張 敬， 吉柔風， 楊 千， 丁蒙蒙， 陳 放， 徐 鶯

(四川大學生命科學學院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 成都 610065)

最初，核糖體失活蛋白是從蓖麻種子中分離純化出來的，被人們命名為ricin[1].之后，隨著研究的不斷深入，已經(jīng)在14個家族中發(fā)現(xiàn)了超過50種核糖體失活蛋白，研究較為清楚的有美洲商陸、麻瘋樹、苦瓜、相思子、絲瓜、樟樹等[2].植物核糖體失活蛋白已被證實具有N-糖苷酶活性、水解酶活性、DNA酶活性等酶學活性和抗真菌、抗病毒、抗腫瘤等生物學活性，關(guān)于其酶學活性研究的較為透徹和深入，而生物學活性的作用機制和機理，目前還沒有確切的結(jié)論[3].實驗研究表明，麻瘋樹核糖體失活蛋白Curcin具有抗腫瘤、抗真菌等生物學活性.Zhang等人從麻瘋樹子葉中提取出核糖體失活蛋白Curcin C，證明其具有N-糖苷酶活性、翻譯抑制作用、抗腫瘤活性.關(guān)于核糖體失活蛋白的作用機制，并沒有得到很清晰的驗證[4].

從麻瘋樹中分離出的核糖體失活蛋白多為Ⅰ型核糖體失活蛋白，Curcin是最早從麻瘋樹中分離出來，是由林娟等人根據(jù)前人的經(jīng)驗，純化出Curcin，該蛋白分子量為28.2 kD，等電點為8.54，并驗證具有N-糖苷酶活性、翻譯抑制活性[5].之后魏琴等人發(fā)現(xiàn)了核糖體失活蛋白Curcin 2，Curcin L等與脅迫相關(guān)的蛋白，這種特殊蛋白的存在，可能會起到保護麻瘋樹的正常發(fā)育生長、抵御不良生理環(huán)境的作用[6-7].近年來，Zhang等人從麻瘋樹子葉中分離提取出麻瘋樹核糖體失活蛋白Curcin C，活性實驗表明，Curcin和Curcin C蛋白均具有抗腫瘤活性，但兩者抗腫瘤活性效率差異較大[4,8].植物核糖體失活蛋白可抑制蛋白質(zhì)合成，也因其酶學活性和生物學活性，在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣闊的應用前景[9].也有研究顯示，西昌地區(qū)的麻瘋樹種子核糖體失活蛋白含量最高，可作為核糖體失活蛋白應用的材料來源和研究的重要原材料.這些麻瘋樹核糖體失活蛋白的特性可能與其定位、生物學作用具有緊密的關(guān)聯(lián)，一直以來是研究的熱點和重點.

麻瘋樹在中國西南和東南地區(qū)有著豐富的資源，為了研究和開發(fā)這一資源，因此本研究以此為切入點，首先探討麻瘋樹種子萌發(fā)和幼苗生長過程的形態(tài)學的變化，為后續(xù)的研究奠定一定的基礎，其次從基因?qū)用嫜芯柯榀倶浜颂求w失活蛋白的在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中的一個動態(tài)變化，以及在各個組織器官中的表達情況，進而推測其在種子萌發(fā)和幼苗形成過程中可能發(fā)揮的作用.采用生物信息學以及構(gòu)建含有GFP基因的瞬時表達載體等方法確定了這兩種蛋白的亞細胞定位信息.這些研究對于揭示其存在及發(fā)揮作用的機制具有重要的意義，同時也為這兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究打下了基礎.

2.1 材 料

購買于四川省西昌市金沙江干熱河谷地區(qū)的麻瘋樹成熟種子.

2.2 方 法

2.2.1種子萌發(fā) 選取干粒質(zhì)量達到0.68 g以上的麻瘋樹種子置于室溫條件下用水浸泡2 h，將蛭石和營養(yǎng)土等比例混合均勻，加入適量的水，保證濕潤.浸泡完畢后，將種子種入花盆中，萌發(fā)條件為30 ℃，光照/黑暗為18 h/6 h；定期澆水使得培養(yǎng)床保持一定的濕度；每天定時觀察并記錄萌發(fā)狀態(tài)，隨時準備收集各個時期的胚乳、子葉、胚根等樣品.

2.2.2Curcin、CurcinC基因表達分析 按照天根RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說明書提取材料的總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的完整度.利用PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time) (TAKARA，大連)試劑盒合成單鏈cDNA.反應完成后cDNA產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆?采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒對Curcin、CurcinC基因進行熒光定量PCR，每個樣品均重復三次以避免加樣誤差，實驗數(shù)據(jù)利用iQ5-Cycler 進行分析，分析方法為ΔΔCt 法.

