趙 曄，王秀穎，于 磊

隨著各種慢性腎臟疾病的進(jìn)展，最終會(huì)出現(xiàn)慢性腎衰竭(chronic renal failure， CRF)，但是目前尚無(wú)有效治療方法，腎移植雖然可以治愈CRF，但是其治療難度大、費(fèi)用高，難以廣泛應(yīng)用[1]。有研究顯示，腎組織細(xì)胞過(guò)度凋亡是引起腎功能障礙的重要機(jī)制[2]。自噬是一種細(xì)胞自我溶解的過(guò)程，其可將損傷的細(xì)胞器或大分子蛋白分解為小分子片段，并被細(xì)胞重新利用，研究顯示促進(jìn)自噬會(huì)抑制腎組織中的細(xì)胞凋亡并保護(hù)腎功能[3]。近年來(lái)，中藥在治療CRF方面有顯著的進(jìn)展，清腎顆粒具有改善腎功能、抑制炎癥反應(yīng)的作用[4]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探究清腎顆粒通過(guò)調(diào)控凋亡和自噬對(duì)CRF的作用，為臨床更好的治療CRF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和儀器 SD大鼠(清潔級(jí)，雌性，200±20 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，腺嘌呤(Sigma公司，美國(guó))，ELISA和TUNEL凋亡試劑盒(碧云天公司，中國(guó))，抗體(Abcam公司，美國(guó))，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國(guó))，化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham，美國(guó))，顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2模型制備和干預(yù)方法 30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CRF組和CRF+清腎顆粒組，每組10只。CRF組和CRF+清腎顆粒組應(yīng)用腺嘌呤構(gòu)建CRF模型，其具體方法是在普通飼料中摻有5%的腺嘌呤，自由進(jìn)食，共進(jìn)行3周。CRF+清腎顆粒組給予清腎顆粒灌胃治療，將清腎顆粒溶于生理鹽水，根據(jù)臨床用量[4]和《實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)》[5]換算大鼠的清腎顆粒用藥量，劑量為20 mg/kg，每日1次，連續(xù)3周，對(duì)照組、CRF組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.3.1ELISA檢測(cè)腎功能指標(biāo)：大鼠剪尾取血，離心(2000 r/min，20 min)后取上層血清，根據(jù)試劑盒的說(shuō)明加入抗體和顯色劑，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中尿素(BUN)、肌酐(Scr)的濃度。

1.3.2HE染色檢測(cè)腎組織損傷：大鼠通過(guò)腹腔注射過(guò)量2%戊巴比妥麻醉、斷頭處死，取出腎組織，用4%多聚甲醛固定并用梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成4 μm的組織玻片標(biāo)本。用蘇木精在室溫下染色10 min，然后用0.5%伊紅水溶液室溫下染色3 min。顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果。

1.3.3TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：將“1.3.2”中的切片根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，將其放置于TUNEL溶液中，在37℃下孵育1 h，之后依次進(jìn)行顯色、DAPI染色細(xì)胞核，然后進(jìn)行封片。凋亡率=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4Western blot檢測(cè)自噬蛋白以及核因子-κB(NF-κB)通路：用組織勻漿機(jī)將腎組織均勻研磨萃取總蛋白，蛋白濃度通過(guò)BCA試劑盒測(cè)量。每組取總量為40 μg的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(PAGE，80～120 V，90 min)。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白(BSA)中于室溫孵育1 h。將1∶500稀釋的anti-Beclin1、anti-LC3、anti-NF-κB和anti-IκBα添加到膜中，并在4℃下孵育過(guò)夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h。然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。GAPDH用作內(nèi)參，用Image J測(cè)量灰度值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1腎功能指標(biāo) CRF組BUN和Scr水平高于對(duì)照組，CRF+清腎顆粒組BUN和Scr水平顯著低于CRF組(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠血清BUN、Scr水平比較

2.2腎組織損傷情況 對(duì)照組大鼠腎組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)、排列正常，染色均勻，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。CRF組中細(xì)胞染色不均勻，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)喪失，細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡。CRF+清腎顆粒組可見(jiàn)腎小球結(jié)構(gòu)，但是結(jié)構(gòu)數(shù)量較少，且也有細(xì)胞凋亡情況出現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠腎組織損傷情況(HE×100)CRF為慢性腎衰竭

2.3腎組織中細(xì)胞凋亡水平 藍(lán)色為細(xì)胞核染色，紅色為凋亡細(xì)胞。見(jiàn)圖2。對(duì)照組、CRF組和CRF+清腎顆粒組腎組織中細(xì)胞凋亡率分別為(7.12±1.43)%、(28.35±3.89)%、(15.46±2.61)%。CRF組腎組織中細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，CRF+清腎顆粒組低于CRF組(P<0.05)。

