程 錕，趙學科，周福有，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，孟超龍，胡守佳，王建坡，王能超，鮑啟德，王立東#

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點開放實驗室、省部共建食管癌防治國家重點實驗室，河南 鄭州450052；2.鄭州大學基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，河南 鄭州 450052；3.安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科，河南 安陽 455000；4.安陽市腫瘤醫(yī)院腫瘤防治辦公室，河南 安陽 455000；5.安陽市腫瘤醫(yī)院放療科，河南 安陽 455000；6. 濮陽安陽地區(qū)醫(yī)院腫瘤科，河南 安陽 455000)

食管癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高，我國為食管癌高發(fā)區(qū)[1]。我國是食管鱗癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，據(jù)統(tǒng)計我國每年大約有25萬新增確診病例,占全世界食管鱗癌新增病例總數(shù)的一半以上[2]。目前，色素內(nèi)鏡和黏膜活檢是食管鱗癌早期發(fā)現(xiàn)的重要篩查方法[3]。但是，內(nèi)鏡篩查有創(chuàng)傷、成本高、效率低，這些限制了內(nèi)鏡篩查在無癥狀人群中的推廣應用。而且，食管上皮高級別內(nèi)瘤變(重度不典型增生)和早期浸潤癌患者均無特異癥狀，導致這些患者臨床上發(fā)現(xiàn)率極低[4]。換言之，一旦出現(xiàn)食管癌特異癥狀(進行性吞咽困難)多數(shù)就診時已為中晚期，失去最佳就診時間。這是食管癌死亡率居高不下的主要原因之一[5]。如何發(fā)現(xiàn)這些無特異癥狀的患者是食管癌防治研究領域亟待解決的難題。本研究報道一組無癥狀高危人群篩查和早期發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關抗原自身抗體液體活檢技術，并進一步分析在食管癌高發(fā)區(qū)進行推廣應用的初步結果，為食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群食管癌前病變和早期癌篩查提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象第1組為來自省部共建食管癌防治國家重點實驗室收集的160例血清樣本。其中正常人血清80例(對照組)來自該實驗室合作醫(yī)院體檢中心的健康體檢人群，無任何腫瘤相關的證據(jù)；早期食管癌患者血清80例(食管癌組)。80例正常人中，男43例，女37例，年齡(51.72±10.79)歲。80例早期食管癌患者血清來自經(jīng)組織病理學證實的早期(0期+Ⅰ期)食管癌患者，均未接受放療和化療，男57例，女23例，年齡(61.84±6.92)歲。利用間接酶聯(lián)免疫法檢測腫瘤相關抗原自身抗體增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、轉化生長因子β受體Ⅱ(transforming growth factor β receptor，TβRⅡ)和著色性干皮病基因組C(xeroderma pigmentosum group C，XPC)，通過檢測早期食管癌患者和正常人血清中這一組相關腫瘤抗原自身抗體的水平，明確該組腫瘤相關抗原自身抗體聯(lián)合檢測食管癌的效能。

第2組人群為在食管癌高發(fā)地區(qū)河南省安陽市文峰區(qū)魏家營村進行流行病學調(diào)查，自愿接受流行病學調(diào)查、血清學腫瘤相關抗原自身抗體檢查和色素內(nèi)鏡檢查的無癥狀人群518例，男249例，女269例，年齡(51.87±10.48)歲，所有無癥狀人群均接受血清腫瘤相關抗原自身抗體檢查和色素內(nèi)鏡檢查。

第3組人群來自食管癌高發(fā)區(qū)河南省新鄉(xiāng)市獲嘉縣進行食管癌大規(guī)模篩查，對21 428例35歲以上無癥狀人群行血清學腫瘤相關抗原自身抗體檢測，其中男10 728例，女10 700例，年齡(51.97±10.31)歲。對檢測結果為陽性者進行色素內(nèi)鏡檢查。

1.2 實驗方法

1.2.1 血樣采集與保存 每例研究對象均填寫基本信息調(diào)查表并體檢。每例研究對象均取空腹靜脈血5 mL，之后將其置于離心管內(nèi)，在室溫下靜置30 min后以2 000 r/min離心20 min，吸取血清，每管100 μL分裝，液氮保存。

1.2.2 血清腫瘤相關抗原自身抗體檢測 使用本實驗室已經(jīng)建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清腫瘤相關性原自身抗體，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5 μg/μL，血樣稀釋濃度為150，辣根過氧化物酶標記的抗人IgG稀釋濃度為15 000。在酶聯(lián)免疫吸附試驗板孔中加入用包被稀釋液稀釋過的抗原100 μL/孔，4 ℃過夜(24 h以上)。加入稀釋后的患者血清100 μL/孔，每例樣品至少做2次檢查，37 ℃孵育。已知陽性的血清作為陽性對照，包被緩沖液作為陰性對照。加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育。加入四甲基聯(lián)苯胺-過氧化氫尿素顯色液，100 μL/孔，置37 ℃避光反應，當陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50 μL終止反應，并在酶聯(lián)免疫吸附試驗讀數(shù)儀上讀取450 nm處光密度值。

