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        高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定藥物中的氯乙酰氯

        2021-01-25 07:47:56湯加園陳向明
        化學(xué)分析計(jì)量 2021年1期
        關(guān)鍵詞:吖啶原料藥乙腈

        湯加園,陳向明

        (濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東煙臺(tái) 264003)

        藥物中的遺傳毒性雜質(zhì)是一類能損傷細(xì)胞遺傳物質(zhì)并引起基因突變或體內(nèi)誘變的物質(zhì),較少的攝入量就能夠?qū)ι眢w健康產(chǎn)生嚴(yán)重的損害[1-2]。近年來(lái),在市場(chǎng)銷售的某些藥物中發(fā)現(xiàn)了遺傳毒性雜質(zhì)殘留,對(duì)患者的健康造成威脅,并使相關(guān)醫(yī)藥企業(yè)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失,因此需要對(duì)其在藥物中的殘留量進(jìn)行嚴(yán)格控制[3-4]。歐洲EMA、美國(guó)FDA 和ICH相繼發(fā)布了遺傳毒性雜質(zhì)限量的指南,建議用毒理學(xué)關(guān)注閾值(Threshold of toxicological concern,TTC)作為遺傳毒性雜質(zhì)的可接受限度,即日攝入量不超過(guò)1.5 μg 是可接受的(其致癌風(fēng)險(xiǎn)小于十萬(wàn)分之一)[5]。中國(guó)藥典2020 年版中,新增了《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》[6],確定了遺傳毒性雜質(zhì)危害評(píng)估方法、可接受攝入量計(jì)算方法和限度制定方法,為藥物中遺傳毒性雜質(zhì)的控制提供了技術(shù)指導(dǎo)。

        脂肪酰氯類化合物是許多藥物合成的重要原料,其分子中的酰氯官能團(tuán)是遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu),具有潛在的遺傳毒性,需要嚴(yán)格控制其在藥物中的殘留量[7]。脂肪酰氯的測(cè)定方法包括氣相色譜法[8-9]和高效液相色譜法[10-11]。由于脂肪酰氯的高反應(yīng)活性,無(wú)論采用哪種色譜方法,都需要在進(jìn)樣前進(jìn)行衍生化處理。常用的衍生試劑包括水[12-13]、甲醇[13]、哌啶[14]等。但是這些方法存在靈敏度低、準(zhǔn)確度差等缺點(diǎn),從而限制了方法的應(yīng)用。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法也是測(cè)定樣品中痕量成分的常用分析技術(shù)[15],其靈敏度和選擇性顯著優(yōu)于高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[16]。

        筆者以吖啶酮乙酰肼(AHAD)為柱前熒光衍生試劑,建立了測(cè)定藥物中氯乙酰氯含量的方法。通過(guò)衍生化降低了氯乙酰氯的活性,提高了檢測(cè)靈敏度。所建立的方法成功應(yīng)用于氟伐他汀鈉原料藥中氯乙酰氯的含量測(cè)定。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 主要儀器與試劑

        高效液相色譜儀:Agilent1260 型,配G1311B型四元梯度泵,G1329B 型自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A 型恒柱溫箱,G1321B 型熒光檢測(cè)器,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

        氯乙酰氯對(duì)照品:純度為98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

        氟伐他汀鈉原料藥:純度為98%,嘉興思誠(chéng)化工有限公司。

        吖啶酮乙酰肼:本實(shí)驗(yàn)室自制。

        乙腈:色譜純,天津市福晨化學(xué)試劑廠。

        實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

        實(shí)驗(yàn)用其余試劑均為分析純。

        1.2 溶液的配制

        氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確量取205 μL 氯乙酰氯對(duì)照品,置于25 mL 容量瓶中,用無(wú)水乙腈溶解并稀釋到標(biāo)線,搖勻,作為氯乙酰氯的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,濃度為0.1 mol/L。低濃度氯乙酰氯工作溶液用無(wú)水乙腈稀釋而得。

        衍生試劑溶液:精密稱取1.34 mg 吖啶酮乙酰肼,用無(wú)水乙腈溶解后,定容至100 mL,濃度為5×10-5mol/L。

        所有溶液均密封保存于4℃冰箱中。

        1.3 衍生過(guò)程

        分別將100 μL 氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液和120 μL 吖啶酮乙酰肼溶液,依次加入到1.5 mL離心管中,在室溫下衍生15 min。衍生反應(yīng)概況如圖1。反應(yīng)結(jié)束后,向離心管中加入780 μL 50%乙腈溶液稀釋后進(jìn)樣。

        圖1 衍生反應(yīng)概況

        1.4 色譜條件

        色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:A 為水,B 為乙腈;梯度洗脫程序:0~20 min 時(shí),B 由20%升至40%,流量為1.0 mL/min;熒光激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為255 nm 和429 nm;進(jìn)樣體積:10 μL。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 色譜條件的優(yōu)化

        為實(shí)現(xiàn)良好的色譜分離和較短的分析時(shí)間,對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。本研究比較了Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) 和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,結(jié)果表明,衍生產(chǎn)物在XDB-C18色譜柱峰形更好,與衍生試劑和副產(chǎn)物的峰均能基線分離,以乙腈和水為流動(dòng)相,采用梯度洗脫,分析時(shí)間能控制在15 min 內(nèi)。因此選擇Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行分離。