圖2 3組大鼠腎組織中細(xì)胞凋亡情況(TUNEL×400)CRF為慢性腎衰竭

2.4自噬水平比較 CRF組自噬標(biāo)志蛋白Beclin1和LC3水平低于對(duì)照組，CRF+清腎顆粒組Beclin1和LC3水平高于CRF組(P<0.01)。見(jiàn)圖3和表2。

圖3 3組大鼠腎組織細(xì)胞Beclin1和LC3表達(dá)情況CRF為慢性腎衰竭，Beclin1和LC3為自噬標(biāo)志蛋白

表2 3組大鼠腎組織細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白Beclin1和LC3水平比較

2.5NF-κB和NF-κB抑制因子α(IκBα)蛋白水平 CRF組NF-κB和IκBα蛋白水平高于對(duì)照組，CRF+清腎顆粒組NF-κB和IκBα蛋白水平低于CRF組(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖4和表3。

表3 3組大鼠腎組織中NF-κB和IκBα蛋白水平比較

圖4 3組大鼠腎組織中NF-κB和IκBα蛋白表達(dá)情況CRF為慢性腎衰竭，NF-κB為核因子-κB，IκBα為NF-κB抑制因子α

3 討論

CRF是一種以腎功能進(jìn)行性和不可逆性惡化為特征的綜合征。CRF主要由高血壓、腎小球腎炎和糖尿病引起[6]。與其他慢性疾病患者相比，CRF患者往往需要更長(zhǎng)時(shí)間、更頻繁的住院治療。腎衰竭會(huì)嚴(yán)重影響患者的生命健康和生活質(zhì)量，是日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

在中醫(yī)中，CRF的特點(diǎn)是濕熱、瘀血，清腎顆粒的主要成分包括白花蛇舌草、丹參、茵陳等，具有清熱化濕祛瘀的功效。近年來(lái)臨床上大量的研究已經(jīng)證實(shí)了清腎顆粒在CRF中的作用，有研究顯示清腎顆?？梢愿纳蒲趸瘧?yīng)激，從而改善CRF患者的腎功能[7]。王億平等[8]研究發(fā)現(xiàn)，清腎顆?？梢砸种艭RF患者炎性細(xì)胞因子的水平，但是關(guān)于清腎顆粒治療CRF的機(jī)制尚不清楚。腎組織中的細(xì)胞不受控制的凋亡和纖維化是導(dǎo)致CRF的重要機(jī)制。自噬是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界壓力的一種適應(yīng)性反應(yīng)，研究顯示誘導(dǎo)自噬可以抑制凋亡。本研究結(jié)果顯示，CRF組BUN、Scr、腎組織細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，自噬標(biāo)志蛋白Beclin1和LC3水平低于對(duì)照組；CRF+清腎顆粒組BUN、Scr水平、腎組織細(xì)胞凋亡率低于CRF組，Beclin1和LC3水平高于CRF組。提示CRF模型大鼠腎組織細(xì)胞的凋亡水平升高而自噬水平降低，給予清腎顆粒灌胃干預(yù)后，腎組織損傷顯著緩解，腎功能指標(biāo)改善。研究顯示，清腎顆粒的主要成分白花蛇舌草、丹參、茵陳均具有誘導(dǎo)自噬和抑制凋亡的作用[9-11]。提示清腎顆粒可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制凋亡改善CRF大鼠模型的腎功能。

為進(jìn)一步分析清腎顆粒調(diào)控自噬和凋亡的機(jī)制，對(duì)腎組織中NF-κB通路的影響。研究已經(jīng)證實(shí)NF-κB通路的激活會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)凋亡和氧化應(yīng)激引起CRF大鼠腎組織中細(xì)胞的凋亡，參與CRF進(jìn)程[12]。此外，NF-κB通路也具有調(diào)控自噬的作用，從而抑制炎癥反應(yīng)緩解脂多糖誘導(dǎo)的腎損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，CRF組NF-κB和IκBα蛋白水平高于對(duì)照組，CRF+清腎顆粒組NF-κB和IκBα蛋白水平低于CRF組。有研究顯示清腎顆粒會(huì)抑制CRF患者血清中的NF-κB水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。研究顯示以白花蛇舌草為主要成分的中藥方可以抑制糖尿病腎病患者血清中NF-κB水平[15]。丹參的主要活性成分丹參酮ⅡA也可以通過(guò)抑制NF-κB緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，以茵陳為主的中藥方劑可以抑制NF-κB通路調(diào)控自噬和炎癥反應(yīng)[17]。提示清腎顆粒可以通過(guò)抑制NF-κB通路誘導(dǎo)自噬抑制凋亡。

綜上所述，清腎顆?？梢酝ㄟ^(guò)抑制NF-κB通路誘導(dǎo)腎組織細(xì)胞的自噬，從而抑制凋亡，緩解CRF大鼠模型的腎功能。關(guān)于清腎顆粒調(diào)節(jié)NF-κB通路和自噬的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。