1.2.3 血清檢測結果判定 采用Scripps研究所判定方法設置截斷值，讀數(shù)在此值以上的為陽性，否則為陰性。有1種自身抗體陽性時，該受試者定義為高危受試者。

1.2.4 色素內(nèi)鏡檢查 常規(guī)內(nèi)鏡檢查，行食管黏膜碘染色和賁門黏膜美藍染色，在食管不染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置于體積分數(shù)85%乙醇內(nèi)固定。

1.2.5 病理組織學檢查 對色素內(nèi)鏡獲取的活檢組織常規(guī)處理后進行切片，每張切片厚5 μm，然后進行HE染色，得出組織病理學診斷結果。

2 結果

2.1 食管癌組和對照組3種腫瘤相關抗原自身抗體表達比較及診斷效能PCNA、TβRⅡ、XPC等3種腫瘤相關抗原自身抗體在食管癌組的陽性率明顯高于在對照組(χ2=23.184，P<0.001；χ2=16.704，P<0.001；χ2=19.877，P<0.001)。3種腫瘤相關抗原自身抗體聯(lián)合檢測診斷早期食管癌患者敏感性和特異性均為81.25%。見表1、2。

表1 食管癌組和對照組3種腫瘤相關抗原自身抗體表達比較 n(%)

表2 3種腫瘤相關抗原自身抗體不同組合聯(lián)合檢測對食管癌的診斷效能 n(%)

2.2 食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群血清腫瘤相關抗原自身抗體液體活檢技術和色素內(nèi)鏡檢查結果比較食管癌高發(fā)區(qū)518例無癥狀人群均接受3種血清腫瘤相關抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術和色素內(nèi)鏡檢查，并進行研究對象基線資料和兩者檢查方法診斷效能進行比較分析。結果見表3、4。

表3 食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群年齡、性別分布情況 n(%)

表4 食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群血清腫瘤相關抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術和色素內(nèi)鏡檢查結果比較 n(%)

2.3 食管癌高發(fā)區(qū)液體活檢技術篩查檢出食管癌的效能采用3種腫瘤相關抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術對食管癌高發(fā)區(qū)21 428例無癥狀人群進行食管癌篩查，共確定高危(陽性)人群4 286例，進一步行色素內(nèi)鏡檢查，結果顯示正常人群2 690例(62.86%)、不典型增生1 498例(34.95%)、早期食管癌545例(12.72%)、中晚期食管癌34例(0.79%)、其他消化道腫瘤64例(1.49%)，其中早期食管癌占整個無癥狀人群的2.54%。

3 討論

在我國食管鱗癌不僅發(fā)病率高，還存在顯著的地域差異，比如我國北部，尤其是河南林州及其毗鄰的輝縣、安陽、磁縣等是世界上食管鱗癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一[6]。傳統(tǒng)意義上，高發(fā)區(qū)、40歲以上、男性、吸煙、飲酒、家族史陽性的無癥狀人群被籠統(tǒng)界定為食管鱗癌高?；蚋唢L險人群，也是食管鱗癌早期篩查的主要對象[7-8]。目前，色素內(nèi)鏡和黏膜活檢是食管鱗癌早期發(fā)現(xiàn)的重要篩查方法。但是，內(nèi)鏡篩查有創(chuàng)傷、成本高且效率低，這限制了內(nèi)鏡篩查在無癥狀人群中的推廣應用。因而，尋找有效的食管鱗癌特異性分子診斷標志物用于篩選食管鱗癌高風險人群，對食管鱗癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療，進而改善食管鱗癌患者的生存和預后具有重要意義。

本研究創(chuàng)新性使用PCNA、TβRⅡ和XPC等3種血清腫瘤相關抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢對無癥狀人群進行篩查，并結合色素內(nèi)鏡確診，結果檢出早期癌比例達到了2.54%。傳統(tǒng)的內(nèi)鏡篩查手段對早期癌的檢出比例為2%左右[9]，這表明本研究中的液體活檢技術具有很高的準確性。但使用液體活檢技術約減少了80%的陪伴檢查，大大節(jié)約了成本，液體活檢技術聯(lián)合內(nèi)鏡檢查相較于傳統(tǒng)的內(nèi)鏡篩查優(yōu)勢明顯。

敬元華等[10]和馮祥等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，食管癌的檢出率分別為0.31%和0.52%，這與本研究中的食管癌檢出率相差較大。造成這種結果的原因很大可能是我國食管鱗癌發(fā)病率存在顯著的地域差異性。四川省南部縣和江蘇省揚中市的食管癌發(fā)病率遠低于河南林州及其毗鄰的輝縣、安陽、磁縣等，發(fā)病率低必然導致檢出率低[1]。

另外，本研究也存在一定的局限性，雖然PCNA、TβRⅡ和XPC等3種血清腫瘤相關抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術的敏感性和特異性都比較高，但是假陽性、假陰性仍然不可避免。這需要找到更多與食管癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的分子指標[12]，同時優(yōu)化用于液體活檢的食管癌相關分子指標的組合，以實現(xiàn)食管癌的高危人群預警和早期發(fā)現(xiàn)。