楊 劍，孟 鑫，李 穎，李清雪，支 政，杜惠蘭，潘 莉，陳景偉

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis， EMs)是指正常子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)、浸潤(rùn)在子宮體以外的部位[1-2]，以盆腔痛、不孕、月經(jīng)異常為主要表現(xiàn)，已成為困擾廣大女性的常見(jiàn)病。近年EMs發(fā)病率為10%～15%，疼痛是EMs的典型癥狀，臨床可見(jiàn)痛經(jīng)、盆腔痛、性交痛、排便痛等[3]，嚴(yán)重影響患者身心健康。EMs疼痛的發(fā)病機(jī)制尚不明確，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。香草酸瞬時(shí)受體亞型1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)是一類非選擇性陽(yáng)離子通道，主要分布在感覺(jué)神經(jīng)元中，是一種外周傷害性感受器，參與和介導(dǎo)了外周炎癥時(shí)傷害性初級(jí)傳入纖維的敏化過(guò)程，在熱痛、酸痛、神經(jīng)痛、內(nèi)臟痛等多種病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。TRPV1在組織損傷或炎癥過(guò)程中可被多種炎性介質(zhì)所激活[4]，在炎癥與疼痛中起著至關(guān)重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)TRPV1與EMs患者慢性盆腔痛及疼痛的程度密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制并不明確[5-7]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor， NGF)除了具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的作用外，還可通過(guò)敏化TRPV1通道，增加機(jī)體對(duì)傷害性刺激的敏感性參與疼痛的發(fā)生[8]。本研究回顧性分析EMs患者在位、異位內(nèi)膜組織中NGF和TRPV1的表達(dá)特征，分析其與EMs疼痛的相關(guān)性，并探討NGF與TRPV1在EMs疼痛發(fā)病中可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2017年1月—2019年12月在石家莊市第四醫(yī)院就診且符合EMs診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn)的EMs患者50例為觀察組，其中無(wú)痛組14例，疼痛組36例。選擇同期就診的婦科良性病變且無(wú)痛經(jīng)患者20例為對(duì)照組。全部患者知情同意，術(shù)前3個(gè)月無(wú)激素類藥物治療史。本研究經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行，批準(zhǔn)號(hào)：YXLL2020029。

1.2疼痛評(píng)分 根據(jù)視覺(jué)模擬評(píng)分法(visual analogue scale， VAS)對(duì)患者疼痛程度進(jìn)行評(píng)分。疼痛判定標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)痛；1～3分為輕度疼痛；4～6分為中度疼痛；7～10分為重度疼痛。

1.3主要試劑 兔抗NGF單克隆抗體，Epitomics公司(YH072703C)；兔抗TRPV1多克隆抗體，GeneTex公司(821303237)；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒：加拿大MBI公司(K0251)。

1.4診斷及病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 診斷標(biāo)準(zhǔn)：盆腔或B超檢查發(fā)現(xiàn)EMs病灶；疼痛(痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交痛等)、不孕；術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)[9]。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡20～50歲，未絕經(jīng)婦女；無(wú)內(nèi)科合并癥；接受其他藥物治療者停藥3個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并婦科良惡性腫瘤；合并心血管疾病；其他藥物治療停藥未超過(guò)3個(gè)月；合并有精神、神經(jīng)疾患者。

1.5取材方法 所有患者于手術(shù)時(shí)取在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜，部分組織多聚甲醛溶液固定用于免疫組化染色；部分組織-80℃保存，用于蛋白及mRNA檢測(cè)。

1.6檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1免疫組化SP法檢測(cè)NGF、TRPV1表達(dá)：采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析NGF、TRPV1表達(dá)的平均光度值，每一切片測(cè)5個(gè)視野。

1.6.2Western blot法檢測(cè)NGF、TRPV1蛋白表達(dá)：提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量后，與上樣緩沖液混勻后變性、冷卻離心，-20℃保存?zhèn)溆?。制膠，插入梳子，加入相應(yīng)蛋白樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)志物，電泳分離、轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉，加NGF、TRPV1及內(nèi)參β-actin等一抗4℃過(guò)夜，次日經(jīng)TBST漂洗3次，每次10 min，加相應(yīng)二抗孵育1 h，使用LI-COR Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描顯影。

