范栩源,王振輝,任 媛,3,國麗媛,孫啟睿,王軼南,李 強

( 1.大連海洋大學,遼寧 大連 116023; 2.鹽城工學院 海洋與生物工程學院,江蘇 鹽城 224051;3.大連理工大學 生物工程學院,遼寧 大連 116024 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動物門海參綱,處于從無脊椎動物向脊椎動物分化的獨特進化階段,是棘皮動物門中經濟意義較大的一個類群,也是國內外重要的海產經濟物種[1]。仿刺參體腔中充滿了體腔液,其中懸浮著不同種類的體腔細胞[2],這些體腔細胞在抵御外來異物入侵等免疫反應中顯得極為重要,充當了關鍵的角色[3-4]。仿刺參具有復雜的水管系統(tǒng),具有運動、呼吸和排泄等功能,其是一個由體腔產生的充滿液體的管道網絡,主要由石管、環(huán)狀水管和輻水管組成。石管嵌在背懸腸膜內,末端成為篩板,仿刺參的篩板生在體腔內,因而水管內的液體來自于體腔液[5-7]。已有研究表明,仿刺參水管系統(tǒng)內也懸浮有大量體腔細胞,細胞密度約為體腔中的一半,細胞種類與體腔中的細胞相同,但不同種類的細胞比例存在顯著差異[8];同時,仿刺參水管系統(tǒng)內體腔液上清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等免疫酶活性與體腔內該物質也存在顯著差異[9]。由此可見,仿刺參的水管系統(tǒng)和體腔間并不是無限暢通的。

為進一步探究仿刺參水管系統(tǒng)與體腔的關聯性及連通性,筆者分別利用天然色素(甜菜紅)、生物大分子[抗谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)標簽重組蛋白]、無活性外源顆粒物(熒光微球)、病原菌[燦爛弧菌(Vibriosplendidus)]及非致病菌[大腸桿菌(Escherichiacoli)]等物質進行仿刺參體腔注射,檢測不同時間點上述物質在仿刺參體腔中和水管系統(tǒng)(以波里氏囊為代表)內的分布,以期探究仿刺參水管系統(tǒng)與體腔間物質交換問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用仿刺參購于山東日照某養(yǎng)殖場,體質量(65±10) g,置于60 cm×30 cm×40 cm 塑料水族箱內暫養(yǎng),養(yǎng)殖用水為鹽城市射陽縣海域砂濾海水,鹽度28～30,水溫16～18 ℃,暫養(yǎng)期間不間斷充氧,定期換水,暫養(yǎng)7 d后進行試驗。試驗用甜菜紅購于廣州威倫食品有限公司;熒光微球(d=1 μm)購于賽默飛世爾科技有限公司;燦爛弧菌、大腸桿菌由鹽城工學院水生動物免疫與疾病研究所保存;GST標簽蛋白單克隆抗體購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仿刺參水管系統(tǒng)與體腔間物質交換分析

1.2.1 體腔注射生物色素

利用提取自甜菜根部的天然著色色素——甜菜紅加入無菌海水配制體腔液染色劑母液(稱取5 g固體粉末溶于10 mL無菌海水,此時呈現出紅色較為鮮艷的液體),將母液稀釋2倍進行仿刺參體腔注射(500 μL/頭)。分別于注射前和注射后6、12 h解剖仿刺參,每個時間點采集3頭,收集體腔液和波里氏囊腔液(簡稱囊腔液)。具體做法如下:解剖仿刺參,抽取體腔液置于2 mL離心管,3000 r/min(離心半徑8.7 cm)離心5 min,收集上清液,以白色為背景色觀察體腔液顏色;利用手術線將波里氏囊結扎后,剪下波里氏囊,用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗后,白色背景板上拍照,同時抽取囊腔液置于2 mL離心管,離心取上清液,以白色為背景色觀察囊腔液顏色。

