駱 琴， 鄧清月， 唐 森， 張 鵬

（廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西來賓 546119）

脈孢菌屬（Neurospora）真菌是一類腐生菌，有較強(qiáng)的抗逆性，廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境中，該屬真菌易培養(yǎng)且菌體無毒（Gmoser等，2018）。脈孢菌繁殖能力較強(qiáng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，可單獨(dú)或聯(lián)合其他菌種發(fā)酵多種農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)類胡蘿卜素及復(fù)合酶制劑，通過發(fā)酵也可將農(nóng)副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為高營(yíng)養(yǎng)的功能性飼料。

王倩男等（2017）利用好食脈孢菌（N.sitophila）發(fā)酵醋糟生產(chǎn)類胡蘿卜素，色素含量117.68 μg/g，使廢棄的醋糟成為功能性飼料。經(jīng)脈孢菌高溫發(fā)酵后，豆粕中胰蛋白酶抑制因子減少，粗蛋白質(zhì)及酸溶蛋白含量升高，提高了其飼用價(jià)值（鄭婷婷等，2015）。王曉杰等（2008）用好食脈孢菌固態(tài)發(fā)酵玉米酒糟，其蛋白質(zhì)組分升高，同時(shí)溶解性提高，使其成為一種新型飼料。孫鐵男等（2019）用好食脈孢菌固態(tài)發(fā)酵麥麩生產(chǎn)類胡羅卜素，經(jīng)工藝優(yōu)化后產(chǎn)量為147.38 μg/g，有效提高了麩皮的利用率。 吳邦國(guó)（2018）用粗糙脈孢菌（N.crassa）固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理過的玉米秸稈，能有效提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善其適口性，克服玉米秸稈難消化、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低的問題。賈金如（2017）用粗糙脈孢菌聯(lián)合（Candida utilis和 Phanerochaete chrysosporium）固態(tài)發(fā)酵稻草，降解了其木質(zhì)纖維素，同時(shí)提高了蛋白質(zhì)的含量，改善了蛋白類飼料的品質(zhì)。

本試驗(yàn)從發(fā)霉變質(zhì)的甘蔗渣中分離純化出一株色素產(chǎn)生菌，編號(hào)為NC2636。通過觀察其培養(yǎng)特征和顯微特征，以及采用構(gòu)建基于ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹的方法確定菌株NC2636的分類地位。并以菌株NC2636的分生孢子懸液為菌種固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣，采用分光光度法對(duì)從發(fā)酵物中提取的色素進(jìn)行定性定量分析。本研究旨在為菌株NC2636在甘蔗渣功能性飼料化上的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甘蔗渣：由廣西來賓湘桂糖業(yè)有限責(zé)任公司提供；馬鈴薯：市售；無水葡萄糖、技術(shù)瓊脂粉、丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇、異丙醇、β-巰基乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備 中草藥粉碎機(jī) （FW-135），天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-GF101-3-S），上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162），太倉(cāng)市科教器材廠；恒溫?fù)u床（TH2-C），太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；電子分析天平（FA-2004B），上海越平科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水槽（DK-8D），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；立式壓力滅菌鍋（TYAIB 024/10），寧波久興醫(yī)療器械有限公司；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1D），江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-2600），島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；超聲波清洗機(jī)（KQ-300DE），昆山市超聲儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（TD5A-WS），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；冷凍離心機(jī)（HC-2518R），安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PCR儀（2720 thermal cycler），美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；電泳槽（DYCP-31DN），北京六一儀器廠；穩(wěn)壓電泳儀（DYY-5），北京六一儀器廠；凝膠成像儀（FR980），上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，無水葡萄糖20 g，技術(shù)瓊脂粉18 g，水 1 L，pH 自然，121℃高壓滅菌 20 min。

1.4 菌株分離 采用組織分離的方法，在無菌操作條件下，用接種針挑取霉變的甘蔗渣表面黃色顆粒物質(zhì)劃線于PDA平板培養(yǎng)基，在28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，反復(fù)挑取邊緣菌絲劃線于新的PDA平板，獲得一株真菌純培養(yǎng)物，編號(hào)為NC2636，轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基4℃保存。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 形態(tài)特征鑒定 形態(tài)學(xué)分類鑒定以 《真菌鑒定手冊(cè)》為依據(jù)（魏景超，1797）。將純培養(yǎng)菌株NC2636接種于PDA平板，目測(cè)觀察菌落的形態(tài)是否符合脈孢菌屬的基本形態(tài)特征。采用水浸片法制片，挑取不同生長(zhǎng)階段的菌絲用乳酸石碳酸棉蘭染液染色，于雙目顯微鏡下觀察菌絲顯微特征并照相。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定

