(4)胚胎發(fā)白且看不到細(xì)胞顆粒；(5)無節(jié)幼體Ⅱ期之后，心臟停止跳動。

1.5 數(shù)據(jù)處理

胚胎存活率為胚胎存活數(shù)除以本組總胚胎數(shù)的百分比。數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。首先將存活率進(jìn)行反正弦平方根處理，再進(jìn)行方差齊性分析，在此之后進(jìn)行單因素方差分析，最后用Duncan進(jìn)行多重比較，并計算其回歸關(guān)系。P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量紫外線對中華鋸齒米蝦卵裂期胚胎的影響

不同劑量紫外線照射卵裂期的胚胎，培養(yǎng)24 h后存活率見圖1。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量(x)對胚胎存活率(y)無顯著性差異(P=0.131)。

圖1 紫外線劑量對卵裂期胚胎24 h存活率的影響Fig.1 Effect of different UV doses on survival rate of embryos in cleavage stage at 24 hour exposure 不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)，下同. Different letters in the figure indicate significant differences (P<0.05), et sequentia.

不同劑量紫外線照射卵裂期的胚胎，培養(yǎng)48 h后其存活率見圖2。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量對存活率影響顯著(P=0.016)。0、2 W·s/cm2組與8、16 W·s/cm2組差異顯著，1 W·s/cm2組與其他組均差異不顯著，4 W·s/cm2組與16 W·s/cm2組差異顯著。

圖2 紫外線劑量對卵裂期胚胎48 h存活率的影響Fig.2 Effect of different UV doses on survival rate of embryos in cleavage stage at 48 hour exposure

通過回歸方程計算出公式y(tǒng)=-0.0226x+0.7602(r2=0.7776)，則卵裂期48 h半致死劑量為11.5 W·s/cm2。

部分卵裂期胚胎照射后出現(xiàn)畸形，細(xì)胞間隙中出現(xiàn)大量透明區(qū)(圖3)。

圖3 卵裂期胚胎紫外線照射后畸形Fig.3 Malformation of embryo in cleavage stage exposed to ultraviolet irradiation

2.2 不同劑量紫外線對中華鋸齒米蝦囊胚期胚胎的影響

不同劑量紫外線照射囊胚期的胚胎，培養(yǎng)24 h后存活率見圖4。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量對存活率影響極顯著(P<0.001)。0、1 W·s/cm2組與其他組均差異顯著，2 W·s/cm2組與0、1、16 W·s/cm2組差異顯著。

圖4 紫外線劑量對囊胚期胚胎24 h存活率的影響Fig.4 Effect of different UV doses on survival rate of embryos in blastula stage at 24 hour exposure

通過回歸方程計算出公式y(tǒng)=-0.0162x+0.8827(r2=0.7514)，得出囊胚期24 h半數(shù)致死劑量為23.6 W·s/cm2。

不同劑量紫外線照射囊胚期的胚胎，培養(yǎng)48 h后存活率見圖5。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量對存活率影響極顯著(P<0.001)。0、1、2 W·s/cm2組與相鄰組外其他組均差異顯著，4、8、16 W·s/cm2組間差異不顯著。

通過回歸方程計算出公式y(tǒng)=-0.0273x+0.7357(r2=0.7326)，則囊胚期48 h半數(shù)致死劑量為8.6 W·s/cm2。

部分囊胚期胚胎照射后出現(xiàn)畸形，卵黃細(xì)胞顆粒不能充滿整個胚胎細(xì)胞，在側(cè)面出現(xiàn)透明區(qū)(圖6)。

圖5 紫外線劑量對囊胚期胚胎48 h存活率的影響Fig.5 Effect of different UV doses on survival rate of embryos in blastula stage at 48 hour exposure

圖6 囊胚期胚胎紫外線照射后畸形Fig.6 Malformation of embryos in blastula stage after ultraviolet irradiation

2.3 不同劑量紫外線對中華鋸齒米蝦原腸胚期胚胎的影響

不同劑量紫外線照射原腸胚期的胚胎，培養(yǎng)24 h后存活率見圖7。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量對存活率影響極顯著(P=0.002)。0 W·s/cm2組和8、16 W·s/cm2組差異顯著，1、16 W·s/cm2組與除相鄰組外其他組均差異顯著。

