楊夢(mèng)瑞，簡(jiǎn)凌波，李鵬，王敏，周劍，王彤彤，張麗媛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

加替沙星是第四代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，具有強(qiáng)大的抗菌效能，是近年來(lái)增長(zhǎng)迅速的氟喹諾酮類藥物代表之一，廣泛應(yīng)用于人類和各種動(dòng)物疾病的控制、治療及預(yù)防［1-3］。然而，由于養(yǎng)殖過(guò)程不規(guī)范使用或?yàn)E用，容易造成該藥物在畜禽、水產(chǎn)等動(dòng)物產(chǎn)品中殘留。雖然我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部235 號(hào)、2292號(hào)等公告中明確規(guī)定了恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星等氟喹諾酮類藥物的禁限用要求，但是加替沙星等新型的氟喹諾酮類藥物逃避監(jiān)管的風(fēng)險(xiǎn)仍然日益增大。目前，雖然已建立了動(dòng)物源產(chǎn)品中加替沙星殘留分析檢測(cè)方法，但是相關(guān)的國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還未見(jiàn)報(bào)道。因此研制加替沙星純度有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的量值溯源與準(zhǔn)確可靠非常有必要。

純度有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要有兩個(gè)重要作用，一是配制溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于儀器校準(zhǔn)；二是為復(fù)雜樣品測(cè)量結(jié)果賦值，建立計(jì)量溯源性，保證測(cè)量結(jié)果可溯源至SI 基本單位［4-5］。純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確性、均勻性、穩(wěn)定性等主要特征，純度測(cè)量的過(guò)程也是給標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的過(guò)程。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值通常有絕對(duì)權(quán)威方法定值、不同原理方法定值、實(shí)驗(yàn)室合作定值、比對(duì)法定值等幾種方式，針對(duì)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，目前常見(jiàn)并廣泛應(yīng)用的定值方法主要有質(zhì)量平衡法、示差量熱掃描法、定量核磁法等［6-8］。質(zhì)量平衡法需要充分考察有機(jī)雜質(zhì)、水分、無(wú)機(jī)雜質(zhì)以及揮發(fā)性有機(jī)雜質(zhì)對(duì)主成分含量的影響，它是一種間接測(cè)定主成分純度的方法，涉及色譜、卡爾費(fèi)休滴定、頂空氣相色譜、ICP-MS／OES、離子色譜、熱重分析等多種儀器測(cè)定［9］。近年來(lái)，隨著核磁技術(shù)的發(fā)展，核磁定量技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，該方法快捷、簡(jiǎn)便，可通過(guò)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，將測(cè)量結(jié)果直接溯源至SI 單位，但是內(nèi)標(biāo)物的選取至關(guān)重要，首先必須是高純度有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其次與待測(cè)物在氘代試劑中不發(fā)生反應(yīng)，第三用于定量的核磁譜峰互不干擾［10-11］。示差量熱掃描法是基于Vant Hoff方程的純度測(cè)定方法，但是不適用于熱穩(wěn)定性差的化合物，且易受雜質(zhì)及樣品本身的物理化學(xué)性質(zhì)影響，具有一定的局限性［12］。

筆者針對(duì)加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺失的現(xiàn)狀，選擇高純度純品原料，根據(jù)JJF 1006-1994 《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求》［13］，采用兩種不同原理的方法對(duì)加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，基于卡爾費(fèi)休法和熱重分析法準(zhǔn)確測(cè)量了影響主成分純度的水分含量?？疾炝思犹嫔承羌兌葮?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性，并評(píng)估了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：2695 型，美國(guó)Waters 公司。

核磁共振儀器：Avance III 型，德國(guó)Bruker 公司。

卡爾費(fèi)休水分滴定儀：TOLEDO DL39 型，瑞士Mettler 公司。

熱重分析儀：TGA-50 型，日本Shimadzu 公司。

分析天平：XS105 型，瑞士Mettler 公司。

氣相色譜儀-氫火焰離子化檢測(cè)器：Agilent 6890 型，美國(guó)Agilent 公司。

加替沙星純品原料：加拿大TRC 公司。

苯甲酸基準(zhǔn)物質(zhì)：編號(hào)為GBW 06117，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.993%±0.009%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