1.6.3Real-time PCR檢測(cè)NGF mRNA、TRPV1 mRNA表達(dá)：將組織用Trizol一步法提取總RNA，測(cè)定RNA純度。PCR反應(yīng)結(jié)束后獲取循環(huán)閾值，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比，得到目的基因的Ct值，按照公式RQ=2-ΔΔCt計(jì)算目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值[10]。

2 結(jié)果

2.1免疫組化法檢測(cè)NGF、TRPV1表達(dá)情況 EMs在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜腺體及間質(zhì)中均可見(jiàn)NGF陽(yáng)性表達(dá)，以胞漿表達(dá)為主，呈棕黃色顆粒狀。見(jiàn)圖1。EMs在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜腺體中可見(jiàn)TRPV1表達(dá)，以胞漿表達(dá)為主，呈棕褐色顆粒。見(jiàn)圖2。觀察組NGF和TRPV1表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.01);疼痛組在位內(nèi)膜NGF和TRPV1表達(dá)水平高于無(wú)痛組及對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，無(wú)痛組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。疼痛組異位內(nèi)膜NGF和TRPV1表達(dá)水平高于無(wú)痛組(P<0.01)。見(jiàn)表1、2。

圖1 對(duì)照組和EMs患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜腺體及間質(zhì)中NGF表達(dá)情況(SP×400)EMs為子宮內(nèi)膜異位癥，NGF為神經(jīng)生長(zhǎng)因子；A.對(duì)照組內(nèi)膜,B.無(wú)痛組在位內(nèi)膜,C.疼痛組在位內(nèi)膜,D.無(wú)痛組異位內(nèi)膜,E.疼痛組異位內(nèi)膜;無(wú)痛組和疼痛組為EMs患者

圖2 對(duì)照組和EMs患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜腺體中TRPV1表達(dá)情況(SP×400)EMs為子宮內(nèi)膜異位癥，TRPV1為香草酸瞬時(shí)受體亞型1；A.對(duì)照組內(nèi)膜,B.無(wú)痛組在位內(nèi)膜,C.疼痛組在位內(nèi)膜,D.無(wú)痛組異位內(nèi)膜,E.疼痛組異位內(nèi)膜;無(wú)痛組和疼痛組為EMs患者

表1 對(duì)照組和EMs患者在位內(nèi)膜NGF、TRPV1表達(dá)水平比較

表2 EMs異位內(nèi)膜NGF、TRPV1表達(dá)水平比較

2.2NGF、TRPV1、VAS相關(guān)性分析 NGF與TRPV1在EMs在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.530、0.592，P<0.01、<0.05)；NGF在EMs在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的表達(dá)與VAS評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.469、0.826，P<0.05、<0.01)；TRPV1在EMs在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的表達(dá)與VAS評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.794、0.667，P均<0.01)。

2.3Western blot法檢測(cè)NGF、TRPV1蛋白表達(dá)情況 疼痛組在位內(nèi)膜NGF、TRPV1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組與無(wú)痛組(P<0.05，P<0.01)，無(wú)痛組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。疼痛組異位內(nèi)膜NGF、TRPV1蛋白表達(dá)水平高于無(wú)痛組(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖3，表3、4。

圖3 對(duì)照組和EMs患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜NGF、TRPV1蛋白的表達(dá)情況EMs為子宮內(nèi)膜異位癥，NGF為神經(jīng)生長(zhǎng)因子，TRPV1為香草酸瞬時(shí)受體亞型1；1.對(duì)照組內(nèi)膜,2.無(wú)痛組在位內(nèi)膜,3.疼痛組在位內(nèi)膜,4.無(wú)痛組異位內(nèi)膜,5.疼痛組異位內(nèi)膜;無(wú)痛組和疼痛組為EMs患者