圖7 紫外線劑量對原腸胚期胚胎24 h存活率的影響Fig.7 Effect of different UV doses on survival rate in gastrula embryos exposed to various ultraviolet irradiation doses for 24 hours

通過回歸方程計算出公式y(tǒng)=-0.0188x+0.964(r2=0.9364)，則原腸胚期24 h半數(shù)致死劑量為24.6 W·s/cm2。

不同劑量紫外線照射原腸胚期的胚胎，培養(yǎng)48 h后存活率見圖8。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量對存活率影響極顯著(P<0.001)。0、16 W·s/cm2組與其他組均差異顯著，2、4 W·s/cm2組間差異不顯著，2、4、8 W·s/cm2組之間無顯著性差異。

圖8 紫外線劑量對原腸胚期胚胎48 h存活率的影響Fig.8 Effect of different UV doses on survival rate in gastrula embryos exposed to various doses of ultraviolet irradiation for 24 hours

通過回歸方程計算出公式y(tǒng)=-0.0322x+0.8863(r2=0.9557)，則原腸胚期48 h半數(shù)致死劑量為12.0 W·s/cm2。

部分原腸胚期胚胎照射后出現(xiàn)死亡，卵膜破裂不成形，界限模糊(圖9)。

圖9 原腸胚期胚胎紫外線照射后死亡Fig.9 Dead embryo in gastrula stage after ultraviolet irradiation

2.4 不同劑量紫外線對中華鋸齒米蝦胚胎無節(jié)幼體Ⅰ期的影響

不同劑量紫外線照射無節(jié)幼體Ⅰ期的胚胎，培養(yǎng)24 h后存活率見圖10。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量對存活率影響不顯著(P=0.380)。

圖10 紫外線劑量對無節(jié)幼體Ⅰ期胚胎24 h存活率的影響Fig.10 Effect of different UV doses on survival rate in nauplius Ⅰ stage for 24 hour exposure

不同劑量紫外線照射無節(jié)幼體Ⅰ期的胚胎，培養(yǎng)48 h后存活率見圖11。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量對存活率影響極顯著(P<0.001)。0 W·s/cm2組與其他組均差異顯著，1、2、4、8 W·s/cm2組間差異不顯著，8 W·s/cm2組與16 W·s/cm2組差異不顯著。

通過回歸方程計算出公式y(tǒng)=-0.024x+0.8406(r2=0.8311)，則無節(jié)幼體Ⅰ期48 h半數(shù)致死劑量為14.2 W·s/cm2。

部分無節(jié)幼體Ⅰ期胚胎照射后出現(xiàn)死亡，胚胎發(fā)白且看不到細(xì)胞顆粒，出現(xiàn)發(fā)霉現(xiàn)象(圖12)。

圖11 紫外線劑量對無節(jié)幼體Ⅰ期胚胎48 h存活率的影響Fig.11 Effect of different UV doses on survival rate of nauplius Ⅰ at 24 hour exposure

圖12 無節(jié)幼體Ⅰ期胚胎紫外線照射后死亡Fig.12 Dead nauplius Ⅰ stage exposed to ultraviolet irradiation

3 討 論

3.1 胚胎的存活率與紫外線之間具有明顯的劑量依賴關(guān)系

紫外線照射可以使DNA分子中同一條鏈相鄰的胸腺嘧啶堿基形成以共價鍵連接成嘧啶二聚體。嘧啶二聚體的積累影響DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能受阻，DNA損傷增加[10]。通過研究可得，紫外線照射對中華鋸齒米蝦胚胎的發(fā)育造成影響，且紫外線照射劑量越強(qiáng)，影響越大，胚胎出現(xiàn)畸形和死亡的現(xiàn)象增加。Volz等[4]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線暴露對草蝦的孵化率有明顯影響。Sayed等[3]研究發(fā)現(xiàn)，青鳉胚胎變形和死亡數(shù)量隨紫外線照射劑量增加而增加。嚴(yán)正凜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射劑量對九孔鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)胚胎的孵化率有顯著影響。本試驗紫外線照射胚胎的結(jié)果表明，中華鋸齒米蝦胚胎的存活率與紫外線具有明顯的劑量依賴關(guān)系，與上述報道基本一致。