1.5.2.1 ITS序列測(cè)定 使用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：SK8259]提取菌株NC2636的基因組DNA。基因擴(kuò)增以NC2636的基因組DNA為模版，ITS序列擴(kuò)增引物為真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和 2 通用引物：ITS1 （5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴(kuò)增片段序列長(zhǎng)度為600 bp左右。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：模板（菌株 NC2636基因組 DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）1 μL，Taq Plus DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，引物 ITS1、ITS4（10 μmol/L）各 0.5 μL，加雙蒸 H2O 至 25 μL。 PCR 循環(huán)條件：預(yù)變性（94 ℃，4 min）、變性（94 ℃，45 s）、退火（55 ℃，45 s）、延伸（72 ℃，1 min），共 30 個(gè)循環(huán)；修復(fù)延伸（72 ℃，10 min）；終止反應(yīng)（4 ℃，4 h）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離檢測(cè)。DNA目的條帶經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程 （上海）股份有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：SK8131]純化回收后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5.2.2 序列分析 將菌株NC2636的ITS序列提交至NCBI的Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)。將所得序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性分析。從Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)下載同屬以及相近科屬物種的ITS序列，使用MAFFT 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，以Apodus deciduus的ITS序列為外類群，使用MEGA 7.0軟件采用NJ（Neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株NC2636的固態(tài)發(fā)酵 用接種環(huán)挑取28℃光照條件下培養(yǎng)18 h的PDA平板培養(yǎng)基上的菌絲轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃光照條件下培養(yǎng)數(shù)日直至PDA斜面表面產(chǎn)生橙色的分生孢子。用無菌生理鹽水沖洗斜面表面的孢子，倒入裝有玻璃珠的廣口錐形瓶中，搖床振蕩3 h，計(jì)數(shù)后配制成濃度為1.5×107個(gè)/mL孢子懸液作為接種液。將甘蔗渣置于45℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，粉碎，過20目標(biāo)準(zhǔn)篩備用。取5 g處理好的甘蔗渣置于250 mL廣口錐形瓶中，按液料比4：1加入45℃無菌水20 mL，封口，浸泡4 h后121℃高壓濕熱滅菌30 min。在無菌操作條件下，向冷卻的甘蔗渣培養(yǎng)基內(nèi)接入1 mL孢子懸液，混勻，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，28℃光照條件下靜置培養(yǎng)6 d。

1.7 類胡蘿卜素的提取與測(cè)定 參照孫軼男等（2019）方法，略作改動(dòng)。取烘干后的發(fā)酵產(chǎn)物1.0 g置于研缽中加入1.0 g石英砂，充分研磨后，加入 10 mL 丙酮-乙酸乙酯混合溶液（2：3，V：V），置于超聲波清洗機(jī)中超聲處理15 min（300 W，25℃）后，室溫下避光浸提2 h后取出，離心機(jī)5500 r/min，離心10 min，收集上清液，即得類胡蘿卜素浸提液。用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400～700 nm內(nèi)掃描類胡蘿卜素浸提液，確定最大吸收波長(zhǎng)，適當(dāng)稀釋提取液后測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度，按以下公式計(jì)算類胡蘿卜素含量（鄧永平等，2018；李靜等，2017）：

式中：Aλmax為色素最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；N為測(cè)定試樣的稀釋倍數(shù)；V為提取色素有機(jī)溶劑體積，mL；M為發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量，g；0.16為類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選菌株的鑒定

2.1.1 培養(yǎng)和形態(tài)特征 菌株在PDA平板上，迅速生長(zhǎng)，匍匐菌絲白色，疏松，有樹狀分支，沒有典型菌落形成；培養(yǎng)24 h之后肉眼可見菌絲體組織呈絮狀，可見氣生菌絲，均勻生長(zhǎng)，呈白色絨毛狀；培養(yǎng)48 h之后，菌絲體粗壯而致密，淡黃色，與培養(yǎng)基結(jié)合較牢固，菌絲體組織表面干燥，上層出現(xiàn)成堆黃色粉末狀顆粒，有一股霉味。

菌株NC2636菌絲經(jīng)乳酸石碳酸棉蘭染色后，菌絲組織成藍(lán)色。菌絲組織稀疏，呈絲狀，有分枝，為有隔菌絲；氣生菌絲頂端可觀察到分生孢子鏈；分生孢子為球形、卵圓形至橢圓形。

綜上所述，根據(jù)菌株NC2636的培養(yǎng)特征和顯微特征，查《真菌鑒定手冊(cè)》可知，該株真菌與脈孢菌屬（Neurospora）真菌的形態(tài)特征描述較為符合 （魏景超，1797），故通過形態(tài)特征鑒定菌株NC2636應(yīng)為一株脈孢菌（Neurospora sp.）。

