趙嶝科，劉 慧，張少斌，陳小杏，劉金洲，辛 橋

(1.沈陽農業(yè)大學 生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866； 2.沈陽農業(yè)大學 土地與環(huán)境學院， 遼寧 沈陽 110866 )

螺旋藻(Spirulina)是一種光合自養(yǎng)的原核生物——藍藻，其蛋白質含量高達干質量的60%以上，必需氨基酸種類齊全，而且其比例符合人和動物的需要，此外還富含多不飽和脂肪酸、各種維生素、必需微量元素以及葉綠素、類胡蘿卜素、葉黃素等天然色素，具有促進生長、抗氧化、增強抵抗力、改善觀賞魚體色等多種作用，廣泛應用在功能保健食品、化妝品、水產養(yǎng)殖飼料及飼料添加劑等領域[1-5]。

鎳廣泛存在于自然界，在土壤、水和空氣中都有微量鎳的存在，鎳是植物、動物(包括人)和微生物等各種生物體的必需微量元素[6-7]。鎳作為脲酶、羧肽酶、谷草轉氨酶、葡萄糖變位酶等多種酶的輔助因子或激活劑，參與各種酶促反應，具有多種生理功能，如促進植物氮代謝，促進動物對鐵的吸收和利用；促進生長激素分泌等[8-9]。植物缺鎳，會影響氨基酸代謝，從而抑制營養(yǎng)生長和生殖生長，難以完成生命周期[9-10]。畜、禽等動物缺鎳，骨鈣下降，骨組織、皮膚以及肝臟異常，生長速度下降，死亡率增加等[6-8]。補充適量的鎳，可顯著改善鎳缺乏癥，并促進植物和動物生長[11-12]。然而，隨著現代工農業(yè)的發(fā)展，鎳也成為污染環(huán)境的重金屬元素之一[13]。微藻不僅營養(yǎng)豐富，而且對重金屬具有吸附和富集作用，是一種新興的重金屬污染生物修復材料[14]。

微量鎳離子(Ni2+)促進銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)等藻類的生長，但高含量的Ni2+則抑制其生長，出現中毒癥狀，不同藻類適宜生長的Ni2+含量不同[15]。目前，有關Ni2+對螺旋藻生長的影響未見相關報道。筆者研究了不同含量的Ni2+對螺旋藻生長以及藻膽蛋白含量的影響，可為降低螺旋藻生產成本，促進其作為功能保健食品及動物飼料的開發(fā)應用，及利用螺旋藻處理水體鎳污染提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

直線型鈍頂螺旋藻突變株(Spirulinaplatensis,SP-Dz)由中國農業(yè)大學饋贈。原始藻株是江西農科院引自印度，原產于墨西哥的藻株SP. D，經多年培養(yǎng)后形成的直線型突變株。

1.2 螺旋藻培養(yǎng)及生長曲線繪制

將鈍頂螺旋藻藻種接種于若干個50 mL三角瓶中，添加不同體積的Ni2+母液(NiSO4·6H2O配制)，配制成Ni2+質量濃度分別為0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 μg/mL的Zarrouk氏培養(yǎng)液[11]，每瓶藻液定容至30 mL，調整藻種接種密度，使藻液的560 nm光密度值(D560)為0.225，每個處理3個平行，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(28±1) ℃，連續(xù)光照。使用722型分光光度計，每日相同時間測定藻液D560，繪制生長曲線[16]。

1.3 藻細胞吸收光譜測定

培養(yǎng)6 d，藻細胞長到D560為0.6～0.8時培養(yǎng)結束，對藻液適當稀釋，使各個波長的光密度值為0.6～0.8，使用722分光光度計，分別測定0 μg/mL和0.5 μg/mL Ni2+處理組藻細胞在400～750 nm間的吸收光譜[16]。

1.4 藻膽蛋白含量測定

當培養(yǎng)結束，離心收集藻體，加入10 mL藻膽蛋白提取緩沖液，使用超聲波細胞破碎儀，設定超聲功率300 W，超聲6 s，間隔6 s，重復10次，然后10 000 r/min離心10 min，取上清液，使用分光光度計，分別測定620 nm和650 nm的光密度(D620和D650)，根據經驗公式[17]略有修改，分別計算藻藍蛋白質量濃度(ρ1)、別藻藍蛋白質量濃度(ρ2)以及藻膽蛋白總質量濃度(ρ3)。

ρ1/mg·mL-1=(D620-0.474×D650)/5.34

ρ2/mg·mL-1=(D650-0.208×D620)/5.09

ρ3/mg·mL-1=ρ1+ρ2

1.5 數據分析

采用Excel 2016和SPSS軟件對試驗數據進行處理和統(tǒng)計分析，數值均表示為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 Ni2+對螺旋藻生長的影響

