湯加園，陳向明

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003)

藥物中的遺傳毒性雜質(zhì)是一類能損傷細(xì)胞遺傳物質(zhì)并引起基因突變或體內(nèi)誘變的物質(zhì)，較少的攝入量就能夠?qū)ι眢w健康產(chǎn)生嚴(yán)重的損害［1-2］。近年來(lái)，在市場(chǎng)銷售的某些藥物中發(fā)現(xiàn)了遺傳毒性雜質(zhì)殘留，對(duì)患者的健康造成威脅，并使相關(guān)醫(yī)藥企業(yè)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此需要對(duì)其在藥物中的殘留量進(jìn)行嚴(yán)格控制［3-4］。歐洲EMA、美國(guó)FDA 和ICH相繼發(fā)布了遺傳毒性雜質(zhì)限量的指南，建議用毒理學(xué)關(guān)注閾值（Threshold of toxicological concern，TTC）作為遺傳毒性雜質(zhì)的可接受限度，即日攝入量不超過(guò)1.5 μg 是可接受的（其致癌風(fēng)險(xiǎn)小于十萬(wàn)分之一）［5］。中國(guó)藥典2020 年版中，新增了《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》［6］，確定了遺傳毒性雜質(zhì)危害評(píng)估方法、可接受攝入量計(jì)算方法和限度制定方法，為藥物中遺傳毒性雜質(zhì)的控制提供了技術(shù)指導(dǎo)。

脂肪酰氯類化合物是許多藥物合成的重要原料，其分子中的酰氯官能團(tuán)是遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)，具有潛在的遺傳毒性，需要嚴(yán)格控制其在藥物中的殘留量［7］。脂肪酰氯的測(cè)定方法包括氣相色譜法［8-9］和高效液相色譜法［10-11］。由于脂肪酰氯的高反應(yīng)活性，無(wú)論采用哪種色譜方法，都需要在進(jìn)樣前進(jìn)行衍生化處理。常用的衍生試劑包括水［12-13］、甲醇［13］、哌啶［14］等。但是這些方法存在靈敏度低、準(zhǔn)確度差等缺點(diǎn)，從而限制了方法的應(yīng)用。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法也是測(cè)定樣品中痕量成分的常用分析技術(shù)［15］，其靈敏度和選擇性顯著優(yōu)于高效液相色譜-紫外檢測(cè)法［16］。

筆者以吖啶酮乙酰肼(AHAD)為柱前熒光衍生試劑，建立了測(cè)定藥物中氯乙酰氯含量的方法。通過(guò)衍生化降低了氯乙酰氯的活性，提高了檢測(cè)靈敏度。所建立的方法成功應(yīng)用于氟伐他汀鈉原料藥中氯乙酰氯的含量測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1260 型，配G1311B型四元梯度泵，G1329B 型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A 型恒柱溫箱，G1321B 型熒光檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

氯乙酰氯對(duì)照品：純度為98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

氟伐他汀鈉原料藥：純度為98%，嘉興思誠(chéng)化工有限公司。

吖啶酮乙酰肼：本實(shí)驗(yàn)室自制。

乙腈：色譜純，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

實(shí)驗(yàn)用其余試劑均為分析純。

1.2 溶液的配制

氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確量取205 μL 氯乙酰氯對(duì)照品，置于25 mL 容量瓶中，用無(wú)水乙腈溶解并稀釋到標(biāo)線，搖勻，作為氯乙酰氯的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為0.1 mol／L。低濃度氯乙酰氯工作溶液用無(wú)水乙腈稀釋而得。

衍生試劑溶液：精密稱取1.34 mg 吖啶酮乙酰肼，用無(wú)水乙腈溶解后，定容至100 mL，濃度為5×10-5mol／L。

所有溶液均密封保存于4℃冰箱中。

1.3 衍生過(guò)程

分別將100 μL 氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液和120 μL 吖啶酮乙酰肼溶液，依次加入到1.5 mL離心管中，在室溫下衍生15 min。衍生反應(yīng)概況如圖1。反應(yīng)結(jié)束后，向離心管中加入780 μL 50%乙腈溶液稀釋后進(jìn)樣。

圖1 衍生反應(yīng)概況

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A 為水，B 為乙腈；梯度洗脫程序：0～20 min 時(shí)，B 由20%升至40%，流量為1.0 mL／min；熒光激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為255 nm 和429 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為實(shí)現(xiàn)良好的色譜分離和較短的分析時(shí)間，對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。本研究比較了Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm) 和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，結(jié)果表明，衍生產(chǎn)物在XDB-C18色譜柱峰形更好，與衍生試劑和副產(chǎn)物的峰均能基線分離，以乙腈和水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，分析時(shí)間能控制在15 min 內(nèi)。因此選擇Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行分離。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

