徐瑞華，宋 昕，李恩民，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，趙學(xué)科，孟超龍，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，王 偉，李欣然，楊苗苗，楊媛嘖，許麗艷，王立東

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室、省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052；2. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院廣東沿海潮汕地區(qū)癌癥高發(fā)區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041)

食管癌是上消化道常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)50萬例食管癌患者中一半以上發(fā)生在中國[1-2]，患者的死亡率排在消化系統(tǒng)腫瘤的第2位[3]。食管癌早期無特異性癥狀，確診時大多已達(dá)中晚期，5 a生存率僅約20%[4]，嚴(yán)重威脅著人們的健康。因此，食管癌的早期發(fā)現(xiàn)成了提高患者生存率、降低發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。食管癌早期發(fā)現(xiàn)主要是指發(fā)現(xiàn)無癥狀癌前病變患者和早期浸潤癌患者，并進(jìn)行針對性個體化干預(yù)和治療。食管癌色素內(nèi)鏡和靶向黏膜活檢組織病理學(xué)檢查是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵技術(shù)，但是其篩查成本高，并需要由經(jīng)驗(yàn)豐富的內(nèi)鏡醫(yī)師操作。因此，這一方法很難在高發(fā)區(qū)無癥狀人群中進(jìn)行大規(guī)模篩查及推廣應(yīng)用。目前，已發(fā)現(xiàn)的很多食管癌癌變相關(guān)分子改變可以不同程度反映在外周血[5]，利用液體活檢技術(shù)首先確定高危人群，再進(jìn)一步行色素內(nèi)鏡病理活檢，將極大減少內(nèi)鏡篩查人數(shù)，提高針對性篩查效果，節(jié)約篩查成本。細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是食管癌相關(guān)抗原[6-7]，本研究正是基于這一思路研發(fā)食管癌早期發(fā)現(xiàn)液體活檢技術(shù)并在高發(fā)區(qū)推廣應(yīng)用，為食管癌早期發(fā)現(xiàn)和液體活檢技術(shù)優(yōu)化組合提供證據(jù)，分析這些分子指標(biāo)聯(lián)合檢測對食管癌早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預(yù)警的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品的收集480例早期食管癌患者和480例健康志愿者的血清樣本來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1995年1月至2018年1月建立的樣本庫。480例經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的早期食管癌患者中，男228例、女252例，年齡48～81(58.5±6.4)歲，均未接受放、化療治療。早期食管癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為早期(0期+Ⅰ期)；術(shù)前均未進(jìn)行放、化療等其他治療；血樣在術(shù)前收集；未合并其他腫瘤、自身免疫性疾病和炎癥性疾病等影響血清蛋白的疾病。480例健康志愿者中，男228例、女252例，年齡35～82(58.7±9.2)歲。

1.2 方法

1.2.1 血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體的檢測 對以上血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，采用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測腫瘤相關(guān)抗原自身抗體CYFRA21-1、PCNA、TGF-β1[8-9]，包被的3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體最終稀釋濃度為0.5 μg/μL，血樣稀釋濃度為150，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG稀釋濃度為15 000。在ELISA板孔中加入包被稀釋液稀釋過的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體100 μL/孔，4 ℃靜置過夜(>24 h)，再加入稀釋后的食管癌患者和健康志愿者血清100 μL/孔，每個樣品至少進(jìn)行2次檢查，37 ℃孵育。包被已知陽性的血清為陽性對照，包被緩沖液為陰性對照。加入稀釋的辣過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育。加入四甲基聯(lián)苯胺-過氧化氫尿素顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光反應(yīng)，當(dāng)陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)，并讀取OD450值。血清自身抗體檢測結(jié)果判定采用Scripps研究所判定方法確定截?cái)嘀?，此值以上的為陽性，反之為陰性[5,10]。

1.2.2 高發(fā)區(qū)無癥狀人群小規(guī)模驗(yàn)證 我們在河南省食管癌高發(fā)區(qū)林州市用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測試劑盒進(jìn)行食管癌早期篩查，為532例無癥狀人群進(jìn)行雙盲血清學(xué)檢測和色素內(nèi)鏡檢查，其中男273例、女259例，年齡35～70(53.3±11.7)歲。

1.2.3 高發(fā)區(qū)無癥狀人群大規(guī)模推廣應(yīng)用 我們在廣東省和福建省的食管癌高發(fā)區(qū)醫(yī)院采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測試劑盒對當(dāng)?shù)氐臒o癥狀人群進(jìn)行早期食管癌篩查，2013年1月至2019年12月，共有10 890例無癥狀人群參與其中，其中男5 389例、女5 501例，年齡35～70(52.5±10.3)歲，對檢測結(jié)果為陽性的高危人群進(jìn)一步行色素內(nèi)鏡檢查。

1.3 TNM分期及臨床分期標(biāo)準(zhǔn)TNM分期采用國際食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)第6版，食管癌臨床分期基于TNM分期，分為早期(0期和Ⅰ期)、中期(Ⅱ期和Ⅲ期)和晚期(Ⅳ期)。

2 結(jié)果

2.1 早期食管癌患者和健康志愿者血清3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體陽性率比較CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1在早期食管癌中的陽性率分別為27.71%、31.67%、35.83%，均高于健康志愿者(2.92%、2.92%、5.00%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=113.752，P<0.001；χ2=138.708，P<0.001；χ2=140.425，P<0.001)。見表1。