        2.2 衍生條件的優(yōu)化

        氯乙酰氯本身無(wú)熒光,且酰氯基團(tuán)具有高反應(yīng)活性。通過(guò)衍生化引入熒光基團(tuán)以提高檢測(cè)靈敏度,同時(shí)能抑制氯乙酰氯的高活性。酰氯類化合物能與氨基快速的發(fā)生反應(yīng),因此本研究選擇實(shí)驗(yàn)室自制的吖啶酮乙酰肼為柱前衍生試劑。

        氯乙酰氯與吖啶酮乙酰肼的衍生反應(yīng)無(wú)需催化劑即能發(fā)生。為達(dá)到最高的衍生效率,實(shí)驗(yàn)研究了溫度、時(shí)間和衍生試劑的用量對(duì)衍生反應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2~圖4。由圖2 可知,衍生反應(yīng)在室溫下能快速發(fā)生,提高反應(yīng)溫度,衍生產(chǎn)物的色譜峰面積略有下降,可能是因?yàn)檩^高的溫度導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生,因此實(shí)驗(yàn)選擇室溫下進(jìn)行衍生化。由圖3 可知,在15 min 時(shí)色譜峰面積達(dá)到最大,延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,色譜峰面積沒(méi)有明顯變化,因此選擇15 min 的衍生時(shí)間。為保證衍生反應(yīng)進(jìn)行的完全,衍生試劑需要過(guò)量,由圖4 可知,當(dāng)衍生試劑的濃度是氯乙酰氯濃度的5 倍時(shí),即衍生試劑體積為100 μL 時(shí),色譜峰面積達(dá)到最大,繼續(xù)增加衍生試劑的用量,衍生產(chǎn)物的色譜峰面積沒(méi)有明顯變化,因此衍生反應(yīng)時(shí),衍生試劑的用量至少是氯乙酰氯濃度的5 倍。

        圖2 溫度對(duì)衍生反應(yīng)的影響

        圖3 衍生時(shí)間對(duì)衍生反應(yīng)的影響

        圖4 衍生試劑體積對(duì)衍生反應(yīng)的影響

        2.3 線性關(guān)系和檢出限

        取氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用無(wú)水乙腈稀釋得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照前述方法衍生后進(jìn)樣分析,記錄色譜圖(見(jiàn)圖5)和色譜峰面積。

        圖5 氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生色譜圖

        以峰面積作為縱坐標(biāo)(Y),濃度作為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸,氯乙酰氯的濃度在1~1 000 nmol/L范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性,線性方程為Y=0.992 1X-0.770 6,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。以信噪比S/N=3 求得方法檢出限為0.35 nmol/L。

        2.4 精密度試驗(yàn)

        將濃度為1×10-5mol/L 氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)液,按照前述方法衍生后重復(fù)進(jìn)樣6 次測(cè)定,分別記錄峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,如表1 所示,峰面積測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%,說(shuō)明儀器性能良好。取6 份濃度為1×10-5mol/L 氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)液,按照前述方法分別衍生進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1,峰面積測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%,說(shuō)明該方法精密度良好。

        表1 儀器精密度和方法精密度試驗(yàn)

        2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        將標(biāo)準(zhǔn)氯乙酰氯衍生溶液于室溫下保存,分別在0、2、4、8、12、24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積,進(jìn)行穩(wěn)定試驗(yàn),結(jié)果如表2 所示,計(jì)算得RSD 為3.48%,說(shuō)明衍生產(chǎn)物在室溫保存下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

        表2 氯乙酰氯衍生物的穩(wěn)定性試驗(yàn)

        2.6 樣品的測(cè)定

        精密稱取20 mg 氟伐他汀鈉原料藥于1.5 mL離心管中,加入1 mL 無(wú)水乙腈,超聲處理10 min后離心。取上清液100 μL,按照前述方法衍生進(jìn)樣,未發(fā)現(xiàn)所測(cè)氟伐他汀鈉原料藥中殘留氯乙酰氯。

        2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

        精密稱取20 mg 氟伐他汀鈉原料藥于1.5 mL離心管中,加入高、中、低三種濃度氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液,每種濃度制備三份樣品。按照前述樣品處理方法提取衍生后進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

        由表3 可知,樣品加標(biāo)回收率為92.5%~95.6%,說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。樣品加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖6。

        圖6 氟伐他汀鈉原料藥加氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生色譜圖

        3 結(jié)語(yǔ)

        采用吖啶酮乙酰肼為衍生試劑對(duì)氯乙酰氯進(jìn)行柱前衍生化,建立了測(cè)定氟伐他汀鈉原料藥中氯乙酰氯的高效液相色譜方法。研究探索了溫度、時(shí)間和衍生試劑的用量對(duì)衍生反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)衍生試劑過(guò)量5 倍時(shí)在室溫下反應(yīng)15 min,衍生產(chǎn)率最大。該方法具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快的優(yōu)點(diǎn),能準(zhǔn)確測(cè)定氟伐他汀鈉原料藥中氯乙酰氯的含量,可用于氟伐他汀鈉原料藥的質(zhì)量控制。

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