2.1.2 菌株NC2636的ITS序列分析 為了進(jìn)一步明確菌株NC2636的分類地位，提取菌株NC2636基因組DNA，以真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2通用引物進(jìn)行ITS序列PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，凝膠成像結(jié)果見圖1。擴(kuò)增得到基因片段凝膠電泳條帶單一、明亮，與Marker條帶比較發(fā)現(xiàn)，目的基因片段大小為500～600 bp，將目的條帶用試劑盒回收后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，菌株NC2636的ITS序列大小為554 bp，兩者相符。

圖1 菌株NC2636的ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

將菌株NC2636的ITS序列測(cè)序結(jié)果輸入Genbank進(jìn)行BLAST比對(duì)，與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示NC2636的ITS序列與脈孢菌屬（Neurospora）的多種真菌具有很高的同源性。選取脈孢菌屬內(nèi)與菌株NC2636同源性較高的8株真菌，以及與脈孢菌屬科屬親緣關(guān)系較近的2株真菌，以Apodus deciduus的ITS序列為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，菌株NC2636與Neurospora crassa（KR399979）在同一分支上，同源性達(dá)到了100%，結(jié)合其培養(yǎng)特征和顯微特征，故將菌株NC2636鑒定為一株粗糙脈孢菌（Neurospora crassa），菌株NC2636的ITS序列從Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的登錄號(hào)為MT821452。

圖2 基于ITS序列采用鄰接法構(gòu)建的菌株NC2636系統(tǒng)發(fā)育樹（括號(hào)內(nèi)為序列登錄號(hào)）

2.2 菌株NC2636的色素特征及含量測(cè)定 在可見光區(qū)400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描檢測(cè)提取的色素樣品，由圖3可知，最大吸收峰的波長(zhǎng)為469 nm，在其兩側(cè)444 nm和501 nm處有兩個(gè)明顯的肩峰，符合類胡蘿卜素的“三手指型”特征性吸收曲線（肖亦農(nóng)等，2013；羅金亮等，2013），依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道類胡蘿卜素化合物最大吸收波長(zhǎng)及雙肩峰吸收波長(zhǎng)特征可知，番茄紅素可能為菌株NC2636所產(chǎn)的類胡蘿卜素的主要成分（王海濱，2004）。在最大吸收波長(zhǎng)469 nm下，測(cè)定吸光度，由類胡蘿卜素含量計(jì)算公式可以得出，發(fā)酵物類胡蘿卜素含量為95.63 μg/g。

圖3 色素的可見光區(qū)掃描圖譜

3 討論

采用酵母、細(xì)菌、放線菌等微生物發(fā)酵甘蔗渣，可以使蔗渣中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解成能被動(dòng)物體直接利用的糖類物質(zhì)，同時(shí)在發(fā)酵過程中由微生物自身代謝生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、氨基酸、還原糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能提高甘蔗渣的適口性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使其成為一種優(yōu)質(zhì)飼料 （胡詠梅等，2006）。粗糙脈孢菌（N.crassa）具有完整的木質(zhì)纖維素降解酶系，可作為天然的木質(zhì)纖維素快速降解菌（林良才等，2014），已被用于發(fā)酵稻草、玉米秸稈等農(nóng)副產(chǎn)品，使它們成為營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的功能性飼料（吳邦國(guó)，2018；賈金如，2017）。本研究從霉變的甘蔗渣中分離得到一株粗糙脈孢菌，通過實(shí)驗(yàn)證明該菌株能在單一營(yíng)養(yǎng)源甘蔗渣上生長(zhǎng)并產(chǎn)生類胡蘿卜素色素，其主要成分可能為番茄紅素，但產(chǎn)量較低，因此以甘蔗渣為主要營(yíng)養(yǎng)源通過發(fā)酵生產(chǎn)類胡羅素卜素為目的固態(tài)發(fā)酵工藝有待于進(jìn)一步優(yōu)化（闕發(fā)秀等，2019；李靜等，2017；李陳陳等，2017）。綜上所述，粗糙脈孢菌有潛力作為候選菌種通過微生物發(fā)酵方法來解決甘蔗渣飼料化的難題。

4 結(jié)論

本研究通過觀察分離于霉變甘蔗渣中的產(chǎn)色素菌株NC2636的培養(yǎng)特征和顯微特征，并結(jié)合分子生物學(xué)方法將其鑒定為一株粗糙脈孢菌（N.crassa）。通過分光光度法確定菌株NC2636固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣所產(chǎn)的色素為類胡蘿卜素，最大吸收波長(zhǎng)為469 nm，推測(cè)色素主要成分可能為番茄紅素，28℃固態(tài)發(fā)酵6 d，色素含量為95.63 μg/g。因此，利用菌株NC2636固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣既可能實(shí)現(xiàn)甘蔗渣的功能性飼料化，也能獲得天然的類胡蘿卜素，同時(shí)為甘蔗渣的資源化利用提供一種思路。