1.2.2 體腔注射GST標簽蛋白

利用實驗室保藏的含有pGEX-4T-2質粒的BL21感受態(tài)細胞對GST標簽蛋白進行誘導表達[10],并利用瓊脂糖樹脂通過親和層析的方法對表達的蛋白進行純化,調整蛋白質量濃度至5 mg/mL,進行仿刺參體腔注射(200 μL/頭)。分別于注射前和注射后6、12 h解剖仿刺參,每個時間點采集3頭,收集體腔液和囊腔液,3000 r/min(離心半徑8.7 cm)離心20 min。上清液經SDS-PAGE和蛋白轉印后,利用抗GST標簽蛋白單克隆抗體通過蛋白免疫印跡試驗進行蛋白鑒定和相對定量檢測。

1.2.3 體腔注射熒光微球

將熒光微球懸浮液用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋75倍,制備熒光微球稀釋液,隨后進行仿刺參體腔注射(200 μL/頭)。分別于注射前和注射后6、12 h解剖仿刺參,每個時間點采集3頭,收集體腔液和囊腔液,制備滴片,熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4 體腔注射燦爛弧菌

利用TSB液體培養(yǎng)基進行燦爛弧菌(仿刺參致病菌)活化、培養(yǎng),以無菌海水為介質制備菌懸液(終密度2×109cfu/mL),進行仿刺參體腔注射(200 μL/頭)[11]。分別于注射前和注射后6、12、24、72 h解剖仿刺參,每個時間點采集3頭,采集體腔液和囊腔液,無菌條件下在TSA平板上進行細菌涂布,28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)。

1.2.5 體腔注射大腸桿菌

利用LB液體培養(yǎng)基進行大腸桿菌(仿刺參非致病菌)活化、培養(yǎng),以無菌磷酸鹽緩沖液為介質制備菌懸液(終密度2×109cfu/mL),進行仿刺參體腔注射(200 μL/頭)。試驗分組和操作同1.2.4。

2 結 果

2.1 生物色素對體腔液著色后示蹤“體腔-水管系統(tǒng)”的流通性

通過對仿刺參體腔注射適宜質量濃度的甜菜紅溶液6 h和12 h后,解剖仿刺參,發(fā)現天然色素已將體腔液完全著色(鮮紅色),波里氏囊的外觀顏色由注射前的透明色變?yōu)轷r紅色,由此說明著色的體腔液已經擴散至水管系統(tǒng)內(圖1),與此同時,在同一時間點內抽取的體腔液與囊腔液顏色深淺相當(圖2),因此判斷仿刺參水管系統(tǒng)和體腔間存在液體互通現象。

圖1 體腔注射甜菜紅溶液后仿刺參波里氏囊顏色觀察Fig.1 Cystic fluid color observation of polian vesicle in sea cucumber A. japonicus injected with beet red solutiona～c.注射前;d～f.甜菜紅注射后6 h;g～i.甜菜紅注射后12 h.a—c.without injection;d—f.6 h after injection by beet red solution; g—i.12 h after injection by beet red solution.

圖2 注射甜菜紅后仿刺參體腔液和波里氏囊腔液顏色對比Fig.2 Color contrast of fluid from coelom and polian vesicle in sea cucumber A. japonicus injection with beet reda1～a3.注射前體腔液;b1～b3.注射前囊腔液;c1～c3.注射后6 h體腔液;d1～d3.注射后6 h囊腔液;e1～e3.注射后12 h體腔液;f1～f3.注射后12 h囊腔液.a1—a3.coelomic fluid from coelom without injection; b1—b3.coelomic fluid from polian vesicle without injection ; c1—c3. coelomic fluid from coelom at 6 h after injection ; d1—d3. coelomic fluid from polian vesicle at 6 h after injection ; e1—e3.coelomic fluid from coelom at 12 h after injection; f1—f3.coelomic fluid from polian vesicle at 12 h after injection.