Ni2+對螺旋藻生長的影響見圖1、圖2。由圖1可見，培養(yǎng)第1天，D560值沒有明顯增長，螺旋藻需適應新的培養(yǎng)環(huán)境，自培養(yǎng)的第2日開始，螺旋藻生長逐漸加快，不同Ni2+質量濃度處理之間，生長趨勢基本相同，但質量濃度為0.5 μg/mL的Ni2+對螺旋藻生長具有顯著的促進作用。由圖2可見，螺旋藻培養(yǎng)6 d累積的生物量，當Ni2+質量濃度低于0.5 μg/mL時，隨質量濃度的增加，螺旋藻累積的生物量逐漸增加，當Ni2+質量濃度為0.5 μg/mL時，螺旋藻累積的生物量最多，與其他處理差異顯著(P<0.05)。而Ni2+質量濃度為1.0 μg/mL時，螺旋藻累積生物量雖然高于0 μg/mL，但略低于0.05 μg/mL(經典Zarrouk培養(yǎng)基中的Ni2+質量濃度)，表明過高質量濃度的Ni2+不能顯著促進螺旋藻生長，還可能會產生抑制作用。

圖1 不同質量濃度Ni2+對螺旋藻生長曲線的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Ni2+ on growth curve of Spirulina

圖2 不同質量濃度Ni2+對螺旋藻累積生物量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Ni2+ on accumulated biomass of Spirulina 不同質量濃度間，柱標小寫字母不同，表示差異顯著(P<0.05). Means with different letters are significant differences (P<0.05) among different concentrations.

2.2 Ni2+對螺旋藻吸收光譜的影響

由于0.5 μg/mL Ni2+處理能顯著促進螺旋藻生長，為了分析鎳促進螺旋藻生長的原因，測定了該質量濃度Ni2+對螺旋藻吸收光譜的影響(圖3)。由圖3可見，不添加Ni2+時，螺旋藻藻細胞的吸收光譜主要有3個吸收峰，分別位于438～442 nm(葉綠素a在藍紫光區(qū)的吸收峰)、610～630 nm(藻藍蛋白的吸收峰)、674～684 nm(別藻藍蛋白和葉綠素a在紅橙光區(qū)的吸收峰)。0.5 μg/mL Ni2+處理的藻細胞，葉綠素a在藍光區(qū)的吸收峰發(fā)生了顯著的變化，在440 nm的吸收峰消失，取而代之的是，在430 nm左右處出現一個小的吸收峰，在448 nm左右處出現一個大的吸收峰。藻藍蛋白、別藻藍蛋白和葉綠素a在紅橙光區(qū)的吸收峰沒有明顯變化。以上結果說明，Ni2+通過改變葉綠素在藍紫光區(qū)域的吸收光譜，影響螺旋藻光合作用，進而影響螺旋藻的生長。

2.3 Ni2+對螺旋藻藻膽蛋白含量的影響

不同質量濃度Ni2+對螺旋藻藻膽蛋白含量的影響見表1。由表1可見，在Ni2+質量濃度為0.05～0.5 μg/mL時，隨著Ni2+質量濃度的增加，藻藍蛋白、別藻藍蛋白及藻膽蛋白總質量濃度增加，當Ni2+質量濃度達到1.0 μg/mL時，藻膽蛋白質量濃度開始明顯下降，但略高于空白對照。

圖3 Ni2+對螺旋藻細胞吸收光譜的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Ni2+ on the absorption spectra of Spirulina cells

表1 不同質量濃度Ni2+對螺旋藻藻膽蛋白質量濃度的影響

3 討 論

3.1 鎳對藻類生長的影響

適當含量的鎳不僅促進大麥等高等陸生植物生長[18]，而且能促進水生植物水鱉(Hydrocharisdubia)[19]、大型褐藻海帶(Saccharinajaponica)[20]以及多種微藻的生長[21]。已有研究表明，0.05 μg/mL的Ni2+可促進綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)的生長[22]，促進銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的生長的Ni2+質量濃度為0.1 μg/mL[23]，促進斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)生長的Ni2+質量濃度為0.1～0.5 μg/mL，鐮形纖維藻(Ankistrodesmusfalcatus)和綠球藻(Chlorococcumsp.)生長的最佳Ni2+質量濃度為0.5 μg/mL[21]。本試驗表明，Ni2+質量濃度為0.05～1.0 μg/mL時，均能促進螺旋藻生長，提高螺旋藻生物累積量，其中以0.5 μg/mL的促進效果最顯著，這一結果與鎳對其他微藻生長的影響相似。

