陳曲，王嵬，何玉男，遲新楠

錦州市中心醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121000

肺癌在與惡性腫瘤相關(guān)的病死率中居首位，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最重要的病理類型，占所有肺癌的80%～85%[1]。大多數(shù)患者在被診斷出NSCLC時是局部晚期或存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來，基于驅(qū)動基因的分子檢測以及小分子酪氨酸激酶抑制劑的發(fā)展使晚期NSCLC的臨床治療不再局限于細(xì)胞毒性藥物[2]。Kristen鼠肉瘤致癌基因（KRAS proto-oncogene，KRAS）突變是最常見的肺癌驅(qū)動基因突變之一[3]。KRAS基因編碼腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵信號蛋白，并且是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、存活、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的重要培養(yǎng)基[4]。但是，迄今為止，還沒有有效的針對KRAS突變的靶向治療藥物。程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）/程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）可以作為免疫檢查點預(yù)測晚期腫瘤患者的生存預(yù)后[5]。為了探討KRAS在NSCLC組織中的表達(dá)及與PD-1、PD-L1表達(dá)的關(guān)系，本研究選取88例NSCLC組織標(biāo)本進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2019年12月錦州市中心醫(yī)院收治的NSCLC患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)確診；②術(shù)前未行放化療等治療；③臨床資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；②合并免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入88例NSCLC患者，其中男性45例，女性43例；年齡32～75歲，中位年齡51歲；病理類型：腺癌50例，鱗狀細(xì)胞癌38例。收集NSCLC患者的NSCLC組織標(biāo)本88例。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測方法

將收集的石蠟包埋組織標(biāo)本切片經(jīng)10%甲醛固定24～48 h，之后行石蠟包埋。將石蠟標(biāo)本切成厚度約為4 mm的連續(xù)組織切片4張，60℃烘烤3 h，常規(guī)脫蠟，加3% H2O210 min，在室溫下孵育，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次，每次3 min，檸檬酸溶液修復(fù)，PBS洗滌3次，每次3 min，加上一抗孵育過夜，PBS洗滌3次，每次3 min，添加聚合物增強劑，在室溫下孵育20 min，PBS洗滌3次，每次3 min，室溫下添加酶標(biāo)記的抗小鼠聚合物（二抗，在室溫下孵育30 min），用PBS洗滌3次，每次3 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，用水沖洗，用蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水封片。試劑盒均購自北京中山生物制品有限公司。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-timequantitative polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測方法

總RNA提?。簩⒀寮尤霟oRNA酶的離心管中，加入裂解液，充分混合并裂解，按照試劑盒的說明進(jìn)行操作，按照分光光度法檢測濃度和純度，RNA純度高，不降解，不污染DNA用于cDNA合成。逆轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)系統(tǒng)：RNA模板2 μl，RT引物2 μl，5×RT緩沖液 5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，40 U/μl RNase inhibitor 0.5 μl，20 U/μl RT 酶 0.5 μl，ddH2O 24 μl。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR檢測：以β-actin為內(nèi)參，以cDNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)系統(tǒng)：cDNA 2 μl，2×SYBR Green qPCR混合物10 μl，正向引物 1 μl，反向引物 1 μl，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水 6 μl，總反應(yīng)量 20 μl。每個靶基因重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95℃10min，95℃15min，60℃1 min，40個循環(huán)；72℃ 30 s。啟動qRT-PCR儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用Bio-Rad CFX Manager軟件分析KRAS基因狀態(tài)。KRAS引物：內(nèi)引物，上游引物（2-F）GGCCTGCTGAAAATGACTG，下游引物（2-R）Biotin-GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT；外引物，上游引物（1-F）GACATGTTCTAATATAGTCAC，下游引物（1-R）GTCCTGCACCAGTAATATGCA。 測 序 引 物（PS-K）：CTTGTGGTAGTTGGAGCT。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因突變情況

88例NSCLC患者中，檢測出12例患者出現(xiàn)KRAS基因突變，突變率為13.64%，均為第2外顯子的12位密碼子突變。

2.2 不同臨床特征的NSCLC患者NSCLC組織中KRAS基因突變情況的比較

腺癌患者NSCLC組織中KRAS基因突變率明顯高于鱗狀細(xì)胞癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；不同性別、年齡、TNM分期、腫瘤直徑、分化程度和是否吸煙的NSCLC患者的NSCLC組織中KRAS基因突變率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表 1）

表1 不同臨床特征的NSCLC患者NSCLC組織中KRAS基因突變情況的比較（ n=88）

2.3 KRAS基因突變與預(yù)后的關(guān)系

截至2020年5月，KRAS基因突變患者的中位總生存時間為12個月（95%CI：10.33～13.67），明顯少于KRAS基因未突變患者的23個月（95%CI：21.94～24.06），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=54.912，P＜0.01）。（圖1）

圖1 KRAS基因突變（ n=12）與KRAS基因未突變（ n=76）患者的生存曲線

2.4 KRAS基因突變與PD- 1、PD-L 1表達(dá)的關(guān)系

KRAS基因突變與未突變NSCLC組織中PD-1、PD-L1陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 NSCLC組織中KRAS基因突變與PD- 1、PD-L 1表達(dá)的關(guān)系[ n（%）]