2.2 體腔注射GST標簽蛋白后囊腔液中蛋白示蹤

體腔注射GST標簽蛋白后6、12 h,收集仿刺參體腔液和囊腔液,通過SDS-PAGE檢測發(fā)現,與注射前相比,注射GST標簽蛋白后仿刺參的體腔液和囊腔液中均有明顯蛋白條帶增加,分子質量約為26 ku(圖3a)。為進一步證明該蛋白為GST標簽蛋白,利用抗GST標簽蛋白特異性單克隆抗體,通過蛋白免疫印跡試驗進行檢測,結果顯示注射>GST標簽蛋白后,仿刺參體腔液中有大量目標蛋白存在,而囊腔液中僅有少量蛋白存在(圖3b);利用Graphpad Prism v9.2.0.332軟件進行定量統(tǒng)計分析,結果表明,注射后6 h囊腔液中GST標簽蛋白含量約為體腔中的12%,注射后12 h約為18%(圖4)。

圖3 GST標簽蛋白注射體腔后在仿刺參體腔液和囊腔液中的分布情況Fig.3 Protein distribution of GST-tag in coelom and polian vesicle in sea cucumber A. japonicus injection with GST-rp1.注射前囊腔液;2.注射前體腔液;3.注射6 h后的囊腔液;4.注射后6 h體腔液;5.注射12 h后囊腔液;6.注射12 h后體腔液;7.GST標簽蛋白;M.蛋白標志.1.coelomic fluid from polian vesicle without injection; 2.coelomic fluid from coelom without injection; 3.coelomic fluid from polian vesicle at 6 h after injection; 4.coelomic fluid from coelom at 6 h after injection; 5.coelomic fluid from polian vesicle at 12 h after injection; 6.coelomic fluid from coelom at 12 h after injection; 7.GST-rp;M.protein marker.

圖4 注射不同時間點仿刺參體腔液和囊腔液中GST標簽蛋白的相對含量Fig.4 The relative contents of GST-tag protein in the coelomic fluid from coelom and polian vesicle in sea cucumber A. japonicus injection with GST-rp誤差線代表標準偏差(n=5); 星號代表差異顯著性(**0.001

2.3 體腔注射熒光微球后波里氏囊腔液中微球示蹤

注射熒光微球后6、12 h,收集仿刺參體腔液和囊腔液,制備滴片,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現,仿刺參體腔液中可發(fā)現大量的綠色熒光微球,但對應的囊腔液中未發(fā)現明顯的熒光微球信號(圖5)。

圖5 體腔注射熒光微球后仿刺參體腔液和囊腔液中熒光微球的分布情況 Fig.5 Distribution of fluorescent microspheres in coelomic fluid from coelom and polian vesicle in sea cucumber A. japonicus exposed to injectiona.注射前體腔液;b、c.注射后6、12 h 體腔液;d.注射前囊腔液;e、f.注射后6、12 h囊腔液.a.coelomic fluid from coelom without injection; b, c.coelomic fluid from coelom at 6 and 12 h after injection; d.coelomic fluid from polian vesicle without injection; e, f.coelomic fluid from polian vesicle at 6 and 12 h after injection.

2.4 體腔注射燦爛弧菌后波里氏囊腔液中細菌示蹤

注射仿刺參致病菌——燦爛弧菌后6、12、24、72 h,收集仿刺參體腔液和囊腔液,進行平板涂布及培養(yǎng),觀察發(fā)現,燦爛弧菌注射前仿刺參體腔液和囊腔液中均未分離到細菌,注射后6、12、24、72 h體腔液中均有大量細菌存在,但對應的囊腔液內均未分離到細菌(圖6)。

圖6 燦爛弧菌注射后不同時間點仿刺參體腔液和囊腔液中細菌的涂布及生長Fig.6 Bacteria culture of coelomic fluid from coelom and polian vesicle in sea cucumber A. japonicus at different time after injection with V. splendidusa.注射前體腔液;b～e.注射后6、12、24、72 h體腔液;f.注射前囊腔液;g～j.注射后6、12、24、72 h囊腔液.a.coelomic fluid from coelom without injection; b—e.coelomic fluid from coelom at different points after injection 6, 12, 24, 72 h, respectively; f.coelomic fluid frompolian vesicle without injection; g—j.coelomic fluid from polian vesicle at different points after injection 6, 12, 24, 72 h, respectively.