氯乙酰氯本身無(wú)熒光，且酰氯基團(tuán)具有高反應(yīng)活性。通過(guò)衍生化引入熒光基團(tuán)以提高檢測(cè)靈敏度，同時(shí)能抑制氯乙酰氯的高活性。酰氯類化合物能與氨基快速的發(fā)生反應(yīng)，因此本研究選擇實(shí)驗(yàn)室自制的吖啶酮乙酰肼為柱前衍生試劑。

氯乙酰氯與吖啶酮乙酰肼的衍生反應(yīng)無(wú)需催化劑即能發(fā)生。為達(dá)到最高的衍生效率，實(shí)驗(yàn)研究了溫度、時(shí)間和衍生試劑的用量對(duì)衍生反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2～圖4。由圖2 可知，衍生反應(yīng)在室溫下能快速發(fā)生，提高反應(yīng)溫度，衍生產(chǎn)物的色譜峰面積略有下降，可能是因?yàn)檩^高的溫度導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，因此實(shí)驗(yàn)選擇室溫下進(jìn)行衍生化。由圖3 可知，在15 min 時(shí)色譜峰面積達(dá)到最大，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，色譜峰面積沒(méi)有明顯變化，因此選擇15 min 的衍生時(shí)間。為保證衍生反應(yīng)進(jìn)行的完全，衍生試劑需要過(guò)量，由圖4 可知，當(dāng)衍生試劑的濃度是氯乙酰氯濃度的5 倍時(shí)，即衍生試劑體積為100 μL 時(shí)，色譜峰面積達(dá)到最大，繼續(xù)增加衍生試劑的用量，衍生產(chǎn)物的色譜峰面積沒(méi)有明顯變化，因此衍生反應(yīng)時(shí)，衍生試劑的用量至少是氯乙酰氯濃度的5 倍。

圖2 溫度對(duì)衍生反應(yīng)的影響

圖3 衍生時(shí)間對(duì)衍生反應(yīng)的影響

圖4 衍生試劑體積對(duì)衍生反應(yīng)的影響

2.3 線性關(guān)系和檢出限

取氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用無(wú)水乙腈稀釋得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述方法衍生后進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（見(jiàn)圖5）和色譜峰面積。

圖5 氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生色譜圖

以峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)，濃度作為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，氯乙酰氯的濃度在1～1 000 nmol／L范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性，線性方程為Y=0.992 1X-0.770 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。以信噪比S／N=3 求得方法檢出限為0.35 nmol／L。

2.4 精密度試驗(yàn)

將濃度為1×10-5mol／L 氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)液，按照前述方法衍生后重復(fù)進(jìn)樣6 次測(cè)定，分別記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，如表1 所示，峰面積測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%，說(shuō)明儀器性能良好。取6 份濃度為1×10-5mol／L 氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)液，按照前述方法分別衍生進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，峰面積測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%，說(shuō)明該方法精密度良好。

表1 儀器精密度和方法精密度試驗(yàn)

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)氯乙酰氯衍生溶液于室溫下保存，分別在0、2、4、8、12、24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，進(jìn)行穩(wěn)定試驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示，計(jì)算得RSD 為3.48%，說(shuō)明衍生產(chǎn)物在室溫保存下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表2 氯乙酰氯衍生物的穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6 樣品的測(cè)定

精密稱取20 mg 氟伐他汀鈉原料藥于1.5 mL離心管中，加入1 mL 無(wú)水乙腈，超聲處理10 min后離心。取上清液100 μL，按照前述方法衍生進(jìn)樣，未發(fā)現(xiàn)所測(cè)氟伐他汀鈉原料藥中殘留氯乙酰氯。

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取20 mg 氟伐他汀鈉原料藥于1.5 mL離心管中，加入高、中、低三種濃度氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種濃度制備三份樣品。按照前述樣品處理方法提取衍生后進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，樣品加標(biāo)回收率為92.5%～95.6%，說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。樣品加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 氟伐他汀鈉原料藥加氯乙酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生色譜圖

3 結(jié)語(yǔ)

采用吖啶酮乙酰肼為衍生試劑對(duì)氯乙酰氯進(jìn)行柱前衍生化，建立了測(cè)定氟伐他汀鈉原料藥中氯乙酰氯的高效液相色譜方法。研究探索了溫度、時(shí)間和衍生試劑的用量對(duì)衍生反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)衍生試劑過(guò)量5 倍時(shí)在室溫下反應(yīng)15 min，衍生產(chǎn)率最大。該方法具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確測(cè)定氟伐他汀鈉原料藥中氯乙酰氯的含量，可用于氟伐他汀鈉原料藥的質(zhì)量控制。