2.2.3 Curcin、Curcin C蛋白表達分析 采用磷酸鹽緩沖液浸提丙酮沉淀法提取不同組織(胚根、胚軸、子葉、真葉)的總蛋白后進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體以及顯色反應.

2.2.4 生物信息學分析 利用在線網(wǎng)站Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對Curcin、Curcin C蛋白亞細胞定位進行預測，利用在線網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/對Curcin、Curcin C)蛋白信號肽進行預測.

2.2.5 農(nóng)桿菌侵染煙草葉片表達Curcin/Curcin C-GFP融合蛋白 設計引物并構(gòu)建pBI221-Curcin/pBI221-Curcin C重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌并挑選陽性克隆進行測序，采用質(zhì)粒大量提取純化試劑盒(Vigorous Plasmid Maxprep Kit)提取pBI221-Curcin/ Curcin C重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，挑選陽性單菌落轉(zhuǎn)入煙草中，注射后培養(yǎng)2～3 d，在共聚焦顯微鏡下進行熒光檢測.

2.2.6 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 參考Dr. Sheen's Lab(http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/protocols_reg.html)的操作手冊進行擬南芥原生質(zhì)體制備，利用PEG介導的方式進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，取出轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體于載玻片上，熒光共聚焦顯微鏡觀察.

2 結(jié)果

3.1 Curcin、Curcin C在種子萌發(fā)及幼苗生長過程中的動態(tài)變化

為了探究Curcin和CurcinC基因在胚乳和子葉中的表達量情況，我們采用了qRT-PCR實驗對Curcin基因和CurcinC基因在種子萌發(fā)及幼苗生長過程中各個時期的胚乳、子葉中的表達水平進行了定量分析，研究結(jié)果表明(圖1)，Curcin基因在種子萌發(fā)過程中的胚乳中的表達呈現(xiàn)C1、C3期逐漸增加，C5、C7、C9開始出現(xiàn)下降，C13、C15、C17期最少，呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢.然而，Curcin在子葉中基本沒有表達[4].CurcinC基因則在種子萌發(fā)的初始階段胚乳中C3期表達量最高，隨著萌發(fā)過程的進行，表達量逐漸下降，在C15、C17期幾乎檢測不到.在子葉中，CurcinC基因的表達經(jīng)歷了“從無到有，先上升后下降”的過程，CurcinC的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物首先在C3期出現(xiàn)，其表達量在C5時期達到最大值，隨后迅速下降，到C9期時，其水平不到最高期的10%，到C15期就低至到無法檢測的水平了.

圖1 不同萌發(fā)時期Curcin，Curcin C基因在胚乳、子葉中的表達分析

3.2 Curcin、Curcin C在幼苗中的組織特異性表達

為了探究核糖體失活蛋白在幼苗中各個組織中的表達情況，我們收集了C11時期的幼苗，分別以該時期的根、下胚軸和真葉為對象進行熒光定量實驗和Western blot雜交鑒定.熒光定量結(jié)果顯示(圖2A)，可以看出，在子葉、真葉組織中Curcin基因的表達量比CurcinC基因的表達量低，Curcin基因在這四種組織中的表達量都特別低；對于CurcinC基因來說，在真葉和子葉中的表達量很高，而在根和下胚軸中幾乎檢測不到.Western雜交實驗顯示(圖2B、C)，Curcin蛋白在根、下胚軸、子葉和真葉中幾乎不表達；Curcin C蛋白則在根、下胚軸中不表達，而在子葉和真葉中表達，且在子葉中表達量高于真葉的表達量.熒光定量實驗檢測Curcin、CurcinC基因的表達情況與Western實驗檢測結(jié)果基本一致.