紫外線照射劑量越大，引起的DNA損傷越多。當(dāng)DNA損傷密度達(dá)到一定程度后，將會對功能基因產(chǎn)生影響，加速胚胎死亡，并且DNA修復(fù)作用是有限的，當(dāng)照射劑量過大時，修復(fù)作用來不及彌補(bǔ)紫外線造成的損傷，細(xì)胞將發(fā)生凋亡，致使胚胎存活率降低。

3.2 不同發(fā)育時期胚胎對紫外線的敏感性不同

本試驗結(jié)果顯示，處于囊胚期的中華鋸齒米蝦胚胎對紫外線的敏感程度較高，卵裂期、原腸胚期、無節(jié)幼體Ⅰ期的敏感程度較低，并且處于卵裂期和無節(jié)幼體Ⅰ期的胚胎，在24 h時對紫外線照射劑量的改變不敏感。Amemiya等[12]研究發(fā)現(xiàn)，馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)胚胎不同發(fā)育時期對紫外線敏感程度也不同。

不同的發(fā)育階段細(xì)胞分裂的旺盛程度不同，分裂過程中紫外線照射形成的嘧啶二聚體影響DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能受阻，從而導(dǎo)致胚胎畸形和死亡。同時活性氧及氧自由基介導(dǎo)了紫外線引發(fā)DNA損傷的過程，促進(jìn)了二聚體的形成[13]。處于卵裂期的胚胎母源的活性物質(zhì)較多，對活性氧自由基產(chǎn)生了抑制，因此同樣的紫外線照射劑量產(chǎn)生的影響較小。處于囊胚期的胚胎，細(xì)胞處于不斷地分裂中，紫外線照射引發(fā)DNA損傷，進(jìn)而引起有絲分裂間期DNA復(fù)制過程紊亂，致使細(xì)胞不能正常分裂，最終胚胎死亡。處于原腸胚和無節(jié)幼體Ⅰ期的胚胎，由于細(xì)胞開始分化，基因開始表達(dá)，消除活性氧自由基的酶活性較高，同樣的紫外線照射劑量產(chǎn)生的影響較小。

3.3 隨著紫外線劑量的增加胚胎發(fā)育延緩

薛俊增等[8]曾報道，中華鋸齒米蝦自第一次卵裂發(fā)育至囊胚期約需47 h，再經(jīng)33 h后進(jìn)入原腸胚期，30 h后進(jìn)入無節(jié)幼體Ⅰ期，72 h后進(jìn)入無節(jié)幼體Ⅱ期，50 h后進(jìn)入無節(jié)幼體Ⅲ期，96 h后進(jìn)入無節(jié)幼體Ⅳ期，最后經(jīng)48 h幼體破膜而出。與上述報道相比，本試驗對照組與上述報道發(fā)育時間基本一致，試驗組隨著紫外線照射劑量的增加，胚胎發(fā)育有所延緩。研究表明，紫外線照射對牛(Bostaurus)[14]和青鳉[3]的胚胎發(fā)育也有延緩作用。

胚胎修復(fù)紫外線照射產(chǎn)生DNA損傷需要一定的時間，是胚胎發(fā)育延緩的主要原因之一。

3.4 暴露時間對胚胎存活率有影響

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，可能存在同樣的紫外線照射劑量，照射的時間越久，胚胎的存活率越高。有研究表明，通過核苷酸切除修復(fù)[15]和堿基切除修復(fù)[16]可以修復(fù)DNA損傷。但其修復(fù)作用有限，同樣的紫外線照射劑量，達(dá)到該劑量的時間越短，DNA的損傷越難以及時修復(fù)，細(xì)胞將發(fā)生凋亡，致使胚胎存活率降低，畸形率升高。關(guān)于暴露時間對胚胎存活率的具體影響還需進(jìn)一步探究。

本試驗結(jié)果表明，中華鋸齒米蝦在不同的紫外線照射劑量下、照射不同時間及不同發(fā)育階段均有一定的存活率，因此推斷，紫外線等高能射線照射中華鋸齒米蝦胚胎是一種可行的人工誘導(dǎo)方法。該研究為紫外線誘導(dǎo)中華鋸齒米蝦體色突變體的形成工作奠定了必要的基礎(chǔ)。