表3 對(duì)照組和EMs患者在位內(nèi)膜NGF、TRPV1蛋白表達(dá)水平比較

表4 EMs異位內(nèi)膜NGF、TRPV1蛋白表達(dá)水平

2.4NGF和TRPV1 mRNA表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，觀察組在位內(nèi)膜NGF mRNA、TRPV1 mRNA水平顯著升高(P<0.01)；與對(duì)照組及無(wú)痛組相比，疼痛組在位內(nèi)膜NGF mRNA、TRPV1 mRNA水平升高(P<0.01)。疼痛組異位內(nèi)膜NGF mRNA、TRPV1 mRNA水平高于無(wú)痛組(P<0.01)。見(jiàn)表5、6。

表5 對(duì)照組和EMs患者在位內(nèi)膜NGF mRNA、TRPV1 mRNA表達(dá)水平比較

表6 EMs異位內(nèi)膜NGF mRNA、TRPV1 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

EMs的疼痛機(jī)制尚不明確，涉及神經(jīng)性疼痛、炎癥性疼痛、內(nèi)臟性疼痛等多種形式的病理性疼痛。已有研究證實(shí)，NGF和神經(jīng)纖維的異常表達(dá)與EMs疼痛的嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。本研究證實(shí)NGF的表達(dá)水平與EMs患者的VAS評(píng)分呈正相關(guān)，提示NGF異常表達(dá)參與EMs疼痛的發(fā)生。NGF可以使異位病灶周圍正常組織的神經(jīng)纖維向異位病灶內(nèi)生長(zhǎng)，誘導(dǎo)P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、神經(jīng)肽等致痛物質(zhì)的生成，刺激末梢神經(jīng)纖維，產(chǎn)生疼痛。NGF是神經(jīng)元存活和維持所必需的營(yíng)養(yǎng)因子，過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)纖維的產(chǎn)生，導(dǎo)致持續(xù)性疼痛的發(fā)生。此外，NGF也是一種炎癥痛覺(jué)過(guò)敏的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[12]，其與受體結(jié)合后可誘導(dǎo)熱敏通道TRPV1敏化，增強(qiáng)神經(jīng)元放電，參與痛覺(jué)過(guò)敏的病理過(guò)程[13]。同時(shí)有研究指出，NGF刺激可以增強(qiáng)辣椒素誘發(fā)的DRG神經(jīng)元內(nèi)向電流，提示NGF對(duì)TRPV1通道具有敏化作用[14]。

TRPV1是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，廣泛分布于初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元末梢的傷害性感受器，可參與炎癥和痛覺(jué)過(guò)敏的形成[15]。同時(shí)介導(dǎo)溫度感受和疼痛感覺(jué)，被稱為感覺(jué)疊加的積分器[16]。TRPV1通道被NGF、緩激肽等炎性因子激活后，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)瀑布信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏[17]。本研究證實(shí),熱敏通道TRPV1在EMs在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜均有表達(dá)且與疼痛程度呈正相關(guān)，提示TRPV1參與EMs疼痛的發(fā)生。相關(guān)性分析顯示,NGF與TRPV1在EMs在位和異位內(nèi)膜的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示EMs患者異常表達(dá)的NGF促進(jìn)了TRPV1受體的表達(dá)，使感覺(jué)神經(jīng)末梢痛覺(jué)敏感性增加，對(duì)EMs疼痛的持續(xù)存在產(chǎn)生作用。

綜上所述，NGF在EMs疼痛患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)水平明顯升高，異位病灶一旦形成后，局部存在缺血、缺氧、炎癥等病理狀態(tài)，眾多因素聯(lián)合作用使局部組織酸化，增強(qiáng)TRPV1的活性，促進(jìn)TRPV1在EMs中異常表達(dá)，同時(shí)，這些因素可以降低TRPV1激活的溫度閾值，使其在體溫下就可以被激活[18]，TRPV1被激活后使EMs局部病灶細(xì)胞產(chǎn)生Ca2+及致炎致痛因子，這些因子可以作用于內(nèi)膜異位灶附近的傷害感受器上的TRPV1通道，影響其門控開(kāi)關(guān)，從而引起痛覺(jué)感受；NGF作為炎性因子可以敏化TRPV1通道而促進(jìn)該作用，這也許是EMs患者感到疼痛的原因之一。提示通過(guò)抑制NGF及TRPV1的表達(dá)，可緩解或阻斷EMs疼痛的發(fā)生，而EMs患者過(guò)度表達(dá)的NGF及TRPV1之間具體的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。