2.5 體腔注射大腸桿菌后波里氏囊腔液中細菌示蹤

注射仿刺參非致病菌——大腸桿菌后6、12、24、72 h,收集仿刺參體腔液和囊腔液,進行平板涂布及培養(yǎng),觀察發(fā)現,大腸桿菌注射前仿刺參體腔液和囊腔液中均未分離到細菌,注射后6、12、24、72 h體腔液中均有大量細菌存在,但對應的囊腔液內均未分離到細菌(圖7)。

圖7 大腸桿菌注射后不同時間點仿刺參體腔液和囊腔液的細菌涂布及生長Fig.7 Culture of bacteria in coelomic fluid from coelom and polian vesicle in sea cucumber A. japonicus at different points after injection with E. colia.注射前體腔液;b～e.注射后6、12、24、72 h體腔液;f.注射前囊腔液;g～j.注射后6、12、24、72 h囊腔液.a.coelomic fluid from coelom without injection; b—e.coelomic fluid from coelom at different points after injection 6, 12, 24, 72 h, respectively; f.coelomic fluid from polian vesicle without injection; g—j.coelomic fluid from polian vesicle at different points after injection 6, 12, 24, 72 h, respectively.

3 討 論

仿刺參具有一套復雜的水管系統(tǒng),由于其篩板開口于體腔內,所以管腔內充滿體腔液和體腔細胞,水管系統(tǒng)可以通過調節(jié)體腔液流進和流出管足,從而支配管足的活動[12]。過去觀點普遍認為仿刺參水管系統(tǒng)內的體腔液和體腔細胞與體腔中的體腔液和體腔細胞是相同的,然而近年來的研究發(fā)現仿刺參水管系統(tǒng)內體腔細胞與體腔中體腔細胞種類相似,但亞群組成存在差異。水管系統(tǒng)內以帶偽足的球形細胞為主,淋巴細胞次之;體腔內則以淋巴細胞為主,帶偽足的球形細胞次之,且每一種類型的細胞在其細胞數量和比例上都存在顯著差異;仿刺參體腔中體腔細胞密度約為水管系統(tǒng)內體腔細胞密度的2倍[8]。此外有研究指出,仿刺參水管系統(tǒng)和體腔內體腔液上清免疫相關酶活性存在差異,水管系統(tǒng)中的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性顯著高于體腔中,而體腔中的超氧化物岐化酶、過氧化氫酶活性顯著高于水管系統(tǒng)[9]。波里氏囊作為刺參水管系統(tǒng)的附屬物,過去普遍認為其主要功能是調節(jié)水管系統(tǒng)內的壓力[13],但隨著生物認知的發(fā)展,其生物學功能逐漸被重新認識。近年來研究證實,仿刺參波里氏囊可能是一種潛在的“造血組織”,且在響應由病原菌引起的免疫反應中發(fā)揮了重要的作用[14-15];此外,波里氏囊被認為是一種炎癥反應器官,其對異物刺激可表現出明顯的炎癥現象,有研究者甚至推測其在功能上類似于脊椎動物免疫器官——淋巴結[16-17]。雖然仿刺參水管系統(tǒng)可以通過篩板調節(jié)體腔液的流動與進出,但不同類型的實體物質能否在水管系統(tǒng)和體腔間流通目前尚不清楚。因此,筆者聚焦于仿刺參水管系統(tǒng)與體腔的關聯性及連通性,以期為后續(xù)探究仿刺參水管系統(tǒng)的深層生理構造及其在仿刺參中的生物學作用奠定理論基礎。