表1 早期食管癌患者和健康志愿者血清3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體陽性率比較 n(%)

2.2 不同腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測的臨床診斷價(jià)值CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測的敏感性67.08%，特異性76.04%，約登指數(shù)0.43，最適用于食管癌的早期篩查。見表2、3。

表2 不同腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測在早期食管癌患者和健康志愿者中的陽性率 n(%)

表3 不同腫瘤相關(guān)抗原聯(lián)合自身抗體檢測用于食管癌診斷的敏感性、特異性、約登指數(shù)比較

2.3 高發(fā)區(qū)無癥狀人群小規(guī)模驗(yàn)證結(jié)果我們在河南省食管癌高發(fā)區(qū)林州市采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測試劑盒對532例高發(fā)區(qū)無癥狀人群篩查，發(fā)現(xiàn)陽性103例(19.36%)，色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果示48例不典型增生患者、19例早期食管癌患者、9例中晚期食管癌患者、27例正常食管黏膜者；陰性429例(80.64%)，色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果示11例不典型增生患者、2例早期食管癌患者、0例中晚期食管癌患者、416例正常食管黏膜者。高發(fā)區(qū)無癥狀人群小規(guī)模驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測液體活檢技術(shù)的診斷效果與色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果相似。見表4。

表4 高發(fā)區(qū)無癥狀人群CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測和色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果比較 n(%)

2.4 高發(fā)區(qū)無癥狀人群大規(guī)模推廣應(yīng)用結(jié)果我們在廣東省和福建省的三家醫(yī)院采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測液體活檢技術(shù)試劑盒對當(dāng)?shù)氐臒o癥狀人群進(jìn)行早期食管癌篩查，結(jié)果顯示，參與的10 890例無癥狀人群中，發(fā)現(xiàn)高危人群(陽性)1 759例(16.51%)，對陽性人群進(jìn)一步進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)812例(12.22%)不典型增生患者、215例(46.16%)早期食管癌患者、23例(1.31%)中晚期食管癌患者、709例(40.31%)正常食管黏膜者。

3 討論

食管癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，5 a生存率僅15%左右，早診、早防和早治是降低食管癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵[11]。隨著醫(yī)學(xué)相關(guān)研究的進(jìn)步，王立東等[5]發(fā)現(xiàn)食管癌變是一個多階段演進(jìn)的過程，是遺傳-環(huán)境-基因交互作用的復(fù)雜結(jié)果，建立高危人群分子分型和液體活檢技術(shù)是實(shí)現(xiàn)食管癌早期發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前，食管癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)依然是胃鏡黏膜病理活檢，胃鏡活檢操作復(fù)雜、有創(chuàng)、成本高、接受程度低，不適合在食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群大規(guī)模推廣應(yīng)用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1這3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在早期食管癌患者血清中表達(dá)遠(yuǎn)高于健康志愿者。對上述3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體進(jìn)行聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn)，早期食管癌的陽性率遠(yuǎn)高于單一指標(biāo)檢測，3種指標(biāo)聯(lián)合檢測敏感性67.08%、特異性76.04%、約登指數(shù)0.43。結(jié)果提示，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測液體活檢技術(shù)可以用于食管癌的早期篩查。

我們用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測試劑盒在河南省食管癌高發(fā)區(qū)林州市進(jìn)行小規(guī)模無癥狀人群早期食管癌篩查，為532例無癥狀人群進(jìn)行雙盲聯(lián)合血清學(xué)檢測和色素內(nèi)鏡檢查，比較該聯(lián)合液體活檢技術(shù)與色素內(nèi)鏡檢查的結(jié)果。液體活檢技術(shù)發(fā)現(xiàn)高危人群(液體活檢陽性)103例，色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果示不典型增生、早期食管癌、中晚期食管癌各占48例、19例、9例；液體活檢陰性429例中，色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果示不典型增生、早期食管癌、中晚期食管癌分別為11例、2例、0例。結(jié)果提示，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測液體活檢技術(shù)的效果與色素內(nèi)鏡檢查相似，適合在食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群進(jìn)行推廣應(yīng)用。

2013年1月至2019年12月，我們在廣東省和福建省食管癌高發(fā)區(qū)的三家醫(yī)院，采用CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測液體活檢技術(shù)試劑盒對當(dāng)?shù)氐臒o癥狀人群進(jìn)行食管癌早期篩查，共有10 890例無癥狀人群參與其中，共發(fā)現(xiàn)高危人群(液體活檢陽性)1 759例(16.51%)，對檢測陽性的人群進(jìn)一步行色素內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)，其中不典型增生812例、早期食管癌215例、中晚期食管癌23例、正常食管黏膜709例，早期發(fā)現(xiàn)率較高。10 890例人群通過液體活檢技術(shù)篩查后僅16.51%需要進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，也就是說83.49%的人群無需再行色素內(nèi)鏡檢查，這樣以來不僅大大降低了檢查成本，同時也提高了食管癌早期篩查的依從性和時效性。

綜上所述，CYFRA21-1、PCNA和TGF-β1聯(lián)合檢測液體活檢技術(shù)是食管癌早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預(yù)警的有效方法，通過這一方法先鎖定高危人群，再進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，大大減少了內(nèi)鏡篩查的數(shù)量，降低了檢查成本，具有明顯的推廣應(yīng)用價(jià)值。