氘代乙酸：純度99%，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

乙腈、甲醇有機(jī)溶劑：色譜純，德國(guó)Merck 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物選擇

加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料來(lái)自于市售純品，產(chǎn)品包裝規(guī)格為100 g。為了進(jìn)一步確認(rèn)原料的準(zhǔn)確可靠，分別采用紅外光譜法、質(zhì)譜法等手段對(duì)購(gòu)買的原料進(jìn)行了主成分定性分析。將經(jīng)過(guò)主成分定性分析且充分混合好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料，分裝至5 mL潔凈樣品瓶中，置于潔凈干燥器內(nèi)干燥24 h 后，加蓋密封。每個(gè)包裝量為100 mg，共400 個(gè)包裝單元。置于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 定值方法

(1)質(zhì)量平衡法［14］中主要儀器工作條件。

高效液相色譜儀：色譜柱為Agilent Eclipse Plus SB-Aq 型(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-水(0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液-3%磷酸，用三乙胺調(diào)節(jié)至pH 3.3)(體積比為15∶85)；流量：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm。

卡爾費(fèi)休法測(cè)定水分：采用水分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)儀器后，稱取5～7 mg 待測(cè)樣品，待滴定結(jié)束，記錄水分含量。

TGA 法水分測(cè)定升溫程序：先以5℃／min 勻速升溫至105℃，保持5 min，之后繼續(xù)以5℃／min升溫至恒重，記錄失重質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(2)核磁共振定量法。

選擇苯甲酸基準(zhǔn)物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)，將準(zhǔn)確稱量的加替沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與苯甲酸內(nèi)標(biāo)物共溶解于1 mL 氘代乙酸溶劑中，待充分溶解后，移取至石英核磁管中，參照文獻(xiàn)［15］測(cè)定加替沙星的純度。

1.2.3 均勻性檢驗(yàn)

隨機(jī)抽取15 個(gè)包裝單元，每個(gè)單元取3 個(gè)子樣，采用液相色譜法測(cè)定主成分，同時(shí)采用卡爾費(fèi)休法測(cè)定15 個(gè)抽取單元中水分含量，主成分扣除水分后進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。測(cè)量的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，通過(guò)比較F檢驗(yàn)值與F臨界值的大小來(lái)判定。

1.2.4 穩(wěn)定性考察

長(zhǎng)期穩(wěn)定性：在分裝儲(chǔ)藏后的0、1、3、6 個(gè)月抽樣測(cè)定。

短期穩(wěn)定性：模擬運(yùn)輸過(guò)程溫度變化，分別在20、40、60℃條件下監(jiān)測(cè)9 天的穩(wěn)定性。每個(gè)溫度時(shí)間條件下隨機(jī)抽取2 個(gè)包裝，采用液相色譜法測(cè)定主成分，平行測(cè)定3 次，同時(shí)測(cè)定每個(gè)單元的水分含量，主成分扣除水分后進(jìn)行穩(wěn)定性考察，采用趨勢(shì)分析法評(píng)價(jià)穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 定值研究

采用質(zhì)量平衡法對(duì)經(jīng)過(guò)定性確認(rèn)分析并分裝好的加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物進(jìn)行純度定值。基于前期氟喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究基礎(chǔ)，認(rèn)為SB-Aq 色譜柱更適用于此類藥物純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中雜質(zhì)的色譜響應(yīng)與分離，因此選擇0.3%磷酸溶液與磷酸二氫鉀-磷酸(三乙胺，pH 3.3)的緩沖溶液作為水相，乙腈作為有機(jī)相，并進(jìn)一步優(yōu)化了流動(dòng)相比例，加替沙星及其雜質(zhì)的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。如圖1 所示，當(dāng)有機(jī)相與水相比例為15∶85 時(shí)，主峰對(duì)稱性好，圖1 中1、2、3、4 均為雜質(zhì)峰，由圖1 可以看出雜質(zhì)峰充分響應(yīng)，并且主成分及4 個(gè)雜質(zhì)峰能夠很好的實(shí)現(xiàn)基線分離，滿足面積歸一化定值要求。采用上述條件，對(duì)隨機(jī)抽取的7 個(gè)單元，測(cè)量了加替沙星主成分及結(jié)構(gòu)相似有機(jī)雜質(zhì)的含量。