圖2 Curcin, Curcin C組織特異性表達分析

3.3 Curcin和Curcin C的亞細胞定位研究

為了進一步確定Curcin 、Curcin C蛋白在亞細胞結(jié)構(gòu)上的定位，進而研究其在種子萌發(fā)和幼苗生長中所具有的功能.我們首先利用在線網(wǎng)站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/、http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/) 對Curcin、Curcin C蛋白信號肽、亞細胞定位進行預測，結(jié)果顯示兩種蛋白都含有信號肽且都定位在細胞壁上.為了對預測結(jié)果進行驗證，我們分別構(gòu)建了Curcin:GFP和CurcinC:GFP融合蛋白的植物表達載體，以35S:GFP為對照載體，分別用根癌農(nóng)桿菌介導侵染煙草葉片法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法讓其在植物細胞中瞬間表達，在激光共聚焦顯微鏡下檢測熒光信號，確定亞細胞定位信息.實驗結(jié)果如下：陽性對照組為圖3A(g、h、i)，可以看到在煙草表皮細胞的細胞膜(壁)，細胞核，細胞質(zhì)中都有表達，Curcin、Curcin C蛋白的結(jié)果分別如圖3A(a、b、c和d、e、f)，在細胞膜(壁)上可以看到熒光信號，由此可以初步的確定這兩種蛋白定位在細胞壁或者細胞膜上.之后進行亞細胞定位實驗，結(jié)果如下，陽性對照如圖3B(a、b、c、d)，在細胞質(zhì)中檢測到了熒光信號，而對于實驗組(圖3B(e、f、g、h和i、g、k、l))未檢測到熒光信號.結(jié)合這兩種方法的實驗結(jié)果，可以從側(cè)面間接的說明這兩種蛋白可能定位在細胞壁上，通過分泌到細胞外發(fā)揮相應的生物學作用.該結(jié)果與網(wǎng)站預測的結(jié)果基本一致.

圖3 Curcin, Curcin C蛋白亞細胞定位分析

4 討 論

Curcin、Curcin C蛋白是分別從麻瘋樹的種仁和子葉中提取分離純化出來的，為了更深入的了解這兩種蛋白的生物學功能，本文首先對麻瘋樹種子萌發(fā)和幼苗生長過程中各個組織器官的動態(tài)變化進行了相關(guān)的研究，通過收集不同萌發(fā)時期的胚乳和子葉材料，探討了麻瘋樹種子萌發(fā)和幼苗生長過程中Curcin、CurcinC基因在胚乳和子葉中的表達情況，并推測其在萌發(fā)及幼苗生長中所發(fā)揮的生物學作用，進而加快探索核糖體失活蛋白在生物體內(nèi)存在意義的進程.之后對Curcin、Curcin C蛋白的組織特性了進行了相關(guān)的研究，研究發(fā)現(xiàn)，Curcin基因在這四種組織中的表達量都特別低，可以認為幾乎不表達，結(jié)合Curcin基因在種子萌發(fā)中的動態(tài)變化的研究，以及Curcin 蛋白的抗真菌、抗病毒活性等，由此推測，該蛋白可能是在種子萌發(fā)過程中，既作為一種貯藏蛋白，為種子后續(xù)的萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)，又作為一種防御性蛋白維護種子的正常萌發(fā)起到一定的作用.Curcin C蛋白在真葉和子葉中都有表達，由此推測它可能是一種誘導性蛋白，在發(fā)育過程、脅迫，病毒感染等生物學過程中表達，起著保護植物正常生長的作用.

通過對核糖體失活蛋白Curcin、Curcin C的生物信息學的分析得出這兩種蛋白質(zhì)的亞細胞定位預測及信號肽的分析，對于后續(xù)的對這兩種核糖體失活蛋白的研究奠定相應的基礎.蛋白質(zhì)在亞細胞結(jié)構(gòu)中的定位，直接影響著其在生物體內(nèi)功能作用的發(fā)揮，為了進一步探究兩種核糖體失活蛋白的定位，之后通過將核糖體失活蛋白Curcin、CurcinC基因構(gòu)建綠色熒光蛋白表達載體，注射煙草和轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察這兩種蛋白的亞細胞結(jié)構(gòu)的定位，綜合兩種實驗結(jié)果表明，這兩種蛋白可能定位在細胞壁上.

文獻研究結(jié)果表明：Ⅰ型核糖體失活蛋白在亞細胞結(jié)構(gòu)中定位主要有：細胞間隙處(dioicin 1、dioicin 2、Gypsophilin)、細胞壁和細胞膜之間的擬壁體(皂草素)以及葉肉細胞的細胞壁基質(zhì)(PAP)[10-13].眾所周知，核糖體失活蛋白對核糖體具有一定的抑制作用，而這種特殊的定位分離了蛋白與自身細胞核糖體，使其自身細胞不會受到核糖體失活蛋白的毒害作用[14].并且，一般來說膜定位的蛋白質(zhì)一般會存在至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域，通過對這兩種蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)域的預測，發(fā)現(xiàn)并未含有跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)合相關(guān)文獻及實驗結(jié)果，從而推測這兩種蛋白定位在細胞壁上，通過分泌到胞外來發(fā)揮相應的生物學功能.