3 討論

NSCLC包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌，與小細(xì)胞癌相比，其腫瘤細(xì)胞的生長和分裂較慢，擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移相對較晚。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是NSCLC形成和發(fā)展的重要途徑，其受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的激活抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤組織的血管生成轉(zhuǎn)移[6-8]。免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫監(jiān)視功能可以識別和控制腫瘤細(xì)胞的生長。在T細(xì)胞免疫機(jī)制中，PD-1是公認(rèn)的免疫檢查位點的負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的抑制受體[9]。人PD-1基因位于2q37.3染色體上，編碼免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要在活化的T細(xì)胞中表達(dá)[10]。PD-L1是PD-1的主要配體，在正常人體中，PD-1與PD-L1相互作用在細(xì)胞碳末端磷酸化ITSM，募集Src同源蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homologue tyrosine phosphatase 2，SHP2）磷酸分子、下游脾酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase，Syen）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）被去磷酸化，然后發(fā)出抑制信號以發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能[11-12]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)是NSCLC預(yù)后不良的一個因素，主要由于PD-L1對機(jī)體免疫功能的負(fù)調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易生長和擴(kuò)散。PD-L1在疾病的進(jìn)展中起著重要作用，因此檢測PD-L1在肺癌組織中的表達(dá)可以幫助評估患者的預(yù)后。

RAS途徑是EGFR下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要調(diào)節(jié)途徑之一，RAS途徑的激活在細(xì)胞增殖過程中起著至關(guān)重要的作用。KRAS是RAS家族的成員，其位于人類12號染色體上，編碼一種分子量為21 kD的蛋白質(zhì)，因此被稱為p21蛋白。KRAS分布在細(xì)胞膜內(nèi)，可以與三磷酸鳥苷（green fluorescein protein，GTP）和二磷酸鳥嘌呤核糖核苷（guanine diphosphate nucleoside，GDP）結(jié)合，并具有GTPase的生物學(xué)功能[13]。在正常細(xì)胞中，KRAS蛋白與GDP結(jié)合不傳輸生物信號。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，GDP從K-RAS蛋白中解離出來，然后GTP與KRAS結(jié)合起來使K-RAS恢復(fù)其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[14]。KRAS蛋白可以通過多種信號途徑將有絲分裂和生長信號從細(xì)胞質(zhì)傳遞至細(xì)胞核。KRAS的激活狀態(tài)由其固有的GTP酶活性終止，從而水解GTP[15]。KRAS基因突變后，由其編碼的蛋白質(zhì)的GTPase活性降低，并在細(xì)胞中連續(xù)傳遞信號，刺激細(xì)胞生長和增殖，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞惡變。KRAS突變存在于大約30%的人類惡性腫瘤中[16]。NSCLC中的KRAS突變也是當(dāng)前分子病理學(xué)研究的熱點，特別是在肺腺癌中，肺鱗狀細(xì)胞癌RAS突變中的KRAS突變相對較少。KRAS突變可能是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動基因。

第2外顯子的12和13號密碼子是KRAS基因突變的常見突變位點，12號密碼子的突變率（92%）顯著高于13號密碼子的突變率[17]，與本次研究結(jié)果一致。在選擇肺腺癌的靶向療法之前，有必要同時檢測EGFR和KRAS基因的突變狀態(tài)，這不僅有助于指導(dǎo)靶向藥物的篩選，而且有助于判斷靶向藥物的療效。KRAS基因突變與性別、年齡、TNM分期、腫瘤直徑、分化程度和是否吸煙無關(guān)。亞洲人群中肺癌的突變率很低，研究結(jié)果差異可能與人群之間KRAS突變率不一致和樣本量不足導(dǎo)致的抽樣誤差有關(guān)。此外，各種研究中使用的基因檢測方法也不同，不同檢測方法的敏感性和特異性也會影響結(jié)果。相信隨著實驗方法的進(jìn)一步完善和臨床數(shù)據(jù)的不斷積累，KRAS突變與NSCLC臨床特征之間的相關(guān)性有助于篩查高危人群的臨床工作，有利于進(jìn)行KRAS突變位點的靶向治療研究。KRAS基因突變患者總體生存時間為12個月，明顯少于KRAS基因未突變患者，更進(jìn)一步地證實了KRAS突變作為NSCLC預(yù)后負(fù)性預(yù)測因子的價值。有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷KRAS的下游途徑可以減少PD-L1在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)，KRAS所在的促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑在細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)中起著主導(dǎo)作用[18]，但是其分子機(jī)制尚未確定。本研究對NSCLC中二者的相關(guān)性進(jìn)行分析，KRAS基因突變和未突變NSCLC組織中PD-1、PD-L1陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，MAPK途徑可能不是PD-L1表達(dá)的調(diào)控途徑。

已有研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變與多種腫瘤密切相關(guān)[19-20]，但其與PD-1和PD-L1表達(dá)之間的相關(guān)性存在爭議。原因可能是NSCLC中KRAS突變率低，臨床數(shù)據(jù)有限。另外，免疫組織化學(xué)方法檢測PD-1和PD-L1蛋白的表達(dá)尚無統(tǒng)一的陽性標(biāo)準(zhǔn)，這也導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)結(jié)果與表達(dá)調(diào)控研究中所選擇的細(xì)胞系之間存在差異。KRAS突變與PD-1和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。本研究進(jìn)一步探討了KRAS在NSCLC組織中的表達(dá)及與PD-1、PD-L1表達(dá)的關(guān)系。

綜上所述，KRAS基因突變與NSCLC患者病理組織類型、預(yù)后有一定關(guān)系，與PD-1及其配體表達(dá)無明顯關(guān)系。