圖1 加替沙星及其雜質(zhì)的高效液相色譜圖

然而，對(duì)于藥物純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，水分含量是影響純度的關(guān)鍵因素，由于加替沙星具有一定的吸濕性，水分含量的控制與準(zhǔn)確測(cè)定是該純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的重要環(huán)節(jié)。因此本研究重點(diǎn)采用熱重分析(TGA)和卡爾費(fèi)休兩種不同原理的方法，對(duì)封裝好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物中水分含量進(jìn)行了較為充分的分析與測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用TGA 法測(cè)定水分，結(jié)果如圖2所示，整個(gè)升溫過(guò)程失重質(zhì)量6.237%，由圖2 中升溫曲線的平臺(tái)部分可以看出，失重基本發(fā)生在保持105℃恒溫5 min 階段之前，我們推測(cè)失重主要是以水分失去造成的。同時(shí)采用了卡爾費(fèi)休法準(zhǔn)確測(cè)定了加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分含量，兩種方法水分測(cè)定結(jié)果基本一致，結(jié)果表明TGA 法也可用于加替沙星中水分準(zhǔn)確測(cè)定，實(shí)驗(yàn)采用卡爾費(fèi)休法測(cè)定值為水分含量最終結(jié)果。采用頂空氣相色譜和ICP-MS 分別測(cè)量了有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)，結(jié)果顯示其總含量小于0.014%，對(duì)純度定值結(jié)果影響可忽略，不作詳細(xì)討論。定值結(jié)果如表1 所示，質(zhì)量平衡法測(cè)定的加替沙星純度值為93.23%。

圖2 加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)TGA 曲線圖

表1 加替沙星的質(zhì)量平衡法定值結(jié)果 %

綜上所述，加替沙星純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)定值結(jié)果為93.1%。

圖3 苯甲酸與加替沙星樣品的1H-NMR 譜圖

表2 加替沙星的定量核磁法(1H-NMR)定值結(jié)果 %

2.2 均勻性檢驗(yàn)

均勻性檢驗(yàn)采用高效液相色譜峰面積歸一化法，針對(duì)機(jī)抽取的樣品從1 到15 編號(hào)，潔凈干燥環(huán)境下平衡至室溫后，每個(gè)單元取3 個(gè)子樣，分別配制成質(zhì)量濃度為100 mg／L 的加替沙星甲醇溶液，上機(jī)測(cè)定。同時(shí)采用卡爾費(fèi)休法測(cè)定15 個(gè)抽取單元中水分含量。定值結(jié)果采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)［16］,加替沙星均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 %

2.3 穩(wěn)定性考察

根據(jù)JJF 1343-2012 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》的要求，重點(diǎn)考察了長(zhǎng)期保存和短期運(yùn)輸條件下，環(huán)境溫度對(duì)加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的影響。由于加替沙星具有較強(qiáng)的吸濕性，因此在穩(wěn)定性考察時(shí)也充分考慮了其中水分含量的變化及其對(duì)特性量值的影響。按照先密后疏的原則，長(zhǎng)期穩(wěn)定性分別在第0、1、3、6 個(gè)月進(jìn)行穩(wěn)定性考察。每次隨機(jī)抽取2 個(gè)包裝，采用重量-容量法配制溶液，高效液相色譜法測(cè)定主成分含量，每個(gè)單元平行測(cè)定三次，同時(shí)利用卡爾費(fèi)休法測(cè)定每個(gè)包裝的水分含量。圖4 和圖5 分別為加替沙星純度與包裝單元內(nèi)水分含量半年的監(jiān)測(cè)結(jié)果。以監(jiān)測(cè)時(shí)間和測(cè)定結(jié)果擬合直線，采用趨勢(shì)分析法［16］進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖4 加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中加替沙星6 個(gè)月穩(wěn)定性趨勢(shì)圖