3.2 鎳對藻類色素及藻細胞光吸收的影響

鎳通過影響藻類色素含量以及藻細胞的吸收光譜，影響光合作用，進而影響藻類的生長。0.05 μg/mL的Ni2+提高綠色巴夫藻葉綠素a的含量，從而促進其生長，當Ni2+高于此質量濃度時，葉綠素a含量下降，生長受到抑制[22]。銅綠微囊藻藻細胞有3個吸收峰，分別為葉綠素a在藍紫光區(qū)的吸收峰為438 nm，藻藍蛋白的吸收峰在616 nm，別藻藍蛋白和葉綠素a在紅橙光區(qū)的吸收峰為673 nm，不同質量濃度(0.1～1.0 μg/mL)的Ni2+處理，導致藻細胞所有吸收峰均發(fā)生不同程度的紅移，別藻藍蛋白含量下降，導致光吸收強度下降[15]。0.1～0.3 μg/mL的Ni2+提高藻藍蛋白含量，并提高藻膽蛋白光吸收強度，以0.1 μg/mL Ni2+處理效果最佳，與促進生長的最佳質量濃度相同[15]。當Ni2+質量濃度高于5.0 μg/mL時，處理48 h以上，銅綠微囊藻和集胞藻(Synechocystissp.)葉綠素a含量均下降，藻細胞光吸收強度下降，因而抑制其生長[23]。螺旋藻與銅綠微囊藻同屬藍藻，因而螺旋藻藻細胞的各吸收峰位置與銅綠微囊藻相似，0.5 μg/mL的Ni2+處理，導致葉綠素a的吸收峰發(fā)生較大紅移。葉綠素a中含有Mg2+，體外試驗表明，脫鎂葉綠素可以與Ni2+、Cu2+、Co2+等結合，生成葉綠素衍生物[24]，因此在生物體內，Ni2+可能通過離子競爭作用，影響或替代葉綠素a中的Mg2+，從而影響葉綠素a的吸收光譜，進而影響螺旋藻的生長。

0.5 μg/mL的Ni2+處理，顯著提高了藻藍蛋白、別藻藍蛋白和藻膽蛋白的含量，但對藻藍蛋白和別藻藍蛋白吸收峰的位置沒有顯著影響。鎳作為脲酶的組分，與氮代謝密切相關，而氮代謝則與蛋白質代謝密切相關[9]，因此，鎳可能促進了藻膽蛋白的合成，或者減少了其降解，從而提高了藻膽蛋白含量。當Ni2+質量濃度低時，主要與檸檬酸、蘋果酸等有機酸結合，當質量濃度增加時，才會與蛋白質多肽鏈相結合，因而，低質量濃度Ni2+對藻膽蛋白的吸收光譜沒有顯著影響。藻膽蛋白作為螺旋藻的光合作用蛋白，其含量變化趨勢與螺旋藻累積生物量的測定結果基本一致，藻膽蛋白含量越高，光合作用越強，因而螺旋藻生長越快。

3.3 藻類在水體鎳污染修復中的應用

雖然鎳是很多生物體的必需微量元素，但超過一定量，同樣會造成重金屬中毒[13]。根據我國生活飲用水衛(wèi)生標準(GB 5749—2006)，飲用水鎳的極限值為0.02 μg/mL，漁業(yè)水質標準(GB 11607—1989)規(guī)定的漁業(yè)用水鎳極限值為0.05 μg/mL。根據銅、鈷、鎳工業(yè)污染源排放標準(GB 25467—2010)，工業(yè)排污廢水中鎳質量濃度極限值為1 μg/mL，工業(yè)廢水排污以及化肥在農業(yè)上的大量應用，會造成局部水域鎳超標。水生生物能夠耐受一定含量的鎳污染，Ni2+質量濃度為0.1～10.0 μg/mL，斜生柵藻、鐮形纖維藻以及綠球藻均能生長[21]，大黃魚(Pseudosciaenacrocea)在Ni2+質量濃度為0.46 μg/mL[25]，唐魚(Tanichthysalbonubes)在Ni2+質量濃度為0.927 μg/mL時都能安全生長[26]，但鎳可能在這些水體生物中富集和積累，并通過食物鏈逐級傳導，最終可能會威脅人類健康[27]。

利用藻類吸附、吸收水體重金屬，不僅可以修復水環(huán)境，而且還能回收重金屬，節(jié)約能源[28]。不同藻類對Ni2+的耐受劑量不同。當Ni2+質量濃度高于0.1 μg/mL時即抑制綠色巴夫藻生長[22]。0.5 μg/mL的Ni2+顯著抑制羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)生物量的積累[29]。1 μg/mL的Ni2+顯著抑制銅綠微囊藻的生長[15]。5.8 μg/mL的Ni2+對橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea)的生長有明顯的抑制作用,橢圓小球藻24 h對Ni2+的清除率超過95%[30]。在Ni2+質量濃度為0.2～3.2 μg/mL時，鐮形纖維藻對鎳的吸附和吸收具有質量濃度依賴性，3.2 μg/mL時達到最大值，累積系數達382倍[31]。由此可見，不同藻類可以耐受一定劑量的Ni2+污染，并對Ni2+具有吸附和富集作用。

4 結 論

本試驗表明，不同藻類生長所需要的Ni2+最適質量濃度不同，利用低質量濃度Ni2+可提高螺旋藻生物量，降低螺旋藻生產成本，從而促進其在飼料、食品等領域的開發(fā)應用。而高達1.0 μg/mL的Ni2+對螺旋藻生長沒有抑制作用，說明螺旋藻可以耐受一定劑量的Ni2+，可能應用于Ni2+污染水體的治理等環(huán)保領域。