邢 杰，趙繼開，丁聞潔，韓昱晨

PD-1/PD-L1通路已經(jīng)在多種腫瘤中進行了廣泛深入的研究，如黑色素瘤、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等，并且PD-1/PD-L1表達可能與惡性腫瘤的臨床病理特征或不良預后相關(guān)[1-3]。近年來國內(nèi)外關(guān)于胸腺瘤PD-1/PD-L1的研究較少，但均表明PD-L1表達與胸腺腫瘤(包括胸腺瘤和胸腺癌)的組織學類型、Masaoka分期以及療效相關(guān)，并且能夠提示腫瘤的惡性程度及預后[4-7]。常規(guī)PD-L1檢測方法為免疫組化，但PD-L1在正常的胸腺上皮細胞及淋巴細胞中也有表達[8-9]，可能使得免疫組化染色結(jié)果判讀困難，為解決這一問題，作者嘗試采用p63+PD-L1免疫組化雙重染色法對胸腺腫瘤進行染色，由于p63廣泛表達于上皮源性腫瘤細胞胞核，p63+PD-L1免疫組化雙重染色法能夠更加清楚的判斷胸腺源性上皮細胞的PD-L1陽性率。

1 材料與方法

1.1 材料收集上海市胸科醫(yī)院病理科存檔的胸腺腫瘤手術(shù)切除樣本60例，其中B1、B2及B3型胸腺瘤各15例，胸腺癌15例，每例胸腺腫瘤連續(xù)切片3張，分別用于HE染色、PD-L1免疫組化染色、p63+PD-L1免疫組化雙重染色。

1.2 染色方法標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，免疫組化染色采用Multimer法，染色平臺為Dako Link 48全自動免疫組化染色平臺，一抗PD-L1(22C3，1 ∶50，Dako公司)、p63(1 ∶300，上海長島生物公司)，其他試劑均為Dako Autostainer Link48全自動免疫組化染色平臺專用試劑，購自安捷倫科技(上海)公司。

1.3 結(jié)果判斷將染色后的切片交由科內(nèi)經(jīng)過PD-L1判讀專業(yè)訓練的3名醫(yī)師閱片，并根據(jù)判讀的難易程度進行評分，評分內(nèi)容包括染色效果、特異性著色部位及非特異性著色部位判斷，然后進行綜合評分，易于判讀為Ⅰ級，判讀難度一般為Ⅱ級，難以判讀為Ⅲ級，3名醫(yī)師分別就相應的切片進行分級，每個級別取3名醫(yī)師打分的平均值。將判讀結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，使用SPSS 19.0軟件進行分析，分析方法為χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

PD-L1在胸腺腫瘤細胞中的表達評分結(jié)果顯示(表1，圖1～4)，B1型、B2型、B3型胸腺瘤PD-L1免疫組化染色與PD-L1+p63免疫組化雙重染色相比，在判讀難易程度上差異有顯著性(P值分別為<0.001、0.001、0.033)；胸腺癌PD-L1免疫組化染色與PD-L1+p63免疫組化雙重染色評分結(jié)果相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.583)。

表1 兩種免疫組化染色結(jié)果判讀難易程度對比

①A①B①C②A②B②C③A③B③C④A④B④C

3 討論

胸腺屬于人體中樞免疫器官，是T細胞分化、發(fā)育和成熟的場所，胸腺瘤主要起源于胸腺上皮及淋巴細胞，PD-L1不僅在胸腺上皮源性腫瘤細胞中表達，在正常胸腺上皮細胞以及淋巴細胞中也有部分表達，這就給PD-L1在腫瘤性上皮細胞中表達的免疫組化染色的結(jié)果判讀帶來了很大挑戰(zhàn)。p63是p53抑癌基因家族的成員，在胚胎外胚層的發(fā)育和上皮組織的發(fā)育、分化以及維持細胞形態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用，p63蛋白廣泛表達于上皮組織細胞核。將p63和PD-L1兩種抗體結(jié)合起來，使用免疫組化雙重染色法，使得胸腺上皮來源的腫瘤細胞胞核呈p63免疫組化染色的紅色，細胞膜呈現(xiàn)PD-L1免疫組化染色的棕色，而部分淋巴細胞僅在細胞膜上有PD-L1表達，細胞核無p63表達。借助p63+PD-L1雙重免疫組化染色，我們不僅能夠判斷PD-L1在胸腺腫瘤性上皮中的表達，也能夠在一定程度上反映出在胸腺中各種淋巴細胞PD-L1的表達狀態(tài)，為今后進一步分析胸腺組織中各種細胞成分PD-L1表達狀況，與胸腺腫瘤臨床病理特點及免疫治療的相關(guān)性，提供更多的數(shù)據(jù)支持。

綜上，PD-L1+p63免疫組化雙重染色能夠很好的幫助病理醫(yī)師在判讀PD-L1陽性率的過程中，準確地識別非特異性著色。