圖5 加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分含量的6 個(gè)月穩(wěn)定性趨勢(shì)圖

表4 加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)結(jié)果 %

由 表4 計(jì) 算 得，b1=0.023 1，b0=93.32，s2=0.009 322 70，s(b1)=0.021 069 83，t0.95，n-2=4.3，s(b1)t0.95，n-2=0.090 6。結(jié)果：|b1|＜t0.95，n-2s(b1)，無(wú)顯著性差異。說(shuō)明6 個(gè)月內(nèi)加替沙星純度及其包裝單元內(nèi)的水分含量沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)，穩(wěn)定性檢驗(yàn)合格。

針對(duì)短期穩(wěn)定性考察，為了模擬運(yùn)輸條件，將隨機(jī)抽取的樣品分別置于20、40、60℃的恒溫箱中，分別在第1、3、5、7、9 天測(cè)定。測(cè)定方法與長(zhǎng)期穩(wěn)定性相同，結(jié)果見(jiàn)表5～表7。

表5 20℃下加替沙星固體純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表5 數(shù)據(jù)計(jì)算得：b1=-0.037 7，b0=93.516，s2=0.010 629 8，s(b1)=0.016 301 7。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.051 839 478，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，說(shuō)明20℃下短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)合格。

表6 40℃下加替沙星固體純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表6 數(shù)據(jù)計(jì)算得：b1=-0.012 1，b0=94.17，s2=0.064 093 4，s(b1)=0.040 029 2。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.127 292 8，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，說(shuō)明40℃下短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)合格。

表7 60℃下加替沙星固體純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表7 數(shù)據(jù)計(jì)算得：b1=0.085 9，b0=93.773，s2=0.072 649 5，s(b1)=0.016 301 7。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.135 523 2，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，說(shuō)明60℃下短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)合格。

圖6～圖8 為不同溫度模擬下9 天時(shí)間范圍內(nèi)加替沙星純度值變化。圖6 和圖7 中替沙星純度值無(wú)明顯的變化趨勢(shì)，圖8 顯示加替沙星質(zhì)量分?jǐn)?shù)有升高的趨勢(shì)。圖9 為不同溫度條件下水分變化趨勢(shì)，由圖9 可以看出，40、60℃時(shí)水分含量隨時(shí)間變化有顯著的降低，推測(cè)是由于在較高的溫度條件下，加替沙星固體粉末中吸附水揮發(fā)所致，進(jìn)一步揭示了圖8 中加替沙星純度升高的原因。

圖6 20 ℃時(shí)加替沙星的短期穩(wěn)定性趨勢(shì)圖

圖7 40 ℃時(shí)加替沙星的短期穩(wěn)定性趨勢(shì)圖

圖8 60 ℃時(shí)加替沙星的短期穩(wěn)定性趨勢(shì)圖

圖9 水分含量的短期穩(wěn)定性趨勢(shì)圖

綜上所述，加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6 個(gè)月長(zhǎng)期穩(wěn)性定良好。短期穩(wěn)定性在40、60℃條件下，由于水分變化導(dǎo)致加替沙星質(zhì)量分?jǐn)?shù)有增大的趨勢(shì)，為了保證量值的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)確保將運(yùn)輸溫度控制在20℃以下。

2.4 不確定度評(píng)定

基于前期研究報(bào)道的不確定度評(píng)估與計(jì)算方法［14］，系統(tǒng)分析與評(píng)估了加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過(guò)程中的不確定度，結(jié)果見(jiàn)表8。加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度值為93.1%，擴(kuò)展不確定度為0.6%(k=2)

表8 加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評(píng)估結(jié)果 %

3 結(jié)語(yǔ)

研制了加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果準(zhǔn)確可靠、一致性好，水分含量穩(wěn)定，特性量值的均勻性良好，6 個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性可靠。該純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)加替沙星純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)空白，保證了加替沙星相關(guān)檢測(cè)結(jié)果的計(jì)量溯源性。