3.1 可溶性物質在體腔和水管系統(tǒng)間的連通性

甜菜紅和GST標簽蛋白均具有可溶性的特點,且具有一定的穩(wěn)定性[18]。筆者利用上述2種物質分別代表生物小分子和大分子來探究仿刺參體腔和水管系統(tǒng)間的連通性。結果發(fā)現,仿刺參體腔內注射甜菜紅和GST標簽蛋白后6 h,仿刺參波里氏囊腔內可檢測到甜菜紅和GST標簽蛋白的分布,表明可溶性分子可以從仿刺參體腔流入到水管系統(tǒng)中,其中,小分子可溶性的物質可以完全自由地流通于體腔和水管系統(tǒng)之間,生物大分子亦可進入水管系統(tǒng),但擴散相對較緩,擴散量相對較少。在12 h時,仿刺參體腔中天然色素甜菜紅較6 h顏色變淺。在體腔注射12 h時,波里氏囊腔液中GST標簽蛋白濃度較6 h提高,同時,體腔液中GST標簽蛋白濃度相比6 h卻降低。推測出現此種現象的原因為:一方面隨著擴散時間的延長,來自于體腔的GST標簽蛋白不斷在囊腔中積累;另一方面仿刺參體腔內進行著永不停息的自我更新代謝,體腔內的外源異物,如甜菜紅染料和GST標簽蛋白會被逐漸稀釋甚至被清除。

3.2 外源顆粒物質在體腔和水管系統(tǒng)間的連通性

熒光微球粒度均一、分散性好、穩(wěn)定性強,對機體細胞無毒副作用,在藍色激發(fā)光下可發(fā)出綠色熒光,因此是生物學研究中較為理想的示蹤工具[19]。筆者利用熒光微球模擬無活性的外源微粒探究仿刺參體腔和水管系統(tǒng)間的連通性,結果發(fā)現,仿刺參體腔內注射熒光微球6 h和12 h后,體腔液中存在大量綠色熒光微球,在囊腔液中未發(fā)現大量的熒光微球信號。燦爛弧菌和大腸桿菌作為有活性的外源顆粒物,大小均為微米級,仿刺參體腔注射后6～72 h,體腔液中均可檢測到大量細菌的存在,而囊腔液中在各時間點均未發(fā)現細菌分布。由此可以判斷,外源顆粒物(有活力或無活力)不能通過體腔進入到水管系統(tǒng)。由于仿刺參水管的末端篩板開口于體腔中,開口處有許多帶有纖毛的小孔,有可能阻擋了包括熒光微球和細菌在內的所有外源顆粒物質進入水管系統(tǒng)[12],但究其原因是因為篩板的物理阻隔還是存在其他的防御機制需要進一步深入研究。有研究表明,仿刺參的體腔細胞具有一定的吞噬能力,能夠有效識別和吞噬入侵到體腔中的外源物質[20]。有學者將異硫氰酸熒光素標記的熒光微球加入原代培養(yǎng)的仿刺參體腔細胞培養(yǎng)液中或將熒光微球直接注射到仿刺參體腔內,通過流式細胞儀均檢測到體腔細胞可以吞噬熒光微球[21-22],由此證實,體腔細胞具有吞噬熒光微球的能力,且吞噬后的體腔細胞可以被檢測到熒光信號。根據本試驗結果,在將熒光微球和細菌注射到仿刺參體腔后,僅僅只能在體腔中觀察到綠色熒光和細菌的存在,而在囊腔中未發(fā)現綠色的熒光微球和細菌,這從側面反映了體腔中吞噬了細菌和熒光微球的細胞并未進入水管系統(tǒng)。

4 結 論

將不同外源物質進行仿刺參體腔注射,可以明確判斷體腔與水管系統(tǒng)的關聯性和連通性。本試驗結果表明,仿刺參水管系統(tǒng)和體腔間并非無限暢通,小分子和生物大分子等可溶性物質可以流通于體腔和水管系統(tǒng)之間,但對于外源顆粒物和細菌則不能通過體腔進入到水管系統(tǒng)內。試驗結果可為后續(xù)研究仿刺參水管系統(tǒng)的生理結構和在機體中的生物學